蘆筍對高脂飲食小鼠腸道內(nèi)容物細(xì)菌多樣性的影響

彭買姣 惠華英 肖嫩群 譚周進(jìn)

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

蘆筍是百合科(Liliaceae)天門冬屬(AsparagusL.)草本植物，作為食藥兩用的保健食品，具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能[1]。蘆筍莖嫰多汁，風(fēng)味獨(dú)特[2]，口感較好，深受消費(fèi)者青睞。此外，蘆筍含有游離氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)成分，以及甾體皂苷、黃酮類、多糖等藥用成分[3-5]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、防止血管硬化、抑制高血壓、降低血脂及膽固醇等藥理作用[6-7]，其中蘆筍多糖和黃酮類化合物作為一種重要的功能因子在抗腫瘤、防衰老等方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。

高脂飲食中的食物脂肪含量高，長期食用會使體內(nèi)脂肪水平超過正常范圍，易引發(fā)健康問題。高脂肪飲食能夠引起腸道組織氧化應(yīng)激發(fā)生，改變腸道微生態(tài)[10]，誘發(fā)身體內(nèi)部代謝紊亂，導(dǎo)致糖尿病、肥胖等代謝性疾病，而肥胖又易造成心血管及腫瘤等一系列疾患，危害人體健康。腸道菌群是人體代謝的重要參與者，尤其在營養(yǎng)消化、吸收等代謝方面有重要的作用。腸道菌群對人類健康和疾病的影響越來越受到人們的關(guān)注[11]。大量研究證實(shí)，腸道菌群與肥胖、心血管系統(tǒng)疾病等相關(guān)[12]。王勤等[13]研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)在糖尿病的發(fā)病過程中起著重要作用，腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致腸源性尿毒癥毒素的積累。另有研究表明，腸道菌群會影響體脂的沉積造成肥胖，而肥胖會增加患糖尿病、高血壓等疾病的風(fēng)險，進(jìn)而認(rèn)為腸道微生物與腸道疾病密切相關(guān)[14]。正常情況下，腸道菌群參與人體生命穩(wěn)態(tài)的維持，調(diào)控人體多項(xiàng)生理、病理等活動[15]。蘆筍具有降血脂的作用[16]，蘆筍中強(qiáng)吸附性的纖維素可減小膽固醇、甘油三酯的吸收，從而防止多處心血管疾病的發(fā)生。

降脂理肝湯為張?jiān)迄i教授治療非酒精性脂肪性肝病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由澤瀉、決明子、丹參、郁金、海藻、荷葉6味中藥組成，經(jīng)驗(yàn)方中重用澤瀉降脂理肝，輔以決明子清肝化濁通便，荷葉升清降濁，丹參、郁金活血通絡(luò)，疏肝經(jīng)之疲，行肝中之結(jié)。臨床觀察表明，降脂理肝湯具有調(diào)脂、護(hù)肝和減肥作用[17]。本研究通過對小鼠飼喂高脂飼料，再飼喂蘆筍汁、降脂理肝湯，采用高通量測序技術(shù)對小鼠腸道菌群16S rDNA V4可變區(qū)進(jìn)行測序，運(yùn)用QIIME軟件比較樣品中所含微生物的種類及豐度，旨在闡明蘆筍對高脂飲食小鼠腸道微生物多樣性的影響，為蘆筍及其產(chǎn)品的開發(fā)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物 SPF級昆明小鼠，購自湖南斯萊克斯實(shí)驗(yàn)有限公司，雌雄各12 只，體質(zhì)量約為20 g。動物編號SCXK(湘)2016-0002，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.1.2 飼料 正常對照組飼料為純基礎(chǔ)飼料，高脂組飼料為88%的基礎(chǔ)飼料中添加2%膽固醇和10%豬油[18]。

1.1.3 藥物 將蘆筍(山東乳山恒裕食品有限公司)用蒸餾水反復(fù)沖洗，吸水紙吸干，將蘆筍剪碎，稱取60 g并加入10倍水量(質(zhì)量比，w/w)，煮沸2次，每次30 min，合并2次煮沸溶液，80℃真空濃縮至200 mL，蘆筍液濃度為0.30 g·mL-1，備用。

降脂理肝湯：參考文獻(xiàn)[19]，稱取藥材決明子30 g、澤瀉10 g、郁金10 g、丹參10 g、荷葉10 g和海藻30 g。加入10倍水煎煮濃縮至0.92 g·mL-1，按比例1∶5.4(v/v)稀釋至0.17 g·mL-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組 選取SPF級昆明小鼠24只，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后，隨機(jī)分成4組，每組6 只，雌雄各半。分別為正常對照組(bcn)、高脂飲食組(bmn)、高脂飲食蘆筍組(bln)及高脂飲食降脂理肝湯組(bjn)。正常對照組喂食基礎(chǔ)飼料，其他各組喂食高脂飼料，分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 給藥方法及用量 將上述分組小鼠按臨床劑量等效灌胃給藥。高脂飲食蘆筍組按2.10 g·kg-1·d-1給藥，高脂飲食降脂理肝湯組給藥降脂理肝湯濃度為1.19 g·kg-1·d-1，正常組與高脂飲食組每次均給予0.35 mL的蒸餾水，每天2次，固定上下午時間。

1.2.3 小鼠腸道內(nèi)容物提取 參照Zeng等[20]、Guo等[21]的方法。小鼠飼養(yǎng)40 d后處死，采取無菌操作收集每組空腸至回腸的腸道內(nèi)容物，充分混勻后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?，參照吳海等[22]的方法提取腸道微生物總DNA。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，以提取的DNA為模板，嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，使循環(huán)數(shù)盡可能低的同時，保持?jǐn)U增條件一致，采用細(xì)菌16S rDNA V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步熒光定量，將各樣本按照相應(yīng)的比例混合。

1.2.5 熒光定量 采用Promega公司(美國)的熒光定量法，將PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量。根據(jù)熒光定量結(jié)果，將各個樣本按照相應(yīng)比例混合。

1.2.6 MiSeq文庫構(gòu)建及宏基因組測序 測序文庫的制備交由Illumina公司(美國)完成，具體操作方法：首先進(jìn)行序列末端修復(fù)，通過AXYGEN公司(美國)的凝膠回收試劑盒中的End Repair Mix2切除DNA序列5′端的突出堿基，同時添加一個磷酸基團(tuán)，補(bǔ)齊3′端的缺失堿基；在DNA序列的3′端添加A堿基以防止DNA自連，保證目標(biāo)序列能與測序接頭相連，使DNA分子能被固定在Flow Cell上；將接頭自連片段去除，PCR擴(kuò)增DNA片段，添加接頭后的文庫體系做進(jìn)一步選擇與純化。

1.3 分析指標(biāo)

1.3.1 OTU聚類 操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)通常是指根據(jù)人工序列相似性閾值將一個或多個樣本中的序列歸并為一個OTU。將序列進(jìn)行歸并以及劃分OTU，可以對不同群落微生物在分類水平進(jìn)行對比。采用QIIME軟件進(jìn)行OUT歸并，優(yōu)選最佳代表序列[23]。

1.3.2 多樣性指數(shù) 多種指數(shù)均可反映Alpha多樣性，但衡量菌群多樣性的不同指數(shù)的側(cè)重點(diǎn)不一樣。其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)為多樣性指數(shù)，兩者皆可反映菌群均勻度，與群落多樣性成正比。此外，Chao和ACE(the ACE estimato)為豐富度估計(jì)指數(shù)，側(cè)重反映菌群的豐富度，同樣群落的豐富度與指數(shù)大小成正比。

1.3.3 主成分分析 主成分分析(principal component analysis,PCA)主要以降維、簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)為目的，展現(xiàn)樣本的自然分布，即將高位數(shù)據(jù)通過現(xiàn)形變換組合投影到較低緯度的坐標(biāo)系中。在新的坐標(biāo)系中，樣本間的距離可以最大限度地減小。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異；采用R軟件制圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組DNA序列分析

高通量測序過程中，可能產(chǎn)生堿基替換、插入、刪除等錯誤，或產(chǎn)生嵌合體序列。運(yùn)用QIIME軟件對疑問序列進(jìn)行識別，檢查剔除嵌合體序列以確保分析結(jié)果的可靠性。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1和圖1，優(yōu)質(zhì)序列長度集中在450 bp，可用于后續(xù)分析。

2.2 腸道菌群組成的差異

2.2.1 蘆筍對高脂飲食小鼠腸道細(xì)菌OTU數(shù)目和群落結(jié)構(gòu)差異的影響 由圖2可知，正常對照組OTU總數(shù)有1 264種，高脂飲食組OTU總數(shù)有1 564種，高脂飲食降脂理肝湯組OTU總數(shù)有1 354種，高脂飲食蘆筍組OTU總數(shù)有1 654種，且4個試驗(yàn)組共有576種OTU數(shù)相同。OTU總數(shù)從高到低依次為高脂飲食蘆筍組、高脂飲食組、高脂飲食降脂理肝湯組和正常對照組。正常對照組與高脂飲食組共有的OTU數(shù)為929個，與高脂飲食降脂理肝湯組共有的OTU數(shù)為751個，與高脂飲食蘆筍組共有OTU數(shù)為859個；高脂飲食組與高脂飲食降脂理肝湯組共有的OTU數(shù)為888個，與高脂飲食蘆筍組共有的OTU數(shù)為1 071 個；高脂飲食蘆筍組與高脂飲食降脂理肝湯組共有的OTU數(shù)為861個，說明灌胃蘆筍液和降脂理肝湯改變了小鼠細(xì)菌OTU數(shù)目，使腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大改變。

表1 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Sample sequence number statistics

注：有效序列：index完全匹配的序列。bcn1～3分別是正常對照組1～3; bmn1～3分別是高脂飲食組1～3; bln1～3為高脂飲食蘆筍組1～3; bjn1～3分別是高脂飲食降脂理肝湯組1～3。下同。
Note：Effective sequence: Index exactly matching. bcn1-3:Control normal groups 1-3. bmn1-3: High-fat diet groups 1-3. bln1-3: High-fat diet asparagus groups 1-3. bjn1-3: High-fat diet Jiangzhiligan decoction groups 1-3. The same as following.

注：bcn、bmn、bjn、bln分別是正常對照組、高脂飲食組、高脂飲食降脂理肝湯組、高脂飲食蘆筍組。下同。Note：bcn: Control normal group. bmn: High-fat diet group. bjn: High-fat diet Jiangzhiligan decoction group. bln: High-fat diet asparagus group. The same as following.圖2 OTU維恩圖(按97%的相似水平對序列進(jìn)行OTU的聚類)Fig.2 Venn diagram of OTUs (according to 97% of sequence under the similar level of clustering)

注：兩點(diǎn)之間的距離越近，表明樣本之間群落結(jié)構(gòu)越相似，差異越小。Note:The closer the distance between two points, the smaller difference of the microbial community.圖3 腸道菌群PCA圖Fig.3 PCA diagram of intestinal microblota

由圖3可知，位于第一、第二象限的高脂飲食組(bmn)分布集中，正常對照組(bcn)位于第二、第三象限，也較為集中，高脂飲食蘆筍組(bln)分布在第一、第二、第三象限，高脂飲食降脂理肝湯組(bjn)分布在第二、第三、第四象限，說明高脂飲食使小鼠腸道細(xì)菌的均勻度發(fā)生了改變，與正常對照組存在差異。高脂飲食蘆筍組與高脂飲食降脂理肝湯組中各有2個試驗(yàn)組與正常對照組距離接近，而第三試驗(yàn)組離散程度高，分別位于第一和第四象限。離散的原因可能與小鼠個體體質(zhì)有關(guān)，或組間反應(yīng)有差異，致使小鼠腸道菌群均勻度降低，表明蘆筍和降脂理肝湯能在一定程度上促進(jìn)高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。

2.2.2 蘆筍對高脂飲食小鼠腸道細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響 Alpha多樣性分析能反映特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的豐富度和均勻度，從豐富度ACE指數(shù)來看，由高到低分別為高脂飲食組、高脂飲食降脂理肝湯組、高脂飲食蘆筍組、正常對照組；Chao指數(shù)最高為高脂飲食組，其次為高脂飲食降脂理肝湯組、正常對照組、高脂飲食蘆筍組，且各組間無顯著差異(P> 0.05)，高脂飲食蘆筍組與正常對照組的數(shù)值最接近。從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來看，腸道細(xì)菌多樣性從高到低依次為高脂飲食組、高脂飲食降脂理肝湯組、正常對照組、高脂飲食蘆筍組，其中高脂飲食蘆筍組與高脂飲食組的Shannon指數(shù)有顯著性差異(P< 0.05)，其余試驗(yàn)組的Simpson和Shannon指數(shù)值均無顯著差異(P> 0.05)(表2)，表明灌胃蘆筍液后菌群結(jié)構(gòu)多樣性發(fā)生了改變，明顯降低了腸道細(xì)菌的均勻度。

表2 生物多樣性指數(shù)表Table 2 Biodiversity indices of all treatment groups

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note：Different lowercase letters in the same column indicate significate difference at 0.05 level.

2.2.3 蘆筍對高脂飲食小鼠腸道細(xì)菌相對豐度的影響 結(jié)合各試驗(yàn)組細(xì)菌分類門水平的相對豐度分布圖(圖4)以及表3可知，腸道細(xì)菌在門水平，各組從高到低排列后，厚壁菌門(Firmicutes)為正常對照組、高脂飲食降脂理肝湯組、高脂飲食組和高脂飲食蘆筍組；變形菌門(Proteobacteria)為高脂飲食組、高脂飲食蘆筍組、正常對照組和高脂飲食降脂理肝湯組；放線菌門(Actinobacteria)為降高脂飲食降脂理肝湯組、高脂飲食組、高脂飲食蘆筍組、正常對照組；藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)為高脂飲食蘆筍組、高脂飲食降脂理肝湯組、高脂飲食組、正常對照組；擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度從高到低為高脂飲食蘆筍組、高脂飲食組、高脂飲食降脂理肝湯組、正常對照組。高脂飲食蘆筍組變形菌門、放線菌門的相對豐度介于高脂飲食組與正常對照組之間，高脂飲食降脂理肝湯組厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度介于高脂飲食組與正常對照組之間，藍(lán)細(xì)菌相對豐度在各組間有差別，規(guī)律不明顯，且無顯著性差異(P> 0.05)。說明在細(xì)菌分類門水平，各組間的細(xì)菌相對豐度有差別，灌胃蘆筍液和降脂理肝湯會影響相應(yīng)細(xì)菌的豐度從而改變小鼠腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)。

表3 腸道細(xì)菌在門水平的相對豐度統(tǒng)計(jì)Table 3 Relative abundance of the gut bacteria at the phylum level

注：橫坐標(biāo)為試驗(yàn)樣品，縱坐標(biāo)為相對豐度。不同顏色代表不同分類單元。每種顏色所在區(qū)域的高度代表該分類單元的豐度。Note：The abscissa is the test samples, and the ordinate is the relative abundance. The same color represents the same classification unit. The height of each color area means the abundance of taxa.圖4 物種門分布圖Fig.4 Distribution of species on the phylum level

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為“藥療不如食療”，食療用于養(yǎng)生療疾，已成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。戴凱群等[24]研究發(fā)現(xiàn)楊梅酒對致病菌生長增殖的抑制作用十分明顯，為探明楊梅酒中具有抗菌消炎作用的活性成分及其藥理作用提供了新線索。丁浩淼等[25]研究羊棲菜多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性，以期開發(fā)羊棲菜作為降血糖功能性食品原料。馮翠萍等[26]通過研究蘆筍中豐富的纖維素和黃酮化合物發(fā)現(xiàn)，其能降低人體血脂膽固醇，預(yù)防心血管疾病。為進(jìn)一步擴(kuò)大對蘆筍及其產(chǎn)品的開發(fā)利用，本研究通過對小鼠進(jìn)行高脂飲食，再與喂食蘆筍液、降脂理肝湯及正常對照組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食使腸道細(xì)菌OTU總數(shù)增加，降脂理肝湯促進(jìn)、蘆筍液抑制了高脂飲食小鼠腸道細(xì)菌OUT數(shù)的恢復(fù)，小鼠腸道的細(xì)菌種類總數(shù)發(fā)生了變化，且腸道細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變；PCA分析表明，正常對照組集中分布在第二、第三象限，高脂飲食組集中分布在第一、第二象限，高脂飲食蘆筍組和高脂飲食降脂理肝湯組與正常對照組距離較近，說明腸道細(xì)菌種類及均勻程度都發(fā)生了改變，兩者均能在一定程度上促進(jìn)高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。Chao、ACE、Shannon及Simpson指數(shù)常用于表示腸道細(xì)菌群落多樣性和豐富度。本研究結(jié)果表明，高脂飲食組各指數(shù)值均高于正常對照組，表明菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，灌胃蘆筍液與降脂理肝湯后各指數(shù)值趨于恢復(fù)正常，高脂飲食蘆筍組比高脂飲食降脂理肝湯組效果更明顯。

腸道菌群可分為“有益菌”(如乳酸菌和雙歧桿菌)、“有害菌”以及“中立菌”(如大腸桿菌)三大類，主要由厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門等組成，“有益菌”可幫助腸道分解消化食物有助于新陳代謝等，而“有害菌”會阻礙腸道代謝，誘發(fā)腸炎，肥胖等癥。變形菌門數(shù)量的增加是生態(tài)失調(diào)和疾病風(fēng)險的診斷標(biāo)志，厚壁菌門和擬桿菌門細(xì)菌豐度比值在肥胖人群中明顯高于正常人群，厚壁菌門可以將多糖轉(zhuǎn)換為可吸收的單糖類和短鏈脂肪酸，產(chǎn)生更多可吸收的能源，導(dǎo)致體重增加甚至肥胖[27]。本研究中，從細(xì)菌分類門分析，高脂飲食使放線菌門、變形菌門和擬桿菌門相對豐度升高，而藍(lán)細(xì)菌升高不明顯，厚壁菌門相對豐度降低。高脂飲食小鼠腸道細(xì)菌多樣性相比正常組在一定程度上有所增加。高脂飲食蘆筍組變形菌門、放線菌門相對豐度介于高脂飲食組與正常對照組之間，高脂飲食降脂理肝湯組厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度介于高脂飲食組與正常對照組之間，進(jìn)一步說明蘆筍液與降脂理肝湯可通過影響腸道菌群結(jié)構(gòu)及細(xì)菌群落多樣性達(dá)到降低血脂的效果，進(jìn)而降低脂量。何云山等[28-30]研究發(fā)現(xiàn)蘆筍對高脂飲食小鼠的脾臟和胸腺等免疫器官具有保護(hù)作用，同時還可以降低血脂中甘油三酯含量；此外，蘆筍可通過調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道內(nèi)乳桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌等微生物的結(jié)構(gòu)來調(diào)控體脂儲存和能量代謝，同時抑制高脂飲食小鼠腸道酶活性從而影響其消化吸收功能，進(jìn)而影響體重。唐艷強(qiáng)等[31]研究發(fā)現(xiàn)蘆筍秸稈提取物能夠增強(qiáng)蛋雞腸道消化酶活性，改善腸道形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)養(yǎng)分消化吸收，也有一定降脂的作用。本研究在此基礎(chǔ)上，采用高通量測序技術(shù)，通過Alpha多樣性和細(xì)菌分類門等比較分析小鼠腸道細(xì)菌群落多樣性和豐富度，證實(shí)蘆筍對高脂飲食小鼠腸道內(nèi)容物細(xì)菌多樣性產(chǎn)生了影響，通過改變腸道菌群結(jié)構(gòu)能達(dá)到降脂效果。本研究創(chuàng)新之處在于能夠檢測更多菌類。但是研究中發(fā)現(xiàn)蘆筍液與降脂理肝湯對高脂飲食小鼠腸道細(xì)菌多樣性影響存在諸多差異，灌胃蘆筍液和降脂理肝湯后小鼠腸道細(xì)菌在多樣性及相對豐度等方面有變化，但無明顯規(guī)律性，不能更加全面直觀地體現(xiàn)腸道菌群多樣性對高脂飲食引起肥胖的影響，后期研究還需加大樣本量并擴(kuò)大考察因素范圍，進(jìn)一步研究蘆筍降血脂的微生態(tài)機(jī)理。

4 結(jié)論

本研究采用構(gòu)建高脂飲食的方法進(jìn)行高通量測序分析蘆筍對小鼠腸道內(nèi)容物細(xì)菌多樣性的影響，通過與降脂理肝湯進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)蘆筍能影響腸道菌群結(jié)構(gòu)并降低高脂飲食小鼠腸道細(xì)菌群落多樣性和豐富度，證實(shí)蘆筍對高脂飲食引起的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化有影響，能使其恢復(fù)到正常水平，同時也說明蘆筍液與降脂理肝湯通過影響小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及細(xì)菌群落多樣性達(dá)到了降脂的效果，結(jié)合前期研究認(rèn)為，蘆筍對高脂飲食引起的肥胖有一定的減肥效果。本試驗(yàn)僅分析了腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)并測定了部分指標(biāo)，后續(xù)研究將繼續(xù)擴(kuò)大研究范圍，并采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)更全面地分析蘆筍對腸道微生物的作用機(jī)理，為蘆筍及其產(chǎn)品的深入開發(fā)提供數(shù)據(jù)和理論支撐。