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    響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷工藝研究

    2019-09-21 08:35:08韓燕燕張瑞姜濤王英平王恩鵬陳長寶
    特產(chǎn)研究 2019年3期
    關(guān)鍵詞:皂苷人參乙醇

    韓燕燕,張瑞,姜濤,王英平,3,王恩鵬※,陳長寶※

    (1.長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),長春 130118;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長春 130112)

    人參花為人參的花蕾,總皂苷含量為人參的5 倍以上,揮發(fā)油含量高于莖、葉和根,并含有多種礦物質(zhì)和微量元素,素有“綠色黃金”之稱,是珍貴的藥材[1-4]。人參花具有降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老及增強(qiáng)免疫力等多重藥理活性[5-9]。近年來,人們加深了對(duì)人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)、生理功能及提取方法等的研究。

    目前,人參皂苷的主要提取方法有浸漬、滲漉、蒸煮和回流[10-11]。其中,浸漬和滲漉法存在提取時(shí)間長、溶劑耗量大、有效成分提取不完全等缺點(diǎn)。蒸煮法和回流法由于提取溫度較高、受熱時(shí)間長,存在易使對(duì)熱不穩(wěn)定的有效成分被破壞、活性下降等缺點(diǎn)[12-13]。因此,在保持藥理活性不變的基礎(chǔ)上,高效、快速地提取皂苷類等有效成分是人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展中有待解決的問題。

    超高壓提取是指在常溫下將流體靜壓力(100~1 000 MPa)作用于料液,在設(shè)定壓力下保持一段時(shí)間,使藥物細(xì)胞內(nèi)、外有效成分達(dá)到溶解平衡,再迅速卸壓,使細(xì)胞內(nèi)、外壓力差瞬間增大,細(xì)胞內(nèi)有效成分快速地穿過細(xì)胞的各種膜,隨提取溶劑迅速地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外,從而達(dá)到提取有效成分的目的[14-16]。超高壓對(duì)非共價(jià)鍵有影響,對(duì)共價(jià)鍵不產(chǎn)生影響,可以使某些蛋白質(zhì)發(fā)生變性、酶失去活力、微生物死亡等,但不會(huì)破壞藥物中小分子有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性,進(jìn)而達(dá)到有效成分提取及滅菌等作用[17]。目前,超高壓技術(shù)已廣泛應(yīng)用于提取天然產(chǎn)物的有效成分[18]。

    響應(yīng)面中Box-Behnken模塊試驗(yàn)設(shè)計(jì)是效應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的一種,根據(jù)考察因素與考察指標(biāo)的關(guān)系建立數(shù)學(xué)模型,并進(jìn)行分析,從中可以判斷出模型與試驗(yàn)結(jié)果的擬合程度,考察因素間的交互作用對(duì)考察指標(biāo)的影響等[19-24]。本試驗(yàn)基于超高壓提取技術(shù),應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷工藝參數(shù),以期為長白山道地藥材,尤其以人參為代表的名貴藥材及其藥用部位的科學(xué)開發(fā)與應(yīng)用提供新方法與新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    人參花購于撫松縣萬良市場,經(jīng)干燥粉碎后過20目篩,備用;人參皂苷Re 對(duì)照品(中國藥品生物制品鑒定所);乙醇為分析純;水為蒸餾水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HPP.L2-700/1 超高壓設(shè)備(天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司);酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO,瑞士帝肯公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 人參花總皂苷的提取工藝 人參花→烘干→粉碎過篩(20 目)→加乙醇混勻→超高壓提取處理→抽濾→濾液。

    1.3.2 供試品溶液的制備 將“1.3.1”項(xiàng)下處理后的濾液置蒸發(fā)皿中,60°C 恒溫水浴蒸干,加蒸餾水適量溶解,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,加適量乙醚萃取,共3 次,合并水層。再加適量水飽和正丁醇萃取,共3 次,棄去水層。最后用1 倍量蒸餾水萃取,棄去水層。取正丁醇層于蒸發(fā)皿中,沸水浴蒸干,適量甲醇溶解,置10 mL量瓶中,定容,搖勻備用。

    1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,置10 mL 量瓶中,甲醇定容,搖勻備用。

    1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“1.3.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液10、20、30、40、60、80、100uL,置具塞型試管中,水浴揮干甲醇(水浴溫度<90°C),依次加入8%香草醛-無水乙醇溶液0.5 mL、72%硫酸溶液5 mL,渦旋60 s,60 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min,立即用冰水冷卻10 min,搖勻。平行制備空白對(duì)照。采用分光光度法于波長544 nm處測得吸光度(A);分別以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(ug)及吸光度值(A)為橫、縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程:y=0.002 6x 0.003 9,R2= 0.999 3。

    1.3.5 人參花總皂苷含量測定 精密量取供試品溶液50uL,按照“1.3.4”項(xiàng)下方法處理并測定吸光度值(A),帶入線性方程中,求出樣品濃度,再根據(jù)公式計(jì)算人參花總皂苷含量:

    W =C×V/m×1 000,W:人參花總皂苷含量(mg/g);C:樣品溶液總皂苷質(zhì)量濃度(ug/mL);V:樣品定容體積(mL);m:原料質(zhì)量(g)。

    1.3.6 單因素試驗(yàn) 乙醇濃度對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響:稱取人參花粉末1.00 g,置真空包裝袋中,設(shè)置保壓時(shí)間4 min、料液比1∶60(g∶mL)、提取壓力400 MPa,乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

    提取壓力對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響:稱取人參花粉末1.00 g,置真空包裝袋中,保壓4 min、料液比 1∶60(g∶mL)、乙醇 70%,分別在壓力為 100、200、300、400、500 MPa 的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

    料液比對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響:稱取人參花粉末1.00 g,置真空包裝袋中,設(shè)置保壓時(shí)間4 min、乙醇濃度70%、提取壓力400 MPa,料液比分別為 1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100(g∶mL)的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

    保壓時(shí)間對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響:稱取人參花粉末1.00 g,置真空包裝袋中,設(shè)置料液比1∶60(g∶mL)、乙醇70%、提取壓力400 MPa,保壓時(shí)間分別為1、2、3、4、5 min的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

    1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn),確定料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取壓力(C)和保壓時(shí)間(D)的最佳優(yōu)化范圍,再利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,確定考察變量(X):A、B、C、D;響應(yīng)值(Y):人參花總皂苷含量,進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析。因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and horizontal design

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 乙醇濃度的影響 由圖1可知,乙醇濃度<70%時(shí),人參花總皂苷的提取率隨乙醇濃度的增加而提高;乙醇濃度>70%時(shí),皂苷類成分提取率下降,可能是由于不同濃度乙醇水溶液的介電常數(shù)與極性不同,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子成分的溶解能力降低,產(chǎn)生凝聚,使細(xì)胞微孔發(fā)生堵塞,致使皂苷類成分向外擴(kuò)散的阻力增大。因此,確定最佳乙醇濃度為60%~80%。

    圖1 乙醇濃度對(duì)總皂苷含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the content of total saponins

    2.1.2 提取壓力的影響 由圖2可知,提取壓力<400 MPa時(shí),人參花總皂苷的提取率隨提取壓力的提高而增加,這是由于組織細(xì)胞在高壓條件下,細(xì)胞內(nèi)、外存在巨大的壓力差,使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,提高了有效成分的滲透速率及溶劑的擴(kuò)散動(dòng)力,從而增加了人參花總皂苷的提取率。但當(dāng)提取壓力>400 MPa 后,推測由于細(xì)胞內(nèi)外壓力差過大,致使細(xì)胞中的其他生物大分子溶出,造成溶質(zhì)通道阻塞,導(dǎo)致人參花總皂苷的提取率下降。由此,確定最佳提取壓力為300~500 MPa。

    圖2 提取壓力對(duì)總皂苷含量的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on the content of total saponins

    2.1.3 料液比的影響 由圖3可知,當(dāng)料液比<1∶60(g∶mL)時(shí),人參花總皂苷的提取率隨料液比的增加而增加;當(dāng)料液比>1∶60(g∶mL)后,人參花總皂苷的提取率基本保持穩(wěn)定,這是因?yàn)殡S液料比的增加,細(xì)胞內(nèi)總皂苷的擴(kuò)散速率不斷加快,但當(dāng)液料比增加到一定值時(shí),細(xì)胞內(nèi)、外總皂苷的擴(kuò)散速率達(dá)到平衡,此時(shí)再繼續(xù)增加液料比,傳質(zhì)動(dòng)力不再增加,致使人參花總皂苷的提取率不再增加,還會(huì)造成提取溶劑浪費(fèi)。由此,確定最佳料液比為 1∶40~1∶80(g∶mL)。

    2.1.4 保壓時(shí)間的影響 由圖4可知,當(dāng)保壓時(shí)間<4 min 時(shí),人參花總皂苷的提取率隨保壓時(shí)間的延長,先緩緩增加后急劇增加;當(dāng)保壓時(shí)間>4 min后,人參花總皂苷的提取率又急劇下降,這可能是因?yàn)樵黾恿似渌M分流出,從而加大了皂苷類成分的溶出傳質(zhì)阻力,導(dǎo)致人參花總皂苷的提取率下降。由此,確定最佳保壓時(shí)間為3~5 min。

    圖3 料液比對(duì)總皂苷含量的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio of the content of total saponins

    圖4 保壓時(shí)間對(duì)總皂苷含量的影響Fig.4 Effect of holding time on the content of total saponins

    2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

    2.2.1 模型建立與顯著性分析 根據(jù) Design-Expert 8.0.6 軟件中的Box-Behnken 模式設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見表2。進(jìn)行多元回歸擬合分析,建立回歸模型,剔除對(duì)人參花總皂苷含量影響不顯著的項(xiàng),得到回歸方程:y=3.62+0.12D 0.5AB 0.33AC 0.41BC 0.18A20.56B20.21C20.40D2。對(duì)其進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。由表3可知,回歸模型的F 值為13.96,P<0.000 1(極顯著),失擬項(xiàng)P=0.057 7>0.05(不顯著),相關(guān)系數(shù)R2=0.933 2,校正系數(shù)R2Adj=0.886 3,變異系數(shù)CV=5.30%,表明模型對(duì)該試驗(yàn)的擬合效果較好,可以真實(shí)地反映出考察因素對(duì)考察指標(biāo)的影響。綜上所述,該模型可用于優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷的工藝參數(shù)。

    根據(jù)表3中的F 值可看出,考察因素對(duì)人參花總皂苷提取率的影響由大到小依次為保壓時(shí)間(D)、乙醇濃度(B)、提取壓力(C)、料液比(A)。由表3中的P值可知,模型中D 與A2對(duì)人參花總皂苷提取率的影響顯著(P<0.05);模型中 AB、AC、BC 和 B2、C2、D2對(duì)人參花總皂苷提取率的影響極顯著(P<0.01)。

    表2 Box-Behnken 試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Box-behnken test scheme and results

    續(xù)表2

    表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

    2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸方程作相應(yīng)的3D曲面圖及等高線圖,列出對(duì)人參花總皂苷提取率具有顯著性的圖(圖5),分析交互因素對(duì)人參花總皂苷提取率的影響。在其他試驗(yàn)因素保持不變的前提下,曲面的坡度越陡峭,等高線越密集,則表示兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越大。由圖5可知,乙醇濃度與料液比的交互作用對(duì)人參花總皂苷提取率的影響極顯著,提取壓力與料液比和提取壓力與乙醇濃度的交互作用對(duì)人參花總皂苷提取率的影響顯著,與表3的分析結(jié)果一致,相互驗(yàn)證。

    2.3 最佳工藝參數(shù)與模型驗(yàn)證

    通過回歸模型預(yù)測,確定超高壓提取人參花總皂苷的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度 72.28%、提取壓力423.51 MPa、料液比1∶50.50(g∶mL)和保壓時(shí)間4.22 min,超高壓提取人參花總皂苷含量的理論值為3.64%。考慮到試驗(yàn)的實(shí)際可操作性,將最佳工藝參數(shù)修正為乙醇濃度 72%、提取壓力 423 MPa、料液比1∶50(g∶mL)和保壓時(shí)間4 min。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性,設(shè)定最佳工藝參數(shù),重復(fù)3 次試驗(yàn),以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性,測得超高壓提取人參花總皂苷的平均含量為3.657%,與理論預(yù)測值相比,相對(duì)誤差值僅為0.012%。由此證明,該模型是可靠的,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    圖5 各試驗(yàn)因素A、B、C、D 所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及等高線圖Fig.5 Surface and contour maps of three-dimensional space composed of test factors A,B,C,D

    3 結(jié)論

    研究結(jié)果表明,響應(yīng)面優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷的最佳工藝參數(shù):乙醇濃度72%、提取壓力423 MPa、料液比 1∶50(g∶mL)和保壓時(shí)間 4 min。在此條件下,測得人參花總皂苷含量為3.657%,與模型預(yù)測值相比,相對(duì)誤差值僅為0.012%,證明該模型是可靠的,具有應(yīng)用價(jià)值。超高壓提取可以提供強(qiáng)大的壓力,促使溶劑快速地滲透到植物組織細(xì)胞內(nèi),加快溶劑的滲透及浸潤速率,在提高提取效率的同時(shí)縮短了提取時(shí)間。本操作在常溫下進(jìn)行,可以避免高溫對(duì)活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。超高壓提取具有提取時(shí)間短、提取效率高、節(jié)省溶劑、耗能低、綠色環(huán)保、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),可為其他天然產(chǎn)物有效成分的提取提供一種新技術(shù)、新工藝。

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