基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的血栓心脈寧片入血成分分析

譚靜，林紅強(qiáng)，劉云鶴，王涵，董慶海，吳福林，朱繼忠，劉傳貴，李平亞，劉金平，劉俊麗※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院天然藥物研究中心，長(zhǎng)春 130021；2.吉林華康藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700）

血栓心脈寧片（Xueshuan Xinmaining Tablet,XXT）具活血散瘀、芳香開(kāi)竅之功效，收載于中國(guó)藥典（2015年版）一部[1-3]。臨床上用于心絞痛、冠心病及腦血栓等屬血瘀證者[4-7]。研究表明XXT 抗血瘀的作用靶點(diǎn)多種多樣，通過(guò)下調(diào)F13a1、Car1 及Tbxa2r等基因來(lái)改善血液流變學(xué)[8]；上調(diào)Keap1、GCLM、HMOX1、NQO1 及Nrf2 等信號(hào)通路的蛋白表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷活性[9]；調(diào)控花生四烯酸及脂類代謝和類固醇激素生物合成等內(nèi)源性代謝物通路抑制血瘀形成[3]等。但目前，XXT 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究稍顯薄弱，化學(xué)成分研究主要集中在指紋圖譜的建立及含量測(cè)定等方面[10-11]，已明確28 種成分；2015版藥典中規(guī)定了XXT 中的阿魏酸、蘆丁和丹酚酸B等5 種成分的最低含量和測(cè)定方法[1]。明磊等[12]運(yùn)用UPLC-ESI-MS/MS 和 GC-MS 技術(shù)從 XXT 中共鑒定出丹參酮類、人參皂苷類及蟾酥甾二烯類等47 個(gè)非揮發(fā)性成分和龍腦、異龍腦等36 個(gè)揮發(fā)性成分。譚靜等[13]基于多元統(tǒng)計(jì)分析方法，應(yīng)用UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)與UNIFI 天然產(chǎn)物分析平臺(tái)相結(jié)合，在XXT 中鑒定出三萜皂苷類、菲醌類、蟾蜍甾二烯類和甾體類及其他結(jié)構(gòu)類型的化合物共187 種化學(xué)成分。但尚未見(jiàn)有關(guān)XXT 入血成分的定性分析報(bào)道。

中藥血清藥物化學(xué)是綜合多種研究技術(shù)和方法來(lái)研究口服給予中藥后的血清樣本，從血清中提取分離并鑒定血中移行成分，研究其與傳統(tǒng)藥效作用的相關(guān)性，闡釋中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其代謝情況和體內(nèi)動(dòng)態(tài)的領(lǐng)域[14-15]。中藥化學(xué)成分復(fù)雜，經(jīng)口服給藥后，其有效成分需進(jìn)入血液并由血液轉(zhuǎn)運(yùn)至作用靶點(diǎn)才能發(fā)揮藥效。因此，藥物的血中移行成分與其在體內(nèi)的直接發(fā)揮藥效的物質(zhì)緊密相關(guān)[16]。藥物入血后，血清中的移行成分主要是由入血原型成分和藥物在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物以及機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)激性成分組成。目前，UPLC-Q-TOF/MS 憑借其快速、靈敏、高分辨的優(yōu)勢(shì)，不僅適用于多組分快速檢測(cè)，還能夠?qū)?fù)雜基質(zhì)中的組分準(zhǔn)確定性，從而成為中藥復(fù)方體內(nèi)、外成分分析的首選方法[17-18]。

本研究擬采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)灌胃給予XXT 的血瘀大鼠血清樣本進(jìn)行分析，辨識(shí)其血中成分，為全面系統(tǒng)地闡明該中藥大品種藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

XXT（吉林華康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：180404），灌胃前配制成0.14 g/mL 的溶液；腎上腺素（天津藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：1811281）；亮氨酸-腦啡肽〔Sigma公司（美國(guó)）〕；分析純乙醚（天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20181210）；質(zhì)譜級(jí)乙腈和甲酸鈉〔Fisher Chemical 公司（中國(guó)，上海）〕；用水為純化去離子水。

1.2 儀器

Q-TOF/MS 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Xevo G2-XS）、樣本管理器及ACQUITY UPLC 二元泵（美國(guó)Waters 公司）；氮吹儀（DCY-12S，青島海科儀器有限公司）；冷凍干燥儀（FDU-1200，東京理化器械株式會(huì)社）；飛鴿超離速離心機(jī)（TGL-16 aR，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠〔合格證號(hào)：SCXK（吉）-2018-003〕，體重200±20 g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，在溫度 22 ± 4℃、相對(duì)濕度40%～60%的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，每隔12 h 明-暗交替循環(huán)，自由采食、飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7um）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A 和 B 分別為0.1%甲酸-水溶液與0.1%甲酸-乙腈溶液（v/v）；梯度洗脫條件：0～2 min10%B，2～26 min 10%～90%B，26～28 min 90%B，28.0～28.1min 90%～10%B，28.1～30.0 min 10%B；自動(dòng)進(jìn)樣器位溫度：15 ℃；進(jìn)樣體積：5uL；流速：0.4 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件

MSEcontinuum模式下，掃描范圍為m/z100～1500。優(yōu)化的儀器參數(shù)如下：在ESI+和ESI-模式下，毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3.0 kV 和40 V；氬氣流量0.15 mL/min；溫度為120 ℃時(shí)，錐孔氣流量為50 L/h；溫度為300 ℃時(shí)，脫溶劑流量為600 L/h；質(zhì)量的準(zhǔn)確測(cè)定是以 100 ng/mL 的亮氨酸-腦啡肽（ESI+：m/z 556.277 1，ESI-：m/z 555.261 5）溶液為校正標(biāo)準(zhǔn)液（Lock Spray TM），流量為15uL/min，并使用甲酸鈉對(duì)儀器進(jìn)行校正。

2.3 血清樣本的處理

取雄性Wistar大鼠32 只，在經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按性別體重隨機(jī)分為空白組（Black group,B）、模型組（Model group,M）、空白給藥組（Black drug group,BD）和模型給藥組（Model drug group,MD），每組8只，其中，BD 和MD 組以上述劑量每天灌胃給藥1 次，B和M組給予等劑量生理鹽水，連續(xù)8d，每次給藥30min后將 M 和 MD 組大鼠置于冰水（0～1 ℃）中 5 min，末次給藥30 min 后，M 和MD 組大鼠皮下注射0.1%腎上腺素（1 mg/kg）2 次，首次劑量為 1 mg/kg，末次劑量減為0.5 mg/kg，間隔4 h，間隔時(shí)間內(nèi)將各組實(shí)驗(yàn)鼠冰水浴5 min，以建立急性血瘀模型[19]。造模2 h 后BD和MD 組再次給藥，給藥1 h 后，采用乙醚對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行麻醉，分別于 0.5、1.5、2.5、3.5 h 眼叢后靜脈取血各約0.5 mL，血液樣本3 000 r/min 離心15 min，取上清液，后將每只大鼠4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清合并，取500uL加入4 倍量甲醇進(jìn)行沉淀處理，渦旋3 min，混勻液10 000 r/min 低溫（4 ℃以下）離心 10 min，吸取上清，冷凍干燥。所得殘?jiān)?.2 mL 甲醇復(fù)溶，渦旋混勻，10 000 r/min 低溫離心10 min，取上清，備用。與此同時(shí)，將每個(gè)樣本吸取15uL，混合后得質(zhì)量控制 QC（Quality control）樣本，在進(jìn)樣前、進(jìn)樣中及進(jìn)樣后各進(jìn)一針QC 樣本，以對(duì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估[20]。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用 MarkerLynx XS 4.1 軟件（Waters，Manchester，UK）對(duì)血清樣本的UPLC-Q-TOF/MSE 數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)、色譜峰提取、去褶合、校準(zhǔn)、同位素消除、數(shù)據(jù)縮減及歸一化等分析，保留時(shí)間為0～30 min，質(zhì)量為100～1 500 u，質(zhì)量公差為0.10，標(biāo)記強(qiáng)度閾值為2 000，最小強(qiáng)度為5%，保留時(shí)間窗為0.20，質(zhì)量窗為0.10，噪聲消除水平為6。所得數(shù)據(jù)通過(guò)主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），獲得VIP 值和OPLS-DA/S-plot圖，發(fā)現(xiàn)能夠代表組間差異的潛在的標(biāo)記物。采用R2Y 和Q2兩個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)模型，模型的擬合度和可預(yù)測(cè)度分別用R2Y 和Q2 表示，這兩個(gè)參數(shù)的大小能夠反映模型的可靠性與準(zhǔn)確性。所得數(shù)據(jù)通過(guò) PCA 和 OPLS-DA 分析，獲得 VIP 值和OPLS-DA/S-plot圖，發(fā)現(xiàn)能夠代表組間差異的血中移行成分。

3 結(jié)果

3.1 XXT及生物樣本色譜圖的建立與分析

對(duì)B、BD、M 和MD 組大鼠血清樣本進(jìn)行定性分析。XXT 中所含的各單體成分在30 min 內(nèi)得到較好的分離，4 種血清樣本的正、負(fù)離子模式下的基峰總離子流圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，血清中所含有的內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)良好，但因其質(zhì)譜響應(yīng)值高于XXT 體內(nèi)成分，存在干擾明顯，在所采集的血清色譜圖中難以直觀上發(fā)現(xiàn) XXT 的體內(nèi)成分。故在此基礎(chǔ)上結(jié)合 PCA 和OPLS-DA 檢測(cè)與鑒定XXT 的入血成分。

圖1 XXT 的給藥血清在ESI+和ESI-模式下的基峰離子流圖Fig.1 The base peak intensity chromatograms in serum of XXT in ESI+mode and ESI-mode

3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

采用Markerlynx XS 4.1 軟件導(dǎo)入通過(guò)UPLC-QTOF/MS 采集的原始數(shù)據(jù)文件，進(jìn)行加入分組信息的PLS-DA分析。結(jié)果PLS-DA模型呈現(xiàn)出較好組間差異。

PCA 載荷圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本。正、負(fù)離子模式下的健康大鼠和病理大鼠即B、BD、M 和MD大鼠灌胃給予XXT后的血清代謝輪廓PCA載荷圖見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，4 個(gè)組別的大鼠血清樣本被明顯地分為4 個(gè)區(qū)域，說(shuō)明各樣本存在顯著差異。QC樣本聚集，說(shuō)明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。正、負(fù)離子模式下的健康大鼠和病理大鼠灌胃給予XXT 血清代謝輪廓的OPLS-DA 載荷圖以及OPLS-DA/S-plots 圖分別見(jiàn)圖3、4和圖5、6。在 M 和 MD 組的 OPLS-DA 得分圖中，可明顯觀察到因血清樣本被分成2 個(gè)離散群，分別為M組（得分矩陣左側(cè)）和MD組（XXT，得分矩陣右側(cè)），說(shuō)明M 與MD 組血清相比存在差異顯著的成分。

圖2 B、BD、M 和 MD 組大鼠血清代謝輪廓 PCA 圖Fig.2 PCA plots of serum metabolic profiles in B、BD、M and MD group rats

圖3 B 和BD 組大鼠的血清代謝譜OPLS-DA 載荷圖Fig.3 OPLS-DA load map of serum metabolic profiles in B and BD group rats

圖4 B 和BD 組大鼠血清代謝譜OPLS-DA/S-plots 載荷圖Fig.4 Serum metabolic profiles S-plots loading map in B and BD group rats

圖5 M、MD 組大鼠的血清代謝譜OPLS-DA 載荷圖Fig.5 OPLS-DA load map of serum metabolic profiles in M and MD group rats

以 VIP 即某個(gè)變量對(duì)模型分類的貢獻(xiàn)程度為依據(jù)，對(duì)變量進(jìn)行篩選，認(rèn)為VIP＞1.0 且經(jīng)T 檢驗(yàn)后P＜0.05 的代謝物是具有差異性的代謝物，后經(jīng)一級(jí)、二級(jí)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合XXT圖譜與對(duì)照品及參考文獻(xiàn)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，在血瘀大鼠中共鑒定出28 個(gè)入血原型成分及3 個(gè)代謝產(chǎn)物。

3.3 XXT中吸收入血原型成分的鑒定

在篩選出的離子峰中，認(rèn)為既存在于XXT中，又存在于給藥血清中的成分是血中移行成分[21]。通過(guò)比對(duì)各質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，選取VIP＞1.0 且經(jīng)T 檢驗(yàn)P＜0.05 的代謝物，在給藥血清中分析并鑒定出28 個(gè)血中移行成分。

3.4 代謝產(chǎn)物的鑒定

3.4.1 代謝產(chǎn)物M1 保留時(shí)間為5.13 min 時(shí)，存在m/z 617.054 4 峰，推測(cè)為[M-H]峰，以 m/z 617.054 4 為母離子進(jìn)行MS/MS 掃描，產(chǎn)生3 個(gè)主要碎片離子，m/z 583.068 9 和m/z 573.150 6 分別是由母離子丟失2 分子H2O 和 1 分子HCOOH 產(chǎn)生的[M-H-2H2O]和[MH-HCOOH]峰；母離子丟失1 分子H2O和1 分子-SO3形成m/z 519.092 7[M-H-H2O-SO3]峰；m/z 421.136 2是由母離子丟失1 分子 C9H9O5產(chǎn)生[M-H-C9H9O5]峰；與原型成分丹酚酸B 的分子結(jié)構(gòu)及碎片裂解規(guī)律[22]基本一致，故推測(cè)M1 分子式為C27H22O15S，屬酚酸類，其代謝途徑推測(cè)為丹酚酸B 在體內(nèi)發(fā)生硫酸化反應(yīng)，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7。

圖7 ESI-模式下代謝產(chǎn)物M1 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 Secondary mass spectrum of Metabolite M1 in ESI-

3.4.2 代謝產(chǎn)物M2 在保留時(shí)間11.32 min 時(shí)，出現(xiàn)m/z 981.547 3 的峰，推測(cè)為[M-H]峰，以 m/z 981.547 3為母離子進(jìn)行MS/MS 掃描，產(chǎn)生4 個(gè)主要碎片離子，m/z 683.487 9 是由母離子丟失1 分子葡萄糖和1 分子阿拉伯糖形成的[M-H-Ara(f)-Glu]峰，繼而分別丟失2 分子 H2O 和1 分子 SO3形成 m/z661.333 9 [MH-2H2O-Ara(f)-Glu]峰和m/z 621.369 1 [M-H-SO3-Ara(f)-Glu]峰，m/z 459.384 5 由m/z 621.369 1 繼續(xù)丟失1 分子葡萄糖形成的[M-H-SO3-Ara(f)-2Glu]峰，為原人參二醇皂苷元的特征離子峰，與原型成分人參皂苷Rc 的分子結(jié)構(gòu)及碎片裂解規(guī)律[23]相比，除引入1分子 SO3外，分子量相差178，可能最先脫掉1 分子葡萄糖，故推測(cè)M2 分子式為C47H82O19S，屬三萜皂苷類，其代謝途徑推測(cè)為人參皂苷Rc 在體內(nèi)先發(fā)生葡萄糖醛酸化，再進(jìn)行硫酸化反應(yīng)，，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖8。

圖8 ESI-模式下代謝產(chǎn)物M2 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.8 Secondary mass spectrum of Metabolite M2 in ESI-

3.4.3 代謝產(chǎn)物M3 在保留時(shí)間23.25 min 時(shí)，出現(xiàn)m/z 469.230 1 的峰，推測(cè)為[M-H]峰，以 m/z 469.230 1為母離子進(jìn)行MS/MS 掃描，產(chǎn)生4 個(gè)主要碎片離子，m/z 451.241 5 和m/z 425.284 5 分別由母離子丟失1分子 H2O 和1 分子 HCOOH 得到 [M-H-H2O]峰和[M-H-HCOOH]峰；m/z 389.271 4 由母離子脫去 1 分子 SO3產(chǎn)生[M-H-SO3]峰；母離子脫去1 分子 SO3、-CH3和1 分子 C8H14O2及2 個(gè)H形成碎片離子峰m/z 227.307 2[M-H-2H-CH3-SO3-C8H14O2]峰，與原型成分膽酸的分子結(jié)構(gòu)及碎片裂解規(guī)律[24]相比，除引入 SO3、脫1 分子H2外，分子量相差18，因此猜測(cè)先脫水，故推測(cè)M3 分子式為C24H38O7S，屬于甾體類成分，其代謝途徑推測(cè)為膽酸在體內(nèi)先脫水，然后經(jīng)氧化再發(fā)生硫酸化反應(yīng)，二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖9。

圖9 ESI-模式下代謝產(chǎn)物M3 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.9 Secondary mass spectrum of Metabolite M3 in ESI-

4 討論

中藥傳統(tǒng)的口服給藥方式?jīng)Q定了只有吸收入血的成分才能發(fā)揮藥效作用[25]。血清成分分析存在含量較低、組分復(fù)雜、分離較難，生物個(gè)體差異較大的特點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用中藥血清藥物化學(xué)研究方法，將多變量統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)與基于UPLC-Q-TOF/MS提供的高選擇性、高靈敏度、高分離度及高質(zhì)量精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，研究灌胃給予XXT后在健康大鼠和血瘀模型大鼠體內(nèi)的血中移行成分。

中藥血清藥物化學(xué)研究大多集中對(duì)正常動(dòng)物入血成分的分析，但目前研究發(fā)現(xiàn)，正常與病理狀態(tài)下的動(dòng)物對(duì)同種中藥的吸收利用存在明顯差異[26-27]。因此，本實(shí)驗(yàn)將Wistar 大鼠隨機(jī)分為B、BD、M 和MD 組進(jìn)行血中移行成分分析。

本實(shí)驗(yàn)前期建立XXT化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF/MS 分析，明確了XXT 的體外化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上，對(duì)比分析模型組血清、給藥組血清和XXT 的70%甲醇提取液從中獲得對(duì)應(yīng)化合物的提取總基峰離子圖，然后與入血成分分析比對(duì)，快速分離并初步鑒定出健康大鼠入血原型成分14 個(gè)、血瘀模型大鼠入血成分28個(gè)，其中共有成分12 個(gè)。血瘀模型大鼠的入血成分以菲醌、三萜皂苷及甾體類為主要，其中多種成分來(lái)源于多味藥材，進(jìn)一步說(shuō)明XXT抗血瘀活性是多味藥材共同作用的結(jié)果。從血瘀模型大鼠發(fā)現(xiàn)的血中移行成分中可能為XXT 的體內(nèi)直接作用物質(zhì)。

5 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的方法，辨識(shí)了灌胃給予XXT后大鼠體內(nèi)的血中移行成分。通過(guò)基于血清色譜圖，結(jié)合PCA、OPLS-DA 分析，并比對(duì)各質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，在健康組和血瘀組大鼠的給藥血清中分別鑒定出14、28 個(gè)血中移行成分，其中共有成分12 個(gè)。二者的血中移行成分存在一定差異。從血瘀病理鼠的血中移行成分中發(fā)現(xiàn)了人參皂苷Rd、隱丹參酮、二氫丹參酮I、膽酸、?；侨パ跄懰帷⒍嗨谹 及洋川芎內(nèi)酯H 等含量較高的成分，而在健康鼠血清中未檢測(cè)出，推測(cè)這幾種成分與抗血瘀藥效緊密相關(guān)。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步對(duì)各成分與各作用靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，為XXT進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和臨床合理應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。