HPLC法測定人參花茶和人參花紅茶中13種人參皂苷含量

董慶海，王涵，曹瑩，楊錄軍，崔寶仁，王清，劉金平，李平亞，王松※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021；2.吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司，長春 130022；3.撫松縣晟宏生態(tài)人參有限公司，吉林 白山 134500）

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科人參屬多年生草本植物，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，有“百草之王”的美譽(yù)[1]，主要生長在我國東北地區(qū)[2]。人參花系人參未開放的花蕾，又名“神草花”，呈暗綠色，質(zhì)脆，易碎，氣香，性溫和，味甘微苦，有清熱消炎、平肝清火、解毒利咽、降血壓等功效，是天然的補(bǔ)品，素有“綠色黃金”之稱[3-4]。每株人參僅開1 朵花，每年6月中旬左右人參花蕾才能孕育成熟，此時方可采摘[5]。近年來，隨著對人參花研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)人參花中人參皂苷的含量是根的5 倍[6]，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)免疫力[7]，但不含Ro皂苷，服用不會使人上火[8]，揮發(fā)油含量也高于根、莖[9]，人參總多糖含量是根的2～5倍[5]，此外，人參花有其特有成分，人參花蕾9 肽和人參花蕾11 肽屬于小分子，極易吸收，可快速準(zhǔn)確地識別機(jī)體內(nèi)的cAMP-cGMP平衡，使人體維持健康狀態(tài)[10]。

通過人工采集人參花，經(jīng)日曬、烘干、發(fā)酵等工藝，可制成人參花茶和人參花紅茶，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)價值極高，充分發(fā)揮了人參花的保健作用。人參花茶和人參花紅茶作為一種新興保健飲品，市場前景巨大，然而，在《中國藥典》中只記載了人參根和人參葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并未見關(guān)于人參花及人參花茶的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究應(yīng)用HPLC 法建立了人參花茶和人參花紅茶中13 種人參皂苷的定性、定量分析方法，旨在為其質(zhì)量控制和評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；FA1104N 型電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；ACchrom S6000 型高效液相色譜儀（華譜新創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，美國Fisher 試劑公司）；甲醇（分析純，天津新通精細(xì)化工有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）；純凈水（白山娃哈哈飲料有限公司）；人參皂苷Rg1、Rc、Rb2、Rb3、F1、F2、Rb1、Rh1對照品（吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院自制）；人參皂苷CK 對照品（中國藥品生物制品檢定所）；人參皂苷Re、Rg2、Rd、Rg3對照品（吉林大學(xué)天然藥物研究中心自制）。

人參花茶1 號、2 號、3號（生產(chǎn)日期為2018.12.10）和人參花紅茶 4 號、5 號、6 號（生產(chǎn)日期 2019.01.10），均由吉林紫鑫藥業(yè)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

稱取人參皂苷對照品適量，置于容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，配制成Rg1（0.68mg/mL）、Re（0.74mg/mL）、Rh1（0.36 mg/mL）、Rg2（0.42 mg/mL）、Rb1（0.16 mg/mL）、Rc（0.3 mg/mL）、F1（0.1 mg/mL）、Rb2（0.44 mg/mL）、Rb3（0.36 mg/mL）、Rd（0.38 mg/mL）、Rg3（0.24 mg/mL）、F2（0.22 mg/mL）、CK（0.26mg/mL）的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

平行稱取人參花茶、人參花紅茶4 g 2 份，加水煎煮2 次，每次100 mL，每次2 h，煎液濾過合并，通過D101 型大孔樹脂柱，上樣吸附4 h。用水洗脫至無色，再用60%乙醇洗脫至無皂苷反應(yīng)，收集60%乙醇洗脫液[11]，濃縮，85℃蒸干，在250 mL容量瓶中甲醇定容，0.45um針式過濾器濾過，取續(xù)濾液，即得供試品、平行供試品。

2.3 色譜條件

色譜柱：Unitary C1（8250 mm×4.6 mm，5um）；柱溫：30℃；檢測波長：203nm；流速：1.3mL/min；進(jìn)樣量：10uL；流動相：乙腈 0.05%磷酸水溶液；梯度洗脫[12]（表1）。

表1 流動相洗脫梯度程序Table 1 Mobile phase elution gradient program

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 取同一批人參花茶供試品溶液，在“2.3”項下測定，連續(xù)進(jìn)樣5 次。計算13 種人參皂苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD 為0.86%～2.87%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重現(xiàn)性 取同一批次人參花茶樣品，按“2.2”項方法制備5 批供試品溶液，在“2.3”項下測定，連續(xù)進(jìn)樣5次。計算13 種人參皂苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD 為0.76%～2.94%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性 取同一人參花茶供試品溶液，在“2.3”項下測定，分別在 2、4、6、12、24h 進(jìn)樣。計算 13 種人參皂苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD為0.89%～2.93%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收率 稱取同一人參花茶樣品1 g 3 份，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入一定量人參皂苷混合對照品溶液，按照供試品制備方法制備后測定。樣品加樣回收率在94.1%～103.4%，RSD 為0.97%～5.32%。

2.4.5 線性關(guān)系 吸取混合對照品溶液4、6、10、15、20uL 分別進(jìn)樣，記錄HPLC 譜圖。以對照品的量（ug）為橫坐標(biāo)、對照品的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表2。

表2 單體人參皂苷峰面積-含量線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of monomer ginsenoside peak area-content

2.5 樣品含量測定

取不同批次的人參花茶、人參花紅茶，按“2.2”項下方法制備，在“2.3”項下測定，混合標(biāo)準(zhǔn)品及人參花茶、人參花紅茶的HPLC 色譜圖見圖1，測定13 種人參皂苷含量的結(jié)果見表3。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品及人參花茶、人參花紅茶樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard，ginseng flower tea and ginseng flower black tea samples

表3 人參花茶和人參花紅茶樣品的人參皂苷含量Table 3 Ginseng saponin content of ginseng flower tea and ginseng flower black tea samples （mg/g）

3 結(jié)論與討論

本研究依據(jù)《中國藥典》2015年版（一部）人參莖、葉總皂苷的制法，制備人參花茶和人參花紅茶的供試品溶液，在最大程度保留人參皂苷的同時，去除其他雜質(zhì)。本試驗采用HPLC 法，建立了2 種人參花茶6 組樣品中13 種人參皂苷類成分的定性、定量分析方法，涵蓋了絕大多數(shù)人參皂苷成分，能夠系統(tǒng)全面地鑒定人參花茶中人參皂苷的種類及含量。結(jié)果表明，2 種人參花茶均含有13 種人參皂苷。人參花茶和人參花紅茶中人參皂苷Rd、Re、Rc、Rg2的含量存在差異，人參花茶中人參皂苷Rd、Re、Rc 的含量高，人參花紅茶中人參皂苷Rg2的含量高，是區(qū)分2 種花茶的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。人參花茶和人參花紅茶樣品均含有豐富的人參皂苷營養(yǎng)成分及功能因子，但二者之間也存在一定的差異，與這2 種花茶的制作工藝有關(guān)。

本試驗建立的HPLC 檢測方法，能在同一色譜條件下同時對人參花茶和人參花紅茶中13 種主要人參皂苷的含量進(jìn)行測定，建立了同一色譜條件測定多種人參皂苷類成分含量的測定方法。本方法簡便、快捷，且分析結(jié)果全面可靠，為人參花茶和人參花紅茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。