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    麝香壯骨膏對(duì)誘導(dǎo)型佐劑關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究

    2019-09-21 08:37:06許艷茹石菊展月李敏唐曉桐王雅儷徐建
    特產(chǎn)研究 2019年3期
    關(guān)鍵詞:壯骨麝香滑膜

    許艷茹,石菊,展月,李敏,唐曉桐,王雅儷,徐建※

    (1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司,長(zhǎng)春 130012;2.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,吉林 通化 134000)

    麝香壯骨膏藥方源于《皇帝內(nèi)經(jīng)》,已經(jīng)有2 000多年的歷史[1]。麝香壯骨膏處方由麝香、薄荷腦、冰片等17 味藥材組成,功能主治鎮(zhèn)痛、消炎,用于風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛等病癥。風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病。大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型是一種典型的免疫性炎癥模型,是目前最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的RA 實(shí)驗(yàn)方法[2-3]。本品臨床應(yīng)用廣泛,但未見其藥效學(xué)研究報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)大鼠足趾皮下注射弗氏完全佐劑來(lái)建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型,對(duì)小鼠腹腔注射冰醋酸來(lái)建立腹膜炎模型,觀察麝香壯骨膏對(duì)其藥效作用。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物與儀器

    ICR 小鼠(雌、雄各半,6~8 周齡,體重 18~22 g)、Wistar 大鼠(雄性,體重 240~260 g)(長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司);酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司);低速離心機(jī)(LD5-2A 型,北京醫(yī)用離心機(jī)廠);電子天平(JA0311N型,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);弗氏完全佐劑(CFA)(SLBD0736,SIGMA公司);類風(fēng)濕因子(RF)、骨保護(hù)素(OPG)、核因子(NF-kB)試劑盒(批號(hào)20171229);白介素-17(IL-17)、腫瘤壞死因子(TNF-a)試劑盒(批號(hào):20180115)(南京建成生物工程研究所)。

    1.2 藥物

    麝香壯骨膏(批號(hào):20170905)、陰性基質(zhì)貼(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司);麝香壯骨膏(批號(hào)20161105,黃石衛(wèi)生材料藥業(yè)有限公司)作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

    1.3 劑量設(shè)計(jì)

    按照中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn),劑量以臨床劑量折算獲得,根據(jù)含膏量及藥物與基質(zhì)的比例計(jì)算得出給藥面積。

    2 方法[4]

    2.1 大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎試驗(yàn)

    從60 只雄性大鼠中隨機(jī)取10 只作為空白對(duì)照組,其余50 只大鼠進(jìn)行造模:以75%乙醇消毒后,右后足墊皮內(nèi)注射CFA0.1 mL/只,制備佐劑性關(guān)節(jié)炎模型,空白對(duì)照組以同樣方法注射生理鹽水0.1mL/只。造模7 d 開始分組給藥,分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(給予基質(zhì)貼劑)、陽(yáng)性對(duì)照組(64 mg/kg)、麝香壯骨膏低、中、高劑量組(32、64、128 mg/kg),取貼膏劑貼服于大鼠足趾部位,用橡皮膏固定,每天換藥1 次,連續(xù)給藥14 d。

    使用游標(biāo)卡尺分別于造模前、造模后2、5、10、21 d測(cè)量大鼠右后足趾腫脹度,參照張鈞天[4]方法評(píng)估關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index,AI)。于造模后 2、5、10、21 d 觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度,標(biāo)準(zhǔn)如下:0 分,無(wú)紅腫;1 分,小趾關(guān)節(jié)紅腫;2 分,趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹;3 分,踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4 分,包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。將各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來(lái),即為每只大鼠的AI,最高分為12 分。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠血清中RF、TNF-a、IL-17、NF-kB 以及OPG 水平。取下右后肢足趾,10%中性甲醛固定,光鏡下觀察用藥前、后大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜的變化,比較關(guān)節(jié)組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

    2.2 小鼠腹膜炎試驗(yàn)

    取小鼠 60 只,雌、雄各半,體重 18~22 g,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(給予基質(zhì)貼劑)、陽(yáng)性對(duì)照組(137 mg/kg)及麝香壯骨膏低、中、高劑量組(46、137、228 mg/kg),每天換藥1 次,連續(xù)7 d。末次給藥后,各鼠均靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液10 mL/kg,并立即腹腔注射0.7%冰醋酸10 mL/kg。注射冰醋酸后15 min 處死小鼠,用生理鹽水沖洗腹腔,收集全部沖洗液至5 mL,3 000 r/min 離心 10 min 后,取上清液于630 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其OD 值,以O(shè)D 值表示沖洗液中伊文思藍(lán)的濃度,依據(jù)伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伊文思藍(lán)滲出量,間接反映腹膜炎性滲出的程度。

    2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05 表示差異顯著。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎試驗(yàn)結(jié)果

    3.1.1 對(duì)大鼠足趾腫脹度的影響 造模后模型對(duì)照組大鼠足趾腫脹度明顯增加,與空白對(duì)照組相比有極顯著差異(P<0.001),說明模型成功。各給藥組在10、21 d 時(shí)能夠明顯抑制足趾腫脹度,與模型對(duì)照組有顯著差異(P<0.05),提示麝香壯骨膏能明顯抑制腫脹度,減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)(表1)。

    3.1.2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化 造模2 d 后,除空白對(duì)照組外,其余組大鼠表現(xiàn)出不同程度的關(guān)節(jié)炎癥,提示造模成功。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),模型對(duì)照組大鼠的關(guān)節(jié)損傷加重,關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸上升。用藥后各給藥組在造模10~21 d 關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯降低,與模型對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05),提示麝香壯骨膏能降低關(guān)節(jié)炎指數(shù),減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)(表2)。

    表1 各組大鼠右后足趾腫脹度的變化Table 1 The swelling degree changes of right hind toe in each group of rats (±s,n=10)

    表1 各組大鼠右后足趾腫脹度的變化Table 1 The swelling degree changes of right hind toe in each group of rats (±s,n=10)

    注:###.空白對(duì)照組相比,在 0.001 水平上差異極顯著(P<0.001);*、**、***.與模型對(duì)照組相比,在 0.05、0.01、0.001 水平上差異顯著或極顯著。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P<0.001);*,**,***.Significant differences with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

    腫脹度(mm)Swelling degree組別Group劑量(mg/kg)Dose 造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白對(duì)照組Blank control group ― 0.05±0.08 0.12±0.15 0.04±0.10 0.11±0.29模型對(duì)照組Model control group ― 3.93±0.81### 3.51±0.77### 2.05±0.62### 1.74±0.51###陽(yáng)性對(duì)照組Positive control group 64 3.63±0.76 3.14±0.69 1.54±0.53* 1.26±0.54*低劑量組Low-dose group 32 3.46±0.71 3.06±.73 1.03±0.61** 1.29±0.51中劑量組Medium-dose group 64 3.39±0.97 2.89±0.81 1.18±0.37** 1.07±0.43**高劑量組High-dose group 128 3.44±0.54 3.02±0.64 1.43±0.33* 1.23±0.30*

    表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化Table 2 The arthritis index changes of rats in each group (±s,n=10)

    表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化Table 2 The arthritis index changes of rats in each group (±s,n=10)

    注:###.與空白對(duì)照組相比,差異極顯著(P<0.001);*.與模型對(duì)照組相比,差異顯著(P<0.05)。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P<0.001);*.Significant difference with model control group(P<0.05).

    組別Dose劑量(mg/kg)Dose造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白對(duì)照組Blank control group - 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00模型對(duì)照組Model control group - 3.8±0.42### 4.7±1.25### 5.9±1.29### 6.1±1.45###陽(yáng)性對(duì)照組Positive control group 64 3.6±0.52 4.7±0.82 4.4±1.17* 4.7±0.67*低劑量組Low-dose group 32 3.5±0.53 4.6±0.97 4.7±1.16* 4.6±0.97*中劑量組Medium-dose group 64 3.7±0.48 4.6±0.70 4.6±1.17* 4.7±1.16*高劑量組High-dose group 128 3.6±0.52 4.5±0.97 4.7±1.16* 4.7±0.95*

    3.1.3 麝香壯骨膏對(duì)各組大鼠血清生化指標(biāo)的影響模型對(duì)照組大鼠血清OPG 含量明顯降低,RF、NF-kB 釋放量明顯增加,與空白對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05);麝香壯骨膏能明顯促進(jìn)OPG 生成(P<0.05),低、中劑量麝香壯骨膏抑制血清RF、NF-kB 的表達(dá)釋放(P<0.05),提示麝香壯骨膏對(duì)關(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用,能減輕類風(fēng)濕的發(fā)生。結(jié)果見表3。

    模型對(duì)照組大鼠血清TNF-a和IL-17 含量與空白對(duì)照組相比極顯著增加(P<0.01),低、中、高劑量麝香壯骨膏明顯抑制大鼠血清TNF-a釋放(P<0.05),低、中劑量麝香壯骨膏對(duì)血清IL-17 含量的抑制作用顯著(P<0.05)。結(jié)果見表4。

    表3 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清OPG、NF- B 和RF 水平的影響Table 3 Effects of musk strong bone paste on serum OPG,NF- B and RF levels in rats (±s,n=10)

    表3 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清OPG、NF- B 和RF 水平的影響Table 3 Effects of musk strong bone paste on serum OPG,NF- B and RF levels in rats (±s,n=10)

    注:#、###.與空白對(duì)照組相比,在 0.05 和 0.001 水平上差異顯著;*、**、***.模型對(duì)照組相比,在 0.05、0.01 和 0.001 水平上差異顯著Note:#,###.Significant difference with blank control group at 0.05 and 0.01 levels;*,**,***.Significant difference with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

    組別 Group 劑量 Dose(mg/kg) OPG(pmol/L) RF(ng/L) NF- B(ng/mL)空白對(duì)照組 Blank control group - 332.0±114.9 32.6±2.43 16.4±4.53模型對(duì)照組 Model control group - 173.5±45.7### 41.7±12.70## 22.2±5.16#陽(yáng)性對(duì)照組 Positive control group 64 342.1±111.8*** 37.8±9.47* 17.8±6.04*低劑量組 Low-dose group 32 279.0±15.5*** 36.8±16.70* 16.1±4.90*中劑量組 Medium-dose group 64 262.3±116.2* 38.5±6.60* 16.8±6.18*高劑量組 High-dose group 128 283.1±62.8** 39.7±2.95 18.8±4.56

    表4 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清TNF- 和IL-17 含量的影響Table 4 Effects of musk strong bone paste on serum TNF- and IL-17 contents in rats (±s,n=10)

    表4 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清TNF- 和IL-17 含量的影響Table 4 Effects of musk strong bone paste on serum TNF- and IL-17 contents in rats (±s,n=10)

    組別 Group 劑量 Dose(mg/kg) TNF-(ng/L) IL-17(ng/L)空白對(duì)照組 Blank control group - 97.8±62.1 44.3±14.2模型對(duì)照組 Model control group - 156.8±65.6## 77.8±33.6##陽(yáng)性對(duì)照組 Positive control group 64 124.2±63.4* 57.4±29.9*低劑量組 Low-dose group 32 86.9±53.8*** 47.6±18.2**中劑量組 Medium-dose group 64 115.8±52.3** 59.1±16.6*高劑量組 High-dose group 128 128.8±46.4* 65.2±27.4

    3.1.4 關(guān)節(jié)滑膜軟組織的病理形態(tài)學(xué)變化 空白對(duì)照組大鼠的踝關(guān)節(jié)面光滑,關(guān)節(jié)腔內(nèi)無(wú)滲出物,滑膜層由2~3 層滑膜細(xì)胞組成,排列規(guī)則,滑膜細(xì)胞下層為疏松結(jié)締組織,未見滑膜增生;模型對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞顯著增生,排列絮亂,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),結(jié)締組織嚴(yán)重充血,血管翳形成,節(jié)腔隙變窄,炎性滲出;麝香壯骨膏中劑量組踝關(guān)節(jié)面光滑,滑膜細(xì)胞增生減少,細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,滑膜下疏松結(jié)締組織中度充血,關(guān)節(jié)腔未見狹窄;麝香壯骨膏低、高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組滑膜輕度增生,少量細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜下疏松結(jié)締組織中度充血,關(guān)節(jié)腔輕度狹窄。結(jié)果見圖1。

    3.2 小鼠腹膜炎試驗(yàn)

    由表5可知,模型對(duì)照組伊文思藍(lán)的炎性滲出量明顯增加,麝香壯骨膏低、中、高劑量組小鼠腹腔伊文思藍(lán)的炎性滲出明顯減少,與模型對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05),表明麝香壯骨膏可以抑制炎性滲出的發(fā)生。

    圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜軟組織的病理形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Pathomorphological changes of synovial soft tissue in each group of rats

    表5 麝香壯骨膏對(duì)各組小鼠腹腔伊文思藍(lán)滲出量的影響Table 5 Effects of musk strong bone paste on the exudative amount of Evans blue from the abdominal cavity of mice in each group (±s,n=12)

    表5 麝香壯骨膏對(duì)各組小鼠腹腔伊文思藍(lán)滲出量的影響Table 5 Effects of musk strong bone paste on the exudative amount of Evans blue from the abdominal cavity of mice in each group (±s,n=12)

    組別 Group 劑量(mg/kg) Dose 伊文思藍(lán)滲出量( g/mL) Exudative amount of Evans blue空白對(duì)照組 Blank control group - 0.163±0.012模型對(duì)照組 Model control group - 0.944±0.338###陽(yáng)性對(duì)照組 Positive control group 137 0.660±0.292*低劑量組 Low-dose group 46 0.680±0.192*中劑量組 Medium-dose group 137 0.560±0.102**高劑量組 High-dose group 228 0.672±0.253*

    4 討論

    炎癥早期主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)、滲出和水腫[5-6],麝香壯骨膏可以抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性,對(duì)炎癥有較好的抑制作用。NF-kB 是炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要的調(diào)控器[7-8];破骨細(xì)胞是RA 骨破壞進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞,是介導(dǎo)滑膜局部炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞之一[9-11],近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),它也是參與關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞[12-13]。在骨代謝中,RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)涉及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互作用[14],RANKL和OPG由骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成分泌[15-16],破骨細(xì)胞表面RANK 受體與分泌型RANKL 結(jié)合,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化,在破骨細(xì)胞性骨吸收中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),麝香壯骨膏通過抑制血清RF 的表達(dá),有效提高了OPG 的表達(dá)水平,OPG與NF-kB 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上,降低與RANKLRANK 結(jié)合率,激活破骨細(xì)胞核因子-k(NF-kB)信號(hào)途徑,促進(jìn)TNF-a和IL-17 的表達(dá)和分泌,從而抑制破骨細(xì)胞性骨吸收而發(fā)揮作用。

    麝香壯骨膏臨床應(yīng)用廣泛,但其有效的作用機(jī)制未見研究報(bào)道,對(duì)RA 的治療機(jī)制涉及多個(gè)方面。本研究主要就該方對(duì)大鼠關(guān)節(jié)損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了探討,對(duì)RA 發(fā)病環(huán)節(jié)中其他因素的影響有待進(jìn)一步研究。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究?jī)?nèi)容的深入與研究手段的發(fā)展,本方劑的抗RA機(jī)制會(huì)有待進(jìn)一步探討。

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