大黃素抑制胰腺癌新生血管形成的機制研究

陳敏遠 鄭晨果 劉長寶 王兆洪

大黃素是一種蔥醒類物質(zhì)，能抑制多種惡性腫瘤細胞生長并誘導凋亡[1-3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，大黃素也能通過抑制腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤生長[4]。本實驗在裸鼠原位移植瘤模型基礎(chǔ)上研究大黃素抑制胰腺癌新生血管生成的機制，并探討微小RNA（microRNA）在大黃素抑制胰腺癌新生血管形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 大黃素（純度＞98%，美國Sigma公司，批號E7881），用二甲基亞砜（DMSO）溶解，DMSO 的終濃度＜0.1%；內(nèi)皮細胞標記物CD31、CD34，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司，批號CD1-H5224、CD4-H5255、Santa023）；Trizol （美 國Invitrogen 公 司， 批 號12183555）；Takara One Step PrimeScript microRNA cDNA Synthesis Kit 和Takara SYBR Premix Ex Taq TM II（日本Takara 公司，批號D350A、DRR041A）；熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)所需引物由上?；瞪镉邢薰竞铣?。

1.2 細胞系和動物 人胰腺癌細胞株SW1990（美國組織培養(yǎng)庫ATCC）；雌性BALB/c 裸鼠（中國科學院上海動物實驗中心）40 只，4～6 周齡，體質(zhì)量20～22g，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。飼養(yǎng)于無特定病原體動物級（SPF 級）屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，室溫控制在（25±1）℃，相對濕度40%～60%。本實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學實驗動物中心動物實驗倫理審核通過（批準編號：wydw2019-0012）。

1.3 動物模型制備 （1）皮下移植瘤制備：取對數(shù)生長期的SW1990 細胞約2×106注射于裸鼠皮下，1 個月后生長成約1cm3皮下移植瘤，無菌條件下處死裸鼠取出腫瘤組織，選取健康腫瘤組織剪成1mm3的組織塊待用。（2）胰腺癌裸鼠原位移植瘤制備：50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，取左上腹腹直肌旁切口，暴露胰尾并打開胰腺被膜，將瘤塊置入胰尾后縫合被膜。

1.4 分組和給藥 將40 只BALB/c 裸鼠用隨機數(shù)字表法分為對照組和大黃素低、中、高劑量組（20、40、80mg/kg）[5]，每組10 只。手術(shù)后第3 周開始給藥，對照組給予DMSO 終濃度＜0.1%的生理鹽水，腹腔注射；大黃素低劑量組給予20mg/kg 大黃素，腹腔注射；大黃素中劑量組給予40mg/kg 大黃素，腹腔注射；大黃素高劑量組給予80mg/kg 大黃素，腹腔注射；各組均每周治療3 次，共治療2 周[5]。末次用藥1 周后予用戊巴比妥麻醉裸鼠，取部分腫瘤組織4%多聚甲醛固定，待免疫組織化學染色；另一部分腫瘤組織存于液氮中，待Western blot 和qRT-PCR 檢測。

1.5 免疫組化法檢測各組原位移植瘤微血管密度（MVD） 取固定好的腫瘤組織，經(jīng)脫蠟、水化、3%H2O2封閉以及高壓熱抗原修復后，加入兔血清封閉，CD31/CD34 一抗體4℃孵育過夜，PBS 洗滌后滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育30min，DAB 顯色3～5min，蘇木素復染后樹脂封片鏡檢。低倍鏡（100×）下尋取血管熱點區(qū)域，然后高倍鏡（400×） 下隨機選擇5 個視野，計數(shù)每個視野中CD31/CD34 陽性細胞數(shù)，其平均值即為微血管密度[6]。

1.6 Western blot 法檢測各組原位移植瘤VEGF 蛋白表達 取新鮮腫瘤組織，RIPA 裂解液裂解組織，提取上清，BCA 方法定量蛋白濃度。12%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，含5%無脂牛奶TBST 封閉，滴加VEGF 一抗4℃孵育過夜，HRP 標記的二抗孵育2h，用ECL 發(fā)光液顯色。GAPDH 為內(nèi)參。

1.7 qRT-PCR 法測定各組miR-20b，miR-21，miR-155，miR-210 表達 按照Trizol 試劑盒使用說明書從腫瘤組織提取總RNA，并計算RNA 純度和濃度。選取OD260/OD280 比值在1.8～2.0 之間的RNA 進行后續(xù)試驗。依據(jù)Takara One Step PrimeScript microRNA cDNA Synthesis Kit（Perfect Real Time）試劑盒說明書配制反應(yīng)液，將microRNA 逆轉(zhuǎn)錄（即RT 反應(yīng)）為cDNA。依據(jù)Takara SYBR Premix Ex Taq TM II（Perfect Real Time）試劑盒說明書配置反應(yīng)液，加入miR 引物序列與Uni-miR qPCR Primer，將PCR 反應(yīng)管離心機輕輕離心后放入LightCycler 480 Real Time PCR 擴增儀中進行Real Time PCR反應(yīng)。Uni-miR qPCR Primer 為寶生物公司通用引物。內(nèi)參U6 引物由寶生物公司提供。其余反應(yīng)所需引物由寶生物公司與上海基康生物有限公司合成。用于qRT-PCR 的引物序列如下：miR-20b 5′ -CAAA GUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3′；miR-21 5′-UAGC UUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；miR-155 5′-UUAA UGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3′；miR-210 5′-AGC UACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3′。

1.8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化檢測MVD 與對照組比較，大黃素低、中、高劑量組MVD 均降低（P 均＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組MVD 明顯降低（P 均＜0.05）；中、高劑量組間MVD 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 Western blot 檢測VEGF 表達 與對照組比較，大黃素低、中、高劑量組VEGF 蛋白表達量均下調(diào)（P均＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組VEGF 蛋白表達量明顯下調(diào)（P 均＜0.05），且高劑量組較中劑量組下調(diào)更明顯（P＜0.05），見圖1，表2。

表1 按CD31/CD34 計算微血管密度

表1 按CD31/CD34 計算微血管密度

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；MVD：微血管密度；對照組：生理鹽水腹腔注射；低劑量組：20mg/kg 大黃素腹腔注射；中劑量組：40mg/kg 大黃素腹腔注射；高劑量組：80mg/kg 大黃素腹腔注射；CD：白細胞分化抗原

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組大黃素劑量（mg/kg）0 20 40 80鼠數(shù)10 10 10 10按CD31 計算19.3±1.9 11.7±1.6*7.9±2.3*△7.2±1.8*△按CD34 計算16.5±1.1 12.3±1.8*5.4±1.6*△4.8±1.6*△

圖1 大黃素對VEGF 蛋白表達的影響

表2 大黃素對VEGF 蛋白表達的影響（差異倍數(shù)）

表2 大黃素對VEGF 蛋白表達的影響（差異倍數(shù)）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，▲P＜0.05；對照組：生理鹽水腹腔注射；低劑量組：20mg/kg 大黃素腹腔注射；中劑量組：40mg/kg 大黃素腹腔注射；高劑量組：80mg/kg 大黃素腹腔注射；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組大黃素劑量（mg/kg）0 20 40 80鼠數(shù)10 10 10 10 VEGF 1.000±0.054 0.533±0.039*0.381±0.032*△0.278±0.031*△▲

2.3 qRT-PCR 法檢測microRNA 表達 與對照組比較，大黃素組低、中、高劑量miR-20b、miR-21、miR-155 及miR-210 表達水平均降低（P 均＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組miR-20b、miR-21、miR-210 及高劑量組miR-155 表達水平降低（P 均＜0.05），且高劑量組miR-20b、miR-21、miR-155 及miR-210 表達較中劑量組降低更明顯（P 均＜0.05），見表3。

3 討 論

新生血管的生成對于腫瘤的生長是不可或缺的[6]。腫瘤依靠來自病灶周圍原有的血管提供的營養(yǎng)物質(zhì)生長，隨著腫瘤體積慢慢變大至約1～2mm3時，原有的血管提供的營養(yǎng)物質(zhì)相對不足，刺激腫瘤細胞分泌各種促進新生血管產(chǎn)生的細胞因子。而腫瘤內(nèi)部新血管網(wǎng)絡(luò)的形成，突破了腫瘤繼續(xù)生長的瓶頸。研究表明，大黃素在體內(nèi)外可抑制惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，但大黃素對腫瘤新生血管的研究卻鮮有報道[1-3]。腫瘤的血管密度可以作為預(yù)測患者病情發(fā)展的指標，與腫瘤通過血管的遠處轉(zhuǎn)移亦密切相關(guān)；免疫組化顯示的MVD 和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛力正相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，大黃素各劑量組MVD 較對照組明顯降低（P＜0.05）。這一結(jié)果與之前的文獻報道相一致，因此我們推斷，大黃素可能通過抑制腫瘤血管新生而抑制腫瘤的生長、發(fā)展[4]。

表3 大黃素對microRNA 表達的影響（差異倍數(shù)）

表3 大黃素對microRNA 表達的影響（差異倍數(shù)）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，▲P＜0.05；對照組：生理鹽水腹腔注射；低劑量組：20mg/kg 大黃素腹腔注射；中劑量組：40mg/kg 大黃素腹腔注射；高劑量組：80mg/kg 大黃素腹腔注射；micro RNA：微小RNA

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組大黃素劑量（mg/kg）0 20 40 80鼠數(shù)10 10 10 10 miR-20b 1.000±0.083 1.398±0.128*1.588±0.140*△2.336±0.354*△▲miR-21 1.000±0.212 0.449±0.126*0.240±0.051*△0.147±0.029*△▲miR-155 1.000±0.076 0.581±0.128*0.523±0.071*0.402±0.058*△▲miR-210 1.000±0.104 0.378±0.055*0.239±0.034*△0.185±0.043*△▲

VEGF 是主要的促新生血管因子，它使毛細血管的通透性改變，以纖維蛋白原為主的血漿蛋白到達血管外，為形成新的毛細血管結(jié)構(gòu)提供土壤，而這些毛細血管網(wǎng)最終能為腫瘤細胞的生長帶來豐富的養(yǎng)分；VEGF 的另一個功能是與細胞表面的血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合，通過后續(xù)的細胞信號轉(zhuǎn)導，刺激血管內(nèi)皮細胞分裂增加，數(shù)量增多，從而促進血管的新生[8]。本研究結(jié)果顯示，VEGF 在對照組中高表達，在大黃素組均低表達，且與大黃素濃度相關(guān)。這說明大黃素可能通過抑制VEGF 的表達，使VEGF 與其受體的結(jié)合減少，從而降低其促血管生成的作用。

有研究表明，miR-21 使VEGF 和激活蛋白1（AP1）mRNA 和蛋白的表達增加[9]。miR-21 還可通過負性調(diào)節(jié)RECK 和TIMP3 等金屬蛋白酶（MMPs）抑制劑，導致金屬蛋白酶活化后致使腫瘤侵襲能力增強。Park 等[10]發(fā)現(xiàn)抑制miR-21 或miR-221 的表達與耐藥有關(guān)。在含氧量正常的細胞中，抑制miR-20b 導致缺氧誘導因子1α（HIF-1α）和VEGF 的表達增多，而在缺氧的腫瘤細胞中，miR-20b 增多則使HIF-1α和VEGF 的表達減少[11]。miR-155、miR-210 作為癌基因存在于胰腺癌，具有抗腫瘤凋亡和促進腫瘤細胞的血管新生等作用[12]。miR-210 被證明在腫瘤細胞中與VEGF 同步過表達，并上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGF-R2）和ephrinA3，從而顯著促進缺血區(qū)毛細血管新生。而miR-155 也被報道與Smad 有重要關(guān)系[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可促進miR-20b 的表達，顯著抑制miR-21、miR-155、miR-210 的表達，且與大黃素濃度呈相關(guān)性。大黃素可能通過抑制相關(guān)的microRNA 而抑制腫瘤新生血管的形成，進而抑制胰腺癌原位移植瘤的生長。