玉米初級三體的鑒定及傳遞率研究

秦 燕 余水情 趙永康 楊克誠 唐祈林,*

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，四川 成都 611130；2 成都市農(nóng)林科學(xué)院作物研究所，四川 成都 611130；3 宜賓市屏山縣人才交流開發(fā)服務(wù)中心，四川 宜賓 645350)

初級三體的超數(shù)染色體是一個(gè)正常染色體，配子的染色體數(shù)為n，其初級三體就有n種類型。初級三體材料是進(jìn)行基因定位和連鎖圖譜構(gòu)建的基礎(chǔ)材料，利用三體分析可以將基因、分子標(biāo)記和連鎖群定位到特定染色體上[1]。目前已在玉米[2]、水稻[3]、番茄[4]、曼陀羅[5]、大豆[6]、谷子[7]、菜薹[8]、棉花[9]、結(jié)球甘藍(lán)[10]、普通蕎麥[11]等多種作物中選育出成套或部分三體，并利用三體遺傳分析將水稻香氣基因[12]、水稻光敏核不育基因[13]、大豆rps-1k基因[14]、谷子雄性核不育基因[15]、谷子胚乳糯性基因[16]、谷子矮桿基因[17]、大白菜雄性核不育基因[18]定位到了相應(yīng)的染色體上。關(guān)于三體的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定，Blackslee等[5]首次從曼陀羅中分離出自然發(fā)生的初級三體，并根據(jù)曼陀羅的蒴果形態(tài)對三體進(jìn)行了分類。Mcclintock[2]研究表明，玉米的10個(gè)初級三體植株雖然較其對應(yīng)的二倍體植株弱小，但三體與二倍體間差異較小；張成合等[10]對合成的一整套結(jié)球甘藍(lán)三體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定，結(jié)果表明初級三體在株高、株型、葉形、花蕾大小、開花期等方面表現(xiàn)出一定的差異。申書興等[19]和張成合等[20]分別對大白菜和結(jié)球甘藍(lán)的初級三體n+1配子傳遞率進(jìn)行研究，表明多數(shù)n+1配子可以通過雌雄配子傳遞，且不同植物和不同染色體的傳遞率不同。目前雖已有關(guān)于玉米初級三體的報(bào)道，但不同來源的初級三體形態(tài)特征及傳遞率的差異較大，而關(guān)于玉米初級三體細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)鑒定及傳遞率的研究尚鮮見報(bào)道。本研究以引進(jìn)的玉米初級三體為試驗(yàn)材料，對其初級三體進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定及傳遞率研究，以期為玉米初級三體后期應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為從美國引進(jìn)的一套玉米初級三體Trisomic1～Trisomic10(T1～T10)，三體染色體數(shù)目為2n+1=21,二倍體染色體數(shù)目為2n=20，各三體對應(yīng)的二倍體簡寫為T1(2n)～T10(2n)。每個(gè)三體材料含有1個(gè)標(biāo)記基因，具體信息詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 染色體計(jì)數(shù)方法 2016年8月秋將引進(jìn)的玉米初級三體在云南元江進(jìn)行自交繁種，2017年3月將繁殖的三體分批發(fā)芽，單株編號取根，采用根尖染色體計(jì)數(shù)法[21-22]鑒定染色體數(shù)目。為保證種子發(fā)芽率和染色體數(shù)目鑒定的準(zhǔn)確性，將種子浸泡6 h，在發(fā)芽盒中鋪細(xì)沙放入培養(yǎng)箱中27℃催芽，待根長至1～1.5 cm時(shí)，取根尖，用飽和α-溴萘溶液預(yù)處理3 h，再用新鮮固定液[甲醇∶冰乙酸=3∶1(v/v)]固定2～3 h。用2%纖維素酶與1%果膠酶混合(體積比為1∶1)于37℃酶解2.5～3 h，滴加適量改良品紅染液、壓片，在OLYMPUS BX41相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)下鑒定染色體數(shù)目。

1.2.2 核型分析方法 核型分析采用李懋學(xué)等[23]確定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，染色體的相對長度、臂比及類型按Levan等[24]的命名系統(tǒng)，染色體相對長度系數(shù)采用Kuo等[25]的方法，核型分類參照Stebbins[26]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。用Image-ProPlus5.51(Media Cybernetics, Inc.)專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行染色體長度的測量及染色體核型的配對分析。分別選取5個(gè)典型的中期細(xì)胞進(jìn)行測量，取平均值制成染色體參數(shù)表，并選擇具有代表性的分裂相排成核型圖。

1.2.3 形態(tài)調(diào)查方法 鑒定染色體數(shù)后，對10個(gè)材料中的三體(2n+1)與二倍體(2n)分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)調(diào)查，包括株高、穗位高、雄穗特性(分枝數(shù)、穗長)，雌穗特性(粒色、軸色、穗長、穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒重)，葉片特性(葉片總數(shù)、穗三葉葉長、葉寬)，花粉育性(花粉可染率)，花粉育性采用碘染法[27]進(jìn)行鑒定。

1.2.4 傳遞率及結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì) 10個(gè)玉米初級三體染色體數(shù)目鑒定后，2017年配置初級三體自交及其與二倍體的正反交組合：T(2n+1)×T(2n+1)、T(2n+1)×T(2n)、T(2n)×T(2n+1)。2018年統(tǒng)計(jì)所得組合的結(jié)實(shí)數(shù)并將每個(gè)組合的籽粒逐一進(jìn)行染色數(shù)目鑒定，按照公式計(jì)算結(jié)實(shí)率和額外染色體的傳遞率：

結(jié)實(shí)率=結(jié)實(shí)的籽粒數(shù)/(行數(shù)×行粒數(shù))×100%

(1)

傳遞率=三體株數(shù)/鑒定總株數(shù)×100%

(2)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

10個(gè)玉米材料的三體與二倍體個(gè)體各調(diào)查5株，用 DPS 7.05 軟件對各材料內(nèi)三體及其對應(yīng)的二倍體間的差異顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)及核型

對10個(gè)玉米材料共計(jì)1 386個(gè)單株進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，由表2可知，10個(gè)玉米材料中均有染色體數(shù)為2n+1=21的三體出現(xiàn)，且不同材料出現(xiàn)三體頻率存在差異，10個(gè)材料三體出現(xiàn)頻率均值為15.6%，變幅為3.4%～25.0%。

由圖1可知，T1～T10增加的1條染色體的形態(tài)及染色體相對長度(relative chromosome length，RL)、臂比(arm ratio，AR)，著絲粒位置(position of centromere，PC)等參數(shù)均分別與其第1～第10對染色體接近，表明T1～T10是增加玉米第1～第10條染色體的玉米初級三體。由表3可知，其核型主要由中部著絲點(diǎn)染色體(metacentric chromosome，m)和近中部著絲點(diǎn)染色體(submetacentric chromosome，sm)組成，第6號染色體具有隨體，無B染色，體核型類型均屬于較對稱的B型。

表2 玉米單株的三體頻率Table 2 The frequency of trisomics in the single plant of maize

表3 玉米初級三體的核型參數(shù)Table 3 Karyotype parameters of maize primary triromics

圖1 玉米三體(T1～T10)核型圖與染色體形態(tài)Fig.1 Chromosome morphology and karyogram of maize trisomics (T1-T10)

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

由表4可知，在玉米植株形態(tài)上，除T3外，其余9個(gè)三體的株高、穗位高、葉片數(shù)、葉長、葉寬均低于對應(yīng)的二倍體植株，但僅T1的葉長與T1(2n)的差異達(dá)到極顯著，其余三體與其對應(yīng)二倍體間差異均不顯著；在雌穗性狀上，10個(gè)三體的雌穗長度、穗行數(shù)、行粒數(shù)及百粒重均小于對應(yīng)的二倍體，其中T6雌穗長度與T6(2n)差異達(dá)到極顯著；在雄穗性狀上，10個(gè)三體的雄穗長度、雄穗分枝數(shù)及花粉可染率(花粉育性)均小于對應(yīng)的二倍體，其中T3、T5、T6、T7、T9的花粉育性與其對應(yīng)的二倍體之間的差異均達(dá)到極顯著水平。綜上表明，除T3的植株較二倍體高外，其余三體的各性狀均較二倍體小，即附加1條染色體導(dǎo)致三體的生活力及生長勢大多弱于其二倍體；而各三體與二倍體間的差異也隨附加的染色體不同而存在差異，附加的染色體不同，對各性狀的影響也不同。t檢測結(jié)果表明，T1可通過測量葉片長度對三體植株進(jìn)行初步鑒定，T3、T5、T7、T9可通過花粉育性檢測對三體植株進(jìn)行初步鑒定，T6可通過雌穗長度、育性檢測對三體植株進(jìn)行初步鑒定。

對10個(gè)材料中易觀察的標(biāo)記基因表現(xiàn)型進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，T1和T1(2n)中均有黃銅色籽粒出現(xiàn)；T4和T4(2n)均有皺縮籽粒出現(xiàn)；T8和T8(2n)均出現(xiàn)幼苗黃白，成株后緩慢變綠現(xiàn)象；T9和T9(2n)均有糯質(zhì)玉米出現(xiàn)；T10和T10(2n)籽粒表面均有紫色斑塊出現(xiàn)。綜上，植株標(biāo)記基因的性狀表現(xiàn)與該植株是否為三體沒有必然聯(lián)系。

2.3 初級三體的傳遞率和結(jié)實(shí)率

由表5可知，10個(gè)自交材料的初級三體的結(jié)實(shí)率為41.3%～55.7%，平均結(jié)實(shí)率為50.3%，額外染色體傳遞率為3.4%～25.0%，平均傳遞率為15.6%，表明，初級三體自交能夠結(jié)實(shí)，額外染色體能夠通過自交傳遞。初級三體T1、T2、T4、T5、T6、T9作母本與二倍體雜交材料的結(jié)實(shí)率為52.7%～69.1%(T3、T7、T8、T10與二倍體正交組合未配置成功)，平均結(jié)實(shí)率為61.3%，額外染色體傳遞率為1.7%～21.7%，平均傳遞率為9.4%，表明初級三體與二倍體正交均能結(jié)實(shí)，且結(jié)實(shí)率高于自交組配方式，但額外染色體的傳遞率卻較自交組配方式下降了6.2個(gè)百分點(diǎn)；初級三體作父本與二倍體雜交材料結(jié)實(shí)率為72.9%～83.4%，平均結(jié)實(shí)率為78.4%，額外染色體傳遞率為0～6%，有4個(gè)三體的傳遞率為0，平均傳遞率為1.8%，表明初級三體作父本與二倍體雜交雖然結(jié)實(shí)率最高，但額外染色體傳遞率明顯下降，通過二倍體花粉傳遞超數(shù)染色體的概率較小。綜上，通過初級三體自交這種方式來進(jìn)行三體額外染色體的傳遞，能夠達(dá)到較高的額外染體傳遞率和適中的結(jié)實(shí)率。

表4 玉米三體與二倍體各性狀均值及t檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 The mean value and t test results of morphological characters between the trisomic and diploid of maize

注*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著。
Note:*and**indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.

注：()中為三體株數(shù)/鑒定總株數(shù)，“-”表示未收集到數(shù)據(jù)。
Note：()means number of 2n+1 plant/number of identified plant. ‘-’Indicates that no data had been collected。

3 討論

初級三體的鑒定是三體利用的基礎(chǔ)，鑒定初級三體主要通過形態(tài)學(xué)鑒定、有絲分裂染色體核型分析、粗線期核型分析、染色體分帶核型分析、分子標(biāo)記鑒定等方法[28]。研究表明，對初級三體染色體進(jìn)行識別鑒定最直接的方法是有絲分裂染色體核型分析，但由于最初獲得三體的作物是小染色體物種，利用有絲分裂較難區(qū)分，有研究者進(jìn)一步應(yīng)用粗線期的染色體進(jìn)行核型分析[29]，目前已有應(yīng)用分子標(biāo)記對水稻[30]、大白菜[31]等作物進(jìn)行初級三體鑒定的報(bào)道，但該分析方法鑒定結(jié)果易受環(huán)境因素干擾。本研究結(jié)果表明，部分玉米初級三體與其二倍體的一些性狀間差異達(dá)到顯著水平，從理論上說，可以通過差異顯著的性狀對三體進(jìn)行鑒定，但由于形態(tài)學(xué)性狀受環(huán)境、氣候等自然條件影響較大，鑒定結(jié)果可信度較低。因此在三體鑒定中，形態(tài)學(xué)鑒定不能作為最可靠的鑒定手段，需與細(xì)胞學(xué)鑒定或分子標(biāo)記鑒定結(jié)合。

本研究中，除T3的株高、穗位高及雄穗長度略高于對應(yīng)的二倍體植株外，其余9個(gè)三體各性狀均小于對應(yīng)的二倍體，這與Mcclintock[2]的研究結(jié)果一致，其原因?yàn)槿w增加一條額外染色體，可能會導(dǎo)致其生活力及生長勢都弱于二倍體植株，對于T3材料出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象的原因尚不明確。此外，初級三體系植株標(biāo)記基因的性狀表現(xiàn)與植株是否為三體沒有必然聯(lián)系，可利用分子標(biāo)記等手段對初級三體標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)一步深入研究。

額外染色體的傳遞率是利用三體進(jìn)行遺傳分析的重要參數(shù)。一般通過(2n+1)×2n、2n×(2n+1)這2種組配模式來測定額外染色體的傳遞率。申書興等[19]研究發(fā)現(xiàn)大白菜額外染色體通過雌配子傳遞率為8.69%～29.42%，通過雄配子傳遞率為3.53%～23.53%；張成合等[20]發(fā)現(xiàn)結(jié)球甘藍(lán)額外染色體通過雌配子傳遞率為5.36%～42.37%，通過雄配子傳遞率為1.54%～13.04%；羅雙霞等[1]發(fā)現(xiàn)芥藍(lán)額外染色體通過雌配子傳遞率為10.15%～27.63%，通過雄配子傳遞率為4.91%～11.86%，即額外染色體通過雌配子傳遞率一般高于雄配子的傳遞率。本研究增加了(2n+1)× (2n+1)三體自交模式測定傳遞率，該模式傳遞率為3.4%～25.0%，高于僅通過雌配子(1.7%～21.7%)和僅通過雄配子(0～6.0%)的傳遞率，表明通過玉米初級三體自交可獲得更高的傳遞率，其原因可能是雌、雄配子同時(shí)出現(xiàn)n+1配子，從而增加了2n+1個(gè)體出現(xiàn)的幾率。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果驗(yàn)證了T1～T10確實(shí)是分別增加玉米第1～第10條染色體的玉米初級三體；玉米初級三體的鑒定可采用細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合方法；額外染色體通過三體自交的傳遞率為3.4%～25.0%，高于僅通過雌配子(1.7%～21.7%)和僅通過雄配子(0～6.0%)的傳遞率，通過自交對該初級三體系的額外染色體進(jìn)行傳遞，能夠達(dá)到較高的傳遞率和適中的結(jié)實(shí)率。對引進(jìn)的初級三體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)鑒定及傳遞率研究為該套初級三體的進(jìn)一步利用提供了應(yīng)用基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。下一步可利用該套玉米初級三體進(jìn)行相關(guān)基因定位研究、染色體或基因的重復(fù)效應(yīng)研究等。