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    血漿miRNAs 水平對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

    2019-09-21 08:03:24朱育銀
    關(guān)鍵詞:結(jié)核結(jié)核病肺結(jié)核

    方 晴 葉 琴 朱育銀

    耐多藥結(jié)核或耐利福平結(jié)核(MDR-TB/RR-TB)的發(fā)病率和死亡率下降趨勢(shì)相似,結(jié)核病的早期診斷對(duì)于結(jié)核病的防治尤為重要[1]。在分枝桿菌感染期間,microRNAs(miRNAs)是免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子[2]。miRNAs 是多種生物過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,是包括結(jié)核病在內(nèi)的多種疾病診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物[3-5]。本研究分析miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 三種血漿游離miRNAs 在診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核中的價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 隨機(jī)選取2015 年4 月—2017 年11月于中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院肺科收治的結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核患者95 例作為病例組。根據(jù)病例組年齡、性別匹配選擇同期健康體檢者95 名作為對(duì)照組。兩組均排除糖尿病、乙型肝炎、免疫缺陷病或其他肺相關(guān)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò),與所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

    1.2 RNA 提取 所有受試者均取空腹肘靜脈血約3mL,靜置30min 后,4℃,2000r/min 離心20min,收集上清,保存于-80℃冰箱。使用TRIzol 試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) 提 取 血 漿 中 游 離miRNAs,溶于無(wú)核酸酶水(AmbionTM,貨號(hào)AM9932,批號(hào)1508254)中并保存在-80℃冰箱。

    1.3 RT-PCR 分析miRNAs 表達(dá) 本研究RT-PCR的引物設(shè)計(jì)如下,miR-769-5p 上游引物:5'-GCGGCGGCTGGGATCTCCGGGGTC-3';下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。miR-320a 上 游 引 物:5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGG-3';下游引物:5'-AACATGTACAGTCCATGGATG-3'。miR-22-3p 上 游 引物:5'-GGGAAGCTGCCAGTTGAAG-3';下游引物:5'-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3'。let-7 上 游引物:5'-ACCAAGACCGACTGCCCTTT-3';下游引物:5'-CTCTGTCCACCGCAGATATT-3'[6]。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas,貨號(hào)K1622,批號(hào)00176496) 合成cDNA,將反應(yīng)混合物在16℃下孵育15min,在42℃下孵育1h,在85℃下孵育5min,并保持在4℃。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)中所有檢測(cè)均一式三份。let-7d、let-7g 和let-7i(let-7d/g/i)的組合用作標(biāo)準(zhǔn)化RT-PCR 數(shù)據(jù)的內(nèi)源對(duì)照[6-7],將miRNAs 的相對(duì)水平歸一化至let-7d/g/i,并使用2-ΔΔCt 方法計(jì)算。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,采用Student's t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示,采用雙側(cè)χ2檢驗(yàn)比較組間差異。構(gòu)建受試者操作特征(ROC)曲線和ROC 曲線下面積(AUC)以評(píng)估候選miRNAs 對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的預(yù)測(cè)能力。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 病例組和對(duì)照組一般資料比較 病例組年齡32~79 歲,平均(45.82±12.74)歲;男65 例,女30 例;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(20.15±2.24)kg/m2;有結(jié)核病治療史24 例。對(duì)照組年齡30~75 歲,平均(46.27±13.59)歲;男62 名,女33 名;BMI(22.43±2.31)kg/m2;無(wú)結(jié)核病治療史。病例組和對(duì)照組年齡、性別等比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性;病例組患者BMI 顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

    2.2 不同年齡層、性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較 不同年齡層、性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1-2。

    2.3 病例組與對(duì)照組血漿miR-769-5p、miR-320a和miR-22-3p 水平比較 病例組患者血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)表3。

    表1 不同年齡間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較

    表1 不同年齡間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較

    組別年齡>60 歲年齡≤60 歲t 值P 值例數(shù)63 127 miR-769-5p 10.36±10.27 12.00±11.75 0.94 0.35 miR-320a 629.11±326.90 596.97±358.85 0.60 0.55 miR-22-3p 0.42±0.22 0.45±0.24 0.83 0.41

    表2 不同性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p水平比較

    表2 不同性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p水平比較

    組別男性女性t 值P 值例數(shù)127 63 miR-769-5p 11.69±11.47 10.98±10.95 0.48 0.68 miR-320a 476.72±269.60 530.10±340.13 1.09 0.28 miR-22-3p 0.38±0.19 0.42±0.25 1.12 0.26

    表3 肺結(jié)核患者與健康體檢者血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較

    表3 肺結(jié)核患者與健康體檢者血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較

    組別病例組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)95 95 miR-769-5p 1.25±0.35 19.88±5.36 33.81<0.01 miR-320a 398.65±56.64 801.52±77.85 40.79<0.01 miR-22-3p 0.31±0.15 0.54±0.22 8.42<0.01

    2.4 血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核 為評(píng)價(jià)所選擇的血漿miRNAs 對(duì)結(jié)核病患者和健康對(duì)照者的鑒別作用,采用整個(gè)樣本集進(jìn)行ROC 曲線分析。ROC 曲線分析結(jié)果顯示,血漿miR-769-5p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 為0.92,靈敏度為88.42%(95%CI:80.23%-94.08%),特異度為73.68%(95%CI:63.65%-82.19%),cut-off 值為4.85(miRNA/let-7)。血漿miR-320a 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 為0.84,靈敏度為80.00%(95%CI:70.54%-87.51%),特異度為78.95%(95%CI:69.38%-86.64%),cut-off 值為506.5(miRNA/let-7)。血漿miR-22-3p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 為0.70,靈敏度為63.16%(95%CI:52.64%-72.83%), 特 異 度 為68.42%(95% CI:58.08% -77.58%),cut-off 值為0.39(miRNA/let-7),見(jiàn)圖1。

    3 討 論

    研究顯示,人血清和血漿中的miRNA 相對(duì)穩(wěn)定[8-9]。血漿miRNA 不僅來(lái)自循環(huán)血細(xì)胞,還來(lái)自其他受疾病影響的組織[10]。此外,在各種細(xì)胞類型的微泡中也存在miRNA[11]。由此說(shuō)明,細(xì)胞的主動(dòng)分泌是血清和血漿中發(fā)現(xiàn)的miRNA 的主要來(lái)源,也進(jìn)一步支持了血清和血漿miRNA 譜是生物學(xué)功能指標(biāo)的假設(shè)。對(duì)血漿和血清miRNA 表達(dá)模式的廣泛研究可能有助于建立與組織中的病理過(guò)程相關(guān)的miRNA譜,并評(píng)估可能有助于理解疾病機(jī)制的循環(huán)miRNA。

    研究者發(fā)現(xiàn),結(jié)核病患者miR-769-5p 的表達(dá)水平低于健康人,與本研究結(jié)果一致[12]。研究顯示,在MCF-7 乳腺癌細(xì)胞復(fù)氧后,miR-769-3p 降低N-myc下游調(diào)節(jié)基因1 的表達(dá),而miR-769-3p 的過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡[13]。此外,miR-769-5p 可與其它miRNAs聯(lián)合應(yīng)用于胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后[14]。本研究發(fā)現(xiàn),肺結(jié)核患者血漿miR-320a 表達(dá)下調(diào),與Cui等[12]研究結(jié)果一致。目前其機(jī)制并不清楚,筆者推測(cè)miR-320a 表達(dá)降低可通過(guò)重新激活肺組織中的細(xì)胞遷移和增殖來(lái)促進(jìn)疾病的進(jìn)展。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),相比健康對(duì)照組,肺結(jié)核患者血漿中的miR-22-3p 水平下調(diào)。研究顯示,miR-22 通過(guò)磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)3'UTR 上的特定位點(diǎn)直接下調(diào)磷酸酶和張力蛋白同源物水平,并通過(guò)微調(diào)PTEN/AKT/FoxO1 途徑的動(dòng)力學(xué)起作用[15]。在內(nèi)皮細(xì)胞中,細(xì)胞外尿苷三磷酸(UTP)和三磷酸腺苷(ATP)通過(guò)miR-22 減弱細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達(dá)和白細(xì)胞黏附[16]。為了理解miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 在結(jié)核病患者中獨(dú)特表達(dá)模式的重要性,需進(jìn)一步研究這些miRNA,以鑒定循環(huán)miRNA的靶基因及其機(jī)制,通過(guò)調(diào)控miRNAs 的表達(dá)來(lái)控制和預(yù)防病情的發(fā)展。

    圖1 ROC 曲線診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核疾病

    本研究結(jié)果顯示,血漿miR-769-5p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 高達(dá)0.92,且靈敏度為88.42%,特異度為73.68%,從中可以看出血漿miR-769-5p 具有較高的診斷價(jià)值。同時(shí),我們還分析了血漿miR-320a 水平,結(jié)果顯示診斷肺結(jié)核的AUC 為0.84,敏感度和特異度分別為80.00%和78.95%,也具有較高的診斷價(jià)值。另外,血漿miR-22-3p 也顯示出了較高的診斷價(jià)值,AUC 達(dá)到0.70,靈敏度和特異度均超過(guò)了60%。由于本研究樣本量較少,可能存在較大誤差,因此需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

    綜上所述,血漿游離miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 對(duì)于預(yù)防和診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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