O3氧化黑碳對SH-SY5Y 細(xì)胞的毒性作用

尚 羽, 王田田, 吳美英, 王 璐, 何慧心, 安 靜

(上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染與健康研究所, 上海200444)

由燃燒排放的BC 顆粒呈蓬松狀,比表面積大,具有很強的吸附能力,極易吸附大氣中的污染物質(zhì), 包括重金屬、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、二英、多溴聯(lián)苯醚等[7]. 大氣中BC 顆粒的粒徑范圍變化較大,從幾個納米到幾個微米.粒徑小于100 nm 的超細(xì)BC 顆粒物可以通過人類呼吸道進入肺組織, 然后通過肺泡上皮細(xì)胞進入血液循環(huán), 甚至進入其他器官組織, 例如肝臟等[8].對木材和柴油燃燒產(chǎn)生的顆粒進行毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 顆粒物表面吸附的有機物, 如PAHs 和水溶性有機物等, 是這些顆粒物產(chǎn)生毒性效應(yīng)的直接原因, 而燃燒產(chǎn)生的BC 顆粒只作為這些有機物的載體[9-10]. 新鮮排放的BC(fresh BC, FBC)顆?？杀淮髿庋趸瘎?如O3, NOx等)氧化, 其表面理化特征和吸附化學(xué)物質(zhì)都將發(fā)生改變. 如何表征大氣氧化過程對BC 顆粒物化性質(zhì)及健康影響的作用, 成為近年該領(lǐng)域重點的關(guān)注內(nèi)容.

使用商品化的納米級BC 顆粒為模型, 通過體內(nèi)外的動物和細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn), BC 顆?？芍苯釉斐缮矬w肺組織和細(xì)胞的損傷[11]. 除呼吸系統(tǒng)外, BC 顆粒還能誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)[12]. 動物實驗發(fā)現(xiàn), 納米級BC 顆粒暴露可長期活化小鼠大腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞, 進而誘發(fā)退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[13]. 研究在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞體系, 發(fā)現(xiàn)BC 顆粒可以通過激活連接蛋白通道, 誘導(dǎo)谷氨酸鹽和ATP 的釋放[14]. 這些研究都說明, BC 顆粒具有神經(jīng)系統(tǒng)毒性, 但其具體的致毒機制尚未明確.

由于BC 顆粒在大氣中的氧化過程比較復(fù)雜, 因此關(guān)于BC 顆粒經(jīng)O3氧化后, 其細(xì)胞毒性如何發(fā)生變化, 目前尚沒有定論[15]. 本工作以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 作為細(xì)胞模型, 探討經(jīng)O3氧化過的BC(O3-oxidized BC, OBC)顆粒對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用;應(yīng)用MTT 方法測定細(xì)胞存活率, 探討OBC 顆粒對細(xì)胞增殖能力的影響; 利用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LHD)漏出率表征細(xì)胞膜的損傷程度; 利用流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡比例; 通過熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度. 本工作以期為深入探討B(tài)C 顆粒的神經(jīng)毒性, 解釋大氣中BC 顆粒對健康的影響提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

SH-SY5Y 為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞, 來源于1970 年建立的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的轉(zhuǎn)移骨瘤細(xì)胞SK-N-SH 經(jīng)3 次克隆后的亞系, 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫. 納米級BC 顆粒(Printex U, 粒徑30 nm)可以非常好地模擬柴油燃燒排放的焦炭物質(zhì)[16], 購自Degussa 公司(德國),按照文獻(xiàn)[17]的方法進行O3氧化, 獲得OBC 顆粒, 氧化過程保持O3濃度為0.01%. 反應(yīng)時間為120 min. DMEM 購自HyClone 公司(美國). 胎牛血清購自PAA laboratories GmbH 公司(奧地利). LDH 試劑盒, 購自南京建成生物技術(shù)有限公司. 細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶均購自康寧公司(Corning, 美國). 其他試劑(分析純)購自上海國藥集團化學(xué)試劑公司.

本工作所用儀器如下: 正置熒光顯微鏡(BX51 型, Olympus 公司, 日本); iMark-680 型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD公司, 美國); 高速分選型流式細(xì)胞儀(Beckman coulterter, 香港); 倒置生物顯微鏡(Olympus, CKX41, 日本); CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder 公司, 德國).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和染毒

SH-SY5Y 細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基, 在5% CO2和37?C 的恒溫恒濕條件下培養(yǎng). 單層細(xì)胞達(dá)到80%以上時, 按1∶4～1∶3 的比例傳代培養(yǎng).

在對數(shù)生長期, 用胰蛋白酶消化后, 離心, 重新懸浮, 接種于96 孔板(每孔3×103個細(xì)胞)、24 孔板(每孔1×104個細(xì)胞)、6 孔板(每孔5×104個細(xì)胞)以及35 mm 培養(yǎng)皿(每孔5×104個細(xì)胞), 分別供MTT 實驗、LDH 實驗、細(xì)胞凋亡分析和Ca2+濃度檢測實驗. 接種后隔夜令細(xì)胞貼壁生長, 棄培養(yǎng)基. 使用D-Hanks 清洗兩次, 加入含有OBC 顆粒的培養(yǎng)基進行染毒,1～48 h 后檢測. 根據(jù)24 和48 h 的細(xì)胞存活率,篩選OBC 顆粒染毒濃度分別為0, 5, 10, 20,40 μg/mL 的樣品. 每個濃度設(shè)置3～6 個平行樣, 實驗重復(fù)3 次.

1.3 MTT 實驗

染毒結(jié)束后棄去上清液, 使用D-Hanks 溶液清洗2 次, 每孔加入0.1 mL 用培養(yǎng)液稀釋10 倍的MTT 溶液, 37?C 繼續(xù)培養(yǎng)4 h. 棄上清液, 每孔加入100 μL DMSO, 室溫下振蕩10 min, 之后使用酶標(biāo)儀檢測OD490值. 細(xì)胞存活率的計算公式如下:

（1）進口學(xué)習(xí)效應(yīng)：進口中間產(chǎn)品內(nèi)化了進口來源企業(yè)的研發(fā)努力與知識，同時經(jīng)過進口的方式外溢到下游生產(chǎn)企業(yè)，減弱了企業(yè)研發(fā)新產(chǎn)品的成本；由于新產(chǎn)品里具備高層次水平的質(zhì)量和技術(shù)成分，提升了企業(yè)對新產(chǎn)品的收益估值，再次刺激了企業(yè)研發(fā)行為。雖然無法全部替換掉差異化產(chǎn)品以及產(chǎn)品類型中內(nèi)化的技術(shù)以及信息，但隨著進口中間產(chǎn)品多樣性的提高，進口學(xué)習(xí)效應(yīng)也會逐漸增強。

式中, 實驗組為OBC 顆粒染毒組, 溶劑對照組為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞, 空白對照組為培養(yǎng)基組(未加入細(xì)胞).

1.4 LDH 活性檢測

染毒結(jié)束后, 吸取上層培養(yǎng)液至1.5 mL 的EP 管中, 離心5 min(1 200 r/min). 棄下層顆粒, 取100 μL 上清至EP 管中, 按照LDH 試劑盒的說明書依次加入相關(guān)試劑. 吸取最后一步所得溶液, 加至96 孔平底培養(yǎng)板中(每孔加200 μL). 用iMark-680 型酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度(D), 波長為440 nm. 記錄數(shù)據(jù), 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得LDH 濃度.

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測

染毒結(jié)束后, 棄上層培養(yǎng)液, 用無EDTA 的胰蛋白酶消化, 重新懸浮細(xì)胞收集于1.5 mL 離心管中. 3 000 r/min 離心3 min, 棄上清. 使用預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞, 3 000 r/min 離心3 min, 棄上清. 加入100 μL 的Binding Buffer 和2.5 μL 的Annexin V-FITC, 混勻后于室溫避光孵育15 min, 進行Annexin V-FITC 標(biāo)記. 使用Binding Buffer 洗滌, 并重新懸浮細(xì)胞. 再加入100 μL 的Binding Buffer 和5 μL 的PI, 室溫避光孵育5 min, 進行PI 標(biāo)記. 補加Binding Buffer 至500 μL, 在1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測.

1.6 Ca2+濃度測定

染毒結(jié)束后, 棄上層培養(yǎng)液. 用D-Hanks 溶液洗滌細(xì)胞3 次, 加入已被D-Hanks 稀釋的Fluo 3-AM(終濃度為5μmol/L),37?C 孵育45 min. 棄去Fluo 3-AM 工作液,用D-Hanks 溶液洗滌3 次, 以充分去除殘留的Fluo 3-AM. 加入D-Hanks 溶液覆蓋細(xì)胞, 37?C 孵育20 min,以確保AM 在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化, Fluo 3-AM 在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成Fluo 3. 使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞,激發(fā)波長為494 nm,發(fā)射波長為516 nm. 每個平行樣選取5～10 張照片,使用Ipwin32 圖像分析軟件分析熒光強度, 取其平均值. Ca2+水平用光密度值來表示, 并將所得結(jié)果與對照組做歸一化處理. 值得注意的是, 加入Fluo 3-AM 后所有操作都需要避光進行, 以免探針降解.

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)”的方式表示, 采用Microsoft Office Excel 2007 軟件進行分析和檢驗, 各指標(biāo)組間差異采用t 檢驗法進行統(tǒng)計, 顯著性水平以*p ＜0.05,**p ＜0.01 為判斷標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞存活率

圖1 為OBC 顆粒染毒24 和48 h 后,SH-SY5Y 細(xì)胞的存活率.使用不同濃度(0～40μg/mL)的OBC 顆粒進行染毒后, SH-SY5Y 細(xì)胞的存活率有不同程度的下降, 并呈現(xiàn)出統(tǒng)計差異的劑量-效應(yīng)關(guān)系(**p ＜0.01). OBC 顆粒染毒24 和48 h 后, 對SH-SY5Y 細(xì)胞的半致死濃度(LC50)分別為202.2 和133.3 μg/mL(通過線性回歸模型計算). 隨著染毒時間從24 h 增加到48 h, LC50值有所下降, 說明OBC 顆粒對SH-SY5Y 的細(xì)胞毒性隨著染毒時間的增加而增強.

圖1 OBC 顆粒濃度對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Cell viability of SH-SY5Y cells after treated with different concerntrations of OBC particles

2.2 LDH 活性

圖2 為OBC 顆粒染毒24 h 后, SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 的濃度水平. 可見, OBC 顆粒染毒24 h 后, 胞外LDH 的濃度顯著升高, 亦呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(**p ＜0.01), 說明OBC 顆粒暴露導(dǎo)致明顯的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷.

2.3 細(xì)胞凋亡

使用不同濃度(0, 5, 10, 20 和40 μg/mL)的OBC 顆粒. 染毒24 h 后, 經(jīng)流式細(xì)胞儀分析, 細(xì)胞凋亡率如圖3 所示. 可見, OBC 顆?？蓪?dǎo)致SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡, 且隨著染毒劑量的增加, 凋亡率不斷上升, 呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系(**p ＜0.01). 在最高染毒劑量40 μg/mL 組, 細(xì)胞凋亡率達(dá)到7.0%(**p ＜0.01).

2.4 Ca2+濃度

圖4 為OBC 顆粒對SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響. 可見, 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度隨染毒時間的增加呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢. 在染毒1～4 h 內(nèi), Ca2+濃度升高最顯著; 染毒6 h 后,Ca2+濃度逐漸回歸到正常水平. 染毒1 和4 h, 隨著OBC 劑量的升高, 呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(**p ＜0.01).

圖2 OBC 顆粒濃度對SH-SY5Y 細(xì)胞LDH 水平的影響Fig.2 LDH release of SH-SY5Y cells after treated with different concerntrations of OBC particles

圖3 OBC 顆粒濃度對SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Apoptosis in SH-SY5Y cells induced by different concerntrations of OBC particles

圖4 OBC 染毒時間對SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響Fig.4 Ca2+ levels in SH-SY5Y cells induced by OBC exposure time

3 討 論

MTT 方法, 又稱為MTT 比色法, 可用于檢測細(xì)胞的增殖活性. 在體外培養(yǎng)細(xì)胞體系中,MTT 方法是評價外源物總體毒性的常規(guī)方法[18]. LDH 存在于機體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),當(dāng)細(xì)胞受到外源性刺激, 導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞通透性增強后, LDH 可從細(xì)胞質(zhì)中泄出至細(xì)胞外的培養(yǎng)基中. 通過檢測培養(yǎng)液中LDH 的濃度水平, 可以指示細(xì)胞受損傷的程度. 因此, 培養(yǎng)基中LDH 濃度亦可用于表征外源性物質(zhì)的毒性大小[18]. 實驗結(jié)果表明: 經(jīng)OBC 顆粒染毒24 和48 h 后, SH-SY5Y 細(xì)胞的增殖能力被顯著抑制, 呈現(xiàn)劑量和時間-效應(yīng)關(guān)系; 染毒24 h 后,SH-SY5Y 細(xì)胞膜顯著受損, 亦呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.

An等[15]研究了OBC 顆粒對人肺上皮細(xì)胞A549 的毒性作用. 結(jié)果發(fā)現(xiàn), OBC 顆粒在染毒24 h 后, 可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA 損傷和細(xì)胞死亡. Li等[17]的研究也發(fā)現(xiàn), OBC 顆?？梢栽斐葾549 細(xì)胞和16HBE 細(xì)胞顯著的毒性效應(yīng), 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激, 造成細(xì)胞死亡. 以上研究中OBC 顆粒暴露24 h 導(dǎo)致細(xì)胞死亡的半致死濃度在100～200 μg/mL 之間, 與本研究結(jié)果基本一致.

檢測細(xì)胞凋亡的方法眾多. 本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡, 可以對發(fā)生凋亡的細(xì)胞進行準(zhǔn)確計數(shù), 是一種常用的檢測方法. 研究結(jié)果顯示, OBC 顆粒可誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡, 且隨著染毒劑量的增加, 凋亡率不斷上升. 在最高劑量40 μg/mL 時, 凋亡率達(dá)到7.0%, 顯著高于對照細(xì)胞, 具有統(tǒng)計學(xué)意義(**p ＜0.01). 有文獻(xiàn)報道, OBC 顆?？烧T導(dǎo)人肺上皮A549 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和DNA 損傷[15], 與本研究結(jié)果一致.

Ca2+是機體內(nèi)主要的細(xì)胞信使之一, 參與調(diào)控許多細(xì)胞的生理活動, 包括細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡等. 有研究表明, Ca2+可能參與了大氣顆粒物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng). Brown等[19]發(fā)現(xiàn), 大氣顆粒物既可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度又可促進活性氧的產(chǎn)生.Sakamoto等[20]發(fā)現(xiàn), PM10可增加人支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度, 并且與炎癥因子IL-1β 和IL-8 的釋放有一定關(guān)聯(lián). 本研究發(fā)現(xiàn), BC 顆?？蓪?dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y 中Ca2+濃度的增加, 染毒4 h, Ca2+濃度達(dá)到最高峰. 之后隨著染毒時間增加, Ca2+濃度逐漸趨于正常細(xì)胞. 動物和細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn), BC 顆?？梢酝ㄟ^激活連接蛋白通道, 誘導(dǎo)谷氨酸鹽和ATP 的釋放, 進而活化小鼠大腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞, 誘發(fā)退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[13-14]. 本研究提示, 信號分子Ca2+可能在BC 顆粒誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的過程中起重要的調(diào)控作用, 值得進一步深入探討.

大氣顆粒物對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用, 已經(jīng)在一些動物和細(xì)胞體系中得到證實. BC 顆粒是大氣顆粒物重要的組成部分. 本研究結(jié)果提示, OBC 顆?？梢哉T導(dǎo)體外神經(jīng)細(xì)胞Ca2+釋放,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡, 進而在顆粒物導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程中起重要作用. 隨著經(jīng)濟和工業(yè)的迅速發(fā)展, 化石燃料的消耗增長, 大氣中BC 顆粒的排放會不斷增加. 有調(diào)研資料表明, 一些城市地區(qū)的大氣中BC 顆粒的濃度處于較高水平[21]. 因此, 要更加關(guān)注城市大氣中BC 顆粒的濃度水平與其相應(yīng)的健康影響.

4 結(jié) 論

(1) OBC 顆?？娠@著抑制SH-SY5Y 細(xì)胞的增殖, 造成細(xì)胞膜的損傷.

(2) OBC 顆?？烧T導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生凋亡, 呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系, 并能顯著增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度.

(3) OBC 顆粒體外暴露可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷, 胞內(nèi)Ca2+濃度增加, 最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.