木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長的促進(jìn)作用

張愛民， 邢 丹， 梁傳靜， 牟玉梅， 袁 圓

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 辣椒研究所， 貴州 貴陽 550006)

木霉菌(Trichodermaspp.)屬于半知菌亞門，絲孢綱、絲孢目、粘孢菌類，廣泛存在于土壤中，除個(gè)別為弱病原菌外，大多數(shù)對(duì)植物病原真菌有拮抗作用，具有廣譜性、廣泛適應(yīng)性及多機(jī)制性等特點(diǎn)[1]。此外，木霉菌還可通過分泌植物生長激素等物質(zhì)抑制或降解根際有害物質(zhì)或增加養(yǎng)分利用率，促進(jìn)植物生長[2-6]。木霉菌作為主要生防菌已被廣泛開發(fā)利用，固體發(fā)酵是擴(kuò)大生物量，降低生產(chǎn)成本的主要途徑[1]，目前用于木霉菌固體發(fā)酵的原料主要是農(nóng)作物廢棄物及畜禽糞便[7-12]。蠶桑產(chǎn)業(yè)是貴州省的重要產(chǎn)業(yè)之一，2016年統(tǒng)計(jì)表明，貴州省桑園面積約8 000 hm2[13]。2017年蠶桑寫入中央一號(hào)文件，加之全省蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展優(yōu)勢[14]，該產(chǎn)業(yè)有迅猛發(fā)展之勢，但該產(chǎn)業(yè)存在的問題是資源利用率偏低，以桑樹為例，每年桑園產(chǎn)生的過剩桑葉約為13 500 kg/hm2[15]，包括夏伐、春伐及不良桑葉的產(chǎn)生等。桑葉中含有大量營養(yǎng)物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等，在中藥及食品加工中用途廣泛[16]，但利用率低，仍然有大量桑葉被浪費(fèi)，有研究顯示，用康寧木霉發(fā)酵桑葉可顯著提高飼用桑葉的蛋白質(zhì)含量、降低粗纖維含量[17]。由此推測，可利用木霉菌產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶的特點(diǎn)及桑葉的富含蛋白質(zhì)和纖維素的特性生產(chǎn)加工有機(jī)肥，使過剩桑葉得以合理利用，并尋找合適的木霉菌固體發(fā)酵原料，開拓其應(yīng)用途徑，提高利用率。為此，研究以篩選的對(duì)辣椒疫霉菌具有拮抗作用的木霉菌Tr61為供試菌株，以桑葉為原料制備木霉菌固體發(fā)酵物，探究發(fā)酵物作為有機(jī)肥對(duì)辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，為該發(fā)酵物的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 辣椒疫霉菌拮抗木霉菌株Tr61，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒研究所分離純化保存。

1.1.2 桑葉 桑樹下部老葉，采自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒研究所貴陽試驗(yàn)基地。

1.1.3 種子 辣研2號(hào)(朝天椒)，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒研究所選育品種；茄門甜椒，市購。

1.1.4 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)，每升含馬鈴薯浸出粉3 g，葡萄糖13.3 g。

1.1.5 儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、小型液體發(fā)酵罐(5 L)、粉碎機(jī)、超聲波清洗儀、高壓滅菌鍋等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 木霉菌Tr61液體發(fā)酵。采用小型發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵液為PD。培養(yǎng)條件：28℃，初始pH 5.9，120 r/min，DO160，發(fā)酵7 d。其中一部分混合發(fā)酵液將菌絲打碎，制成固體發(fā)酵菌種，用作固體發(fā)酵；另一部分過濾去菌絲，濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 桑葉自然發(fā)酵。采集桑樹下部老葉，自然堆置發(fā)酵，待桑葉完全腐爛變黑為止，收集發(fā)酵過程的滲出液，備用。

3) 木霉菌Tr61桑葉固體發(fā)酵物浸提液的制備。稱取200 g桑葉烘干粉碎、高壓滅菌，加入上述固體發(fā)酵菌種1 000 mL，拌勻，放入淺盤，覆蓋保鮮膜，28℃發(fā)酵15 d。稱取固體發(fā)酵物20 g，加入無菌水200 mL，50℃超聲提取1 h，8層紗布過濾后，再用濾紙過濾，取濾液備用。

1.2.2 浸提液對(duì)種子萌發(fā)的影響 試驗(yàn)設(shè)8個(gè)處理： 1) 對(duì)照(CK1)，無菌水。2) CH，高壓滅菌馬鈴薯葡萄糖(PD)溶液(參比對(duì)照)，即PD溶液稀釋10倍，高壓滅菌。3) TF，木霉菌PD發(fā)酵液過濾液用0.2 μm無菌濾膜抽濾后，用無菌水稀釋10倍。4) TH，木霉菌PD發(fā)酵液過濾液稀釋10倍，高壓滅菌。5) MF，桑葉發(fā)酵液抽濾滅菌后稀釋10倍。6) MH，桑葉發(fā)酵液稀釋10倍，高壓滅菌。7) MTF，桑葉發(fā)酵物浸提液濾液抽濾滅菌，稀釋10倍。8)MTH，木霉菌桑葉發(fā)酵物浸提液濾液稀釋10倍，高壓滅菌。

將種子用55℃左右溫水浸種15 min后晾干。在9 cm培養(yǎng)皿中鋪2層滅菌濾紙，每個(gè)處理加入相應(yīng)的溶液10 mL，種子50粒，浸泡24 h后棄去多余的溶液，3次重復(fù)。每天觀測記錄發(fā)芽種子數(shù)，視濾紙干濕程度加入相應(yīng)的溶液保持濾紙濕潤。

觀測指標(biāo)：從開始發(fā)芽起，每天觀察并記錄種子發(fā)芽數(shù)，第14天試驗(yàn)結(jié)束；每皿隨機(jī)抽取10株測量胚根長、胚軸長，計(jì)算發(fā)芽率(GR)、發(fā)芽勢(GP)、發(fā)芽指數(shù)(PI)和胚根長/胚軸長。

GR=正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

GP=第7天供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

PI=1.00nd2+0.75nd4+0.5nd6+0.25nd8

式中，nd2、nd4、nd6及nd8分別表示第2天、第4天、第6天和第8天時(shí)的種子發(fā)芽率[18]。

1.2.3 木霉菌Tr61固體發(fā)酵物對(duì)辣椒幼苗生長的影響 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：對(duì)照(CK2)，純育苗基質(zhì)；T1，育苗基質(zhì)+木霉菌桑葉發(fā)酵物，W∶W =10∶1；T2，育苗基質(zhì)(干重880 g)+木霉菌分生孢子懸浮液1 000 mL(孢子懸浮液濃度為1×106個(gè)/mL)；T3，育苗基質(zhì)+桑葉自然發(fā)酵物，W∶W =10∶1。采用漂浮育苗法育苗，各處理每個(gè)品種辣椒播種160粒種子，28℃培養(yǎng)，播種后第20天記錄成苗數(shù)，第45天每個(gè)處理隨機(jī)選取30株測量幼苗莖粗、株高、根長、葉長、葉寬及真葉數(shù)等指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖，用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液對(duì)辣椒種子萌發(fā)的影響

從圖1看出，不同溶液處理辣研2號(hào)和茄門甜椒種子的萌發(fā)狀況。

2.1.1 發(fā)芽率 不同溶液處理辣研2號(hào)種子的發(fā)芽率依次為MTH(99.33%)>MF(98.67%)=TF(98.67%)>MH(98.00%)=CH(98.00%)>CK1(97.33%)>TH(96.67%)>MTF(96.00%)；茄門甜椒種子的發(fā)芽率依次為MTF(87.33%)=TH(87.33%)>CH(84.67%)>MF(81.33%)>MH(80.67%)>TF(78.67%)>MTH(78.00%)>CK1(77.33%)。相同溶液處理辣研2號(hào)種子的發(fā)芽率均較茄門甜椒高。方差分析表明，同一品種辣椒種子的發(fā)芽率各處理間無顯著差異。

2.1.2 發(fā)芽勢 辣研2號(hào)種子的發(fā)芽勢以MTH最高，為96.00%；其余處理發(fā)芽勢為MTF(92.00%)>CK1(88.00%)>MH(87.33%)>CH(84.00%)>TH(76.00%)>MF(68.67%)>TF(64.67%)；MTF、MTH與CK1、MH無顯著差異，但二者與其他處理差異顯著；TF的發(fā)芽勢除與MF的差異不顯著外，與其余處理間均存在顯著差異。茄門甜椒種子的發(fā)芽勢為TH(69.33%)>MH(66.00%)>MF(64.67%)>MTF(64.00%)>MTH(61.33%)>CK1(57.33%)>CH(56.00%)>TF(53.33%)。相同溶液處理辣研2號(hào)種子的發(fā)芽勢較茄門甜椒高。

2.1.3 發(fā)芽指數(shù) 不同處理辣研2號(hào)種子發(fā)芽指數(shù)的變化趨勢與發(fā)芽勢相似，MTF和MTH的發(fā)芽指數(shù)分別為50.43和49.75，除與MH(45.87)、CK1(44.79)間差異不顯著，與其余處理間差異顯著；TF與TH差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。各處理茄門甜椒的發(fā)芽指數(shù)變化趨勢與辣研2號(hào)相似，在TF處理下最低(19.56)，但各處理間無顯著差異。相同溶液處理辣研2號(hào)種子的發(fā)芽指數(shù)均較茄門甜椒高。

注：圖中不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different treatments in the same variety (P<0.05).The same below.

圖1木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液處理辣椒種子的萌發(fā)狀況

Fig.1 Germination of pepper seeds treated with extract liquid ofTrichodermaTr61 + mulberry leaf fermentation broth

2.2 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物及其浸提液對(duì)辣椒幼苗生長的影響

2.2.1 胚軸長和胚根長 試驗(yàn)后期由于茄門甜椒種子及幼苗霉?fàn)€較多，未進(jìn)行胚根長及胚軸長測定。從圖2可知，各處理辣研2號(hào)胚根長、胚軸長和胚根長/胚軸長的變化趨勢。各處理胚軸長和胚根長的變化趨勢相似，CH的胚軸長和胚根長最長，分別為3.51 cm和3.53 cm，與MTF(3.39 cm、3.05 cm)差異不顯著，與MTH(2.74 cm、2.72 cm)差異顯著；MTF和MTH的胚軸長分別為3.39 cm和2.74 cm，胚根長分別為3.05 cm和2.72 cm，顯著大于CK1(2.36 cm和1.66 cm)，MTF和MTH的胚軸長分別比CK1提高44.00%和16.10%，胚根長分別高84.00%和64.06%，胚根長/胚軸長分別高29.00%和46.13%。MH和MF間差異不顯著，二者的胚軸長、胚根長和胚根長/胚軸長比值顯著小于其余處理。

2.2.2 種子成苗率 由表1可知，基質(zhì)中不同的添加物對(duì)辣椒種子成苗率均有一定影響，辣研2號(hào)和茄門甜椒2個(gè)品種的成苗率均以CK2最高，分別為68.75%和69.38%，其中T1比CK2分別降低24.54%和23.42%。辣研2號(hào)T1和T3的成苗率相當(dāng)，略高于T2；茄門甜椒T2和T3的成苗率相當(dāng)，略高于T1。

圖2 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液處理辣研2號(hào)幼苗種胚的生長狀況

表1木霉菌Tr61發(fā)酵物處理辣椒種子的成苗率

Table 1 Seedling rate of pepper seeds treated withTrichodermaTr61 fermentation product

處理Treatment辣研2號(hào)Layan 2苗數(shù)/株成苗率/%茄門甜椒Sweet pepper苗數(shù)/株成苗率/%CK211068.7511169.38 T1 8351.88 8553.13 T2 7546.88 10364.38 T3 8855.0010867.50

2.2.3 幼苗農(nóng)藝性狀 從表2可知，添加不同物質(zhì)的育苗基質(zhì)對(duì)辣椒幼苗農(nóng)藝性狀的影響存在一定差異。

1) 莖粗。辣研2號(hào)幼苗莖粗CK2最小，與其余各處理間差異顯著，T1比CK2提高30.89%；T3莖粗最大，平均直徑為1.78 cm，與T1和T2差異顯著，說明育苗基質(zhì)+桑葉自然發(fā)酵物有利于辣研2號(hào)幼苗生長。茄門甜椒的變化與辣研2號(hào)相似，CK2幼苗莖粗最小，其余各處理的莖粗平均值均為1.54 cm，與CK2差異顯著，其中T1比CK2提高11.59%。說明，育苗基質(zhì)+木霉菌桑葉發(fā)酵物，育苗基質(zhì)(干重880 g)+木霉菌分生孢子懸浮液1 000 mL以及育苗基質(zhì)+桑葉自然發(fā)酵物均可促進(jìn)茄門甜椒幼苗生長。

2) 株高。辣研2號(hào)和茄門甜椒均以T1幼苗的株高最高，分別為11.19 cm和8.71 cm，分別比CK2提高58.72%和61.90%，較同一品種其余處理差異顯著；T3其次，為10.54 cm和7.92 cm；CK2最低，為7.05 cm和5.38 cm。說明，育苗基質(zhì)+木霉菌桑葉自然發(fā)酵物有利于2種辣椒幼苗株高增高。

表2 木霉菌Tr61發(fā)酵物處理辣椒幼苗的生長情況

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05 level.

3) 根長。辣研2號(hào)的根長依次為T3(8.45 cm)>T1(6.56 cm)>CK2(4.93 cm)>T2(3.65 cm)，T3與其余處理間差異顯著；T1比CK2提高33.06%，顯著高于CK和T2。茄門甜椒的根長依次為CK2>T2>T1>T3，CK2和其余處理間差異顯著，其中，T1比CK2下降39.62%，但其余3個(gè)處理間差異不顯著。

4) 葉長和葉寬。2個(gè)品種的葉長和葉寬變化趨勢相似。辣研2號(hào)的葉長和葉寬為T3>T2>T1>CK2，T3與其余處理間存在顯著差異。茄門甜椒均表現(xiàn)為T2>T3>CK2>T1，T2與其余處理間存在顯著差異。說明，育苗基質(zhì)+桑葉自然發(fā)酵物有利于辣研2號(hào)葉的生長，而育苗基質(zhì)(干重880 g)+木霉菌分生孢子懸浮液1 000 mL有利于茄門甜椒葉的生長。

5) 真葉數(shù)。辣研2號(hào)的真葉數(shù)依次為T3(9.43片)>T2(7.70片)>CK2(7.57片)>T1(7片)，T3和CK2分別與其余處理差異顯著。茄門甜椒的真葉數(shù)依次為CK2(5.73片)>T1(5.30片)=T2(5.30片)>T3(5.00片)，CK2與其余處理間差異顯著。

3 結(jié)論與討論

3.1 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用

發(fā)芽率反映種子的生活力，發(fā)芽勢主要體現(xiàn)種子的發(fā)芽速率和整齊度，發(fā)芽指數(shù)則是反映種子的萌發(fā)速率和整齊度的另一個(gè)重要指標(biāo)。研究結(jié)果表明，各溶液處理2個(gè)辣椒品種種子的發(fā)芽率較清水對(duì)照(CK1)的變化不顯著，說明，木霉菌發(fā)酵液、桑葉自然發(fā)酵浸提液和木霉菌桑葉發(fā)酵物浸提液對(duì)辣椒種子的生活力沒有影響；各溶液處理辣研2號(hào)種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)出現(xiàn)顯著差異，2個(gè)指標(biāo)均以TF(抽濾滅菌木霉菌發(fā)酵液)最低，并且顯著低于CH(高壓滅菌PD溶液)，說明溶液中的葡萄糖并不是影響種子萌發(fā)的重要因素，而可能是木霉菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了對(duì)種子萌發(fā)有抑制作用的物質(zhì)。MTF和MTH(高壓滅菌木霉菌桑葉發(fā)酵物浸提液)的種子發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)均高于其余處理，可能是因?yàn)槟久咕Ｈ~發(fā)酵的產(chǎn)物中存在能夠促進(jìn)種子萌發(fā)的物質(zhì)。整體看，茄門甜椒的種子發(fā)芽狀況較辣研2號(hào)差，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均明顯低于辣研2號(hào)，且3個(gè)指標(biāo)在各處理間均無顯著變化，可能與辣椒種子質(zhì)量有關(guān)，種子生活力較差的情況下，生長促進(jìn)或抑制物對(duì)該種子的萌發(fā)無明顯作用。

不同溶液對(duì)辣研2號(hào)種子萌發(fā)后胚根和胚軸生長的影響存在顯著差異。其中，MH(高壓滅菌桑葉發(fā)酵液)和MF胚根和胚軸長均低于CK1，三者間差異不顯著，但三者均低于其余各處理；MH和MF低于CK1可能是因?yàn)榻嵋褐械哪承┪镔|(zhì)抑制了培根和胚軸的生長。MTF和MTH的胚根長和胚軸長顯著高于MH和MF，可能是因?yàn)槟久咕l(fā)酵桑葉過程中消耗了對(duì)幼苗生長有抑制作用的物質(zhì)。CH與TH(高壓滅菌木霉菌PD發(fā)酵液)、TF的胚軸長和胚根長均較高，可能與溶液中含有一定量的葡萄糖有關(guān)。

總之，當(dāng)種子具有較好的生活力時(shí)，木霉菌桑葉發(fā)酵物的浸提液有利于提高種子萌發(fā)的整齊度，并且對(duì)胚根和胚軸生長具有一定的促進(jìn)作用，其作用均優(yōu)于木霉菌液體發(fā)酵液或桑葉自然發(fā)酵物的浸提液。說明，桑葉可以作為木霉菌發(fā)酵的原材料，可用于生產(chǎn)木霉菌生物有機(jī)肥，也可為桑葉的有效利用提供一條新途徑。

3.2 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物對(duì)辣椒幼苗生長的促進(jìn)作用

育苗基質(zhì)中添加其他物質(zhì)均使辣椒成苗率有所降低，原因可能是發(fā)酵產(chǎn)物中的物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)有一定抑制作用。其中，基質(zhì)+木霉菌桑葉發(fā)酵物與基質(zhì)+木霉菌分生孢子懸浮液處理的種子成苗率較其余2個(gè)處理的成苗率低，結(jié)合發(fā)酵物浸提液對(duì)辣椒種子萌發(fā)試驗(yàn)中TH和TF對(duì)辣椒種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響看，木霉菌對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用的可能性較大。

育苗基質(zhì)中添加其他物質(zhì)各處理的其他測定指標(biāo)較純育苗基質(zhì)(CK2)均有一定的提升，尤其是莖粗和株高，3個(gè)處理的測定值均高于CK2，說明在幼苗生長后期，不同的添加物可能發(fā)揮了一定效用，促進(jìn)了幼苗地上部分的生長，尤其是真葉數(shù)的增加。說明，在相同時(shí)間內(nèi)，桑葉自然發(fā)酵物的添加可能對(duì)縮短苗齡，促進(jìn)幼苗快速生長有一定作用。

研究結(jié)果表明，木霉菌或桑葉發(fā)酵物對(duì)辣椒種子萌發(fā)可能有一定的抑制作用，而對(duì)幼苗生長具有一定的促進(jìn)作用，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵物中存在抑制種子萌發(fā)和促進(jìn)幼苗生長的物質(zhì)，也可能是有機(jī)物添加過多造成了燒苗現(xiàn)象。因此，有機(jī)物的添加比例和添加時(shí)期還有待于進(jìn)一步研究。