保健酒與口服液中他達(dá)拉非類藥物微孔側(cè)流免疫層析檢測方法研究

鄒婷婷 楊金易 徐振林 王弘 孫遠(yuǎn)明 雷紅濤 譚學(xué)才 沈玉棟

摘 要：采用共有骨架結(jié)構(gòu)結(jié)合不飽和線性手臂半抗原策略，通過免疫新西蘭大白兔獲得了可同時識別他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非和去甲基他達(dá)拉非的特異性多克隆抗體，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了微孔側(cè)流免疫層析方法，用于保健酒及口服液樣品中非法添加的他達(dá)拉非類藥物殘留的快速檢測。本方法定量檢出限為0.05～0.30 ng/mL， 裸眼消線值在50～100 ng/mL之間，檢測時間小于10 min;與其它結(jié)構(gòu)功能類似物無明顯交叉反應(yīng)，特異性良好。對保健酒及口服液樣品的添加回收率在78.7%～117.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。本方法檢測結(jié)果與HPLCMS/MS法檢測結(jié)果一致，適用于保健酒及口服液中他達(dá)拉非類藥物的快速篩查。

關(guān)鍵詞：他達(dá)拉非; 微孔側(cè)流免疫層析; 保健酒及口服液; 半抗原; 多克隆抗體

1 引 言

他達(dá)拉非（Tadalafil）是一種5型磷酸二酯酶（Phosphodiesterase 5， PDE5）抑制劑，具有治療男性陰莖勃起功能障礙（Erectile dysfunction， ED）的作用[1]，作為處方藥已在多個國家上市。但他達(dá)拉非類藥物對人體的心血管、消化和神經(jīng)系統(tǒng)存在一定副作用，特別在不知情的情況下，與硝酸酯類藥物同時食用，會對食用者健康和生命造成嚴(yán)重威脅[2]。因此，2012年國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了“食藥監(jiān)辦?；躘2012＼]33號”文件，明確禁止在保健品中添加他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非PDE5抑制劑。然而，利益的驅(qū)動導(dǎo)致壯陽抗疲勞類保健品中非法添加他達(dá)拉非類藥物現(xiàn)象仍屢有發(fā)生[3，4]，且為了規(guī)避執(zhí)法檢查，還推出了他達(dá)拉非結(jié)構(gòu)類似物—去甲基他達(dá)拉非[5]。因此，建立他達(dá)拉非類藥物多殘留檢測方法具有重要的實(shí)際意義。

目前，他達(dá)拉非類藥物非法添加的檢測方法主要為實(shí)驗(yàn)室大型儀器確證技術(shù)，如高效液相色譜法[6，7]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[9]等。 但單一大型儀器確證技術(shù)難以對食品進(jìn)行高效的監(jiān)測， 而基于抗原與抗體免疫識別的快速篩查方法作為與之互補(bǔ)的檢測技術(shù)，已成為食品安全高效檢測的不可或缺主流快速檢測手段。微孔側(cè)流免疫層析技術(shù)（Microwell lateral flow immunochromatography， mwLFIA）作為一種新型免疫層析技術(shù)，具有靈敏度高、操作簡便、耗時短的優(yōu)點(diǎn)。該方法是對傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)的改進(jìn)，其原理是：先使游離的待測物和標(biāo)記抗體在微孔中均相溶解后充分反應(yīng)，然后再通過層析至固相載體上的包被抗原進(jìn)行快速捕獲金標(biāo)抗體而聚集顯色，微孔中游離待測物和金標(biāo)抗體反應(yīng)越充分，游離的金標(biāo)抗體越少，固相載體上包被原捕獲的金標(biāo)復(fù)合物越少，顯色就越淺，檢測靈敏度越高。該技術(shù)作為儀器確證法的快速篩查互補(bǔ)方法，引起研究者的廣泛關(guān)注?；谠撛?，研究者已經(jīng)建立了牛奶基質(zhì)中喹諾酮類藥物和苯并咪唑類化合物的多殘留微孔側(cè)流免疫層析檢測技術(shù)[10，11]，檢出限分別為0.1 和0.77 ng/mL，靈敏度高，適用于實(shí)際樣品的檢測。然而，目前同時檢測他達(dá)拉非類藥物的mwLFIA方法還未見報道。

本研究采用共有骨架結(jié)構(gòu)結(jié)合不飽和線性手臂半抗原策略[12]（圖1），最大限度保留他達(dá)拉非骨架結(jié)構(gòu)，通過免疫新西蘭大白兔，制備可同時識別他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非和去甲基他達(dá)拉的非特異性多克隆抗體，并基于微孔側(cè)流免疫層析技術(shù)，建立了可檢測他達(dá)拉非類藥物的側(cè)流免疫分析方法，為食品安全監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 儀器與試劑

U3010紫外可見光譜儀（日本 Hitachi 公司）; HM3030 XYZ三維劃膜噴金儀和CTD300數(shù)控裁條機(jī)（上海金標(biāo)生物科技有限公司）; MD100金標(biāo)熒光二合一免疫檢測儀（南京微測生物科技有限公司）; AB SCIEX 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）; 5417R高速離心機(jī)（德國 Eppendorf 公司）; NEVAP氮吹儀（德祥科技有限公司）。

半抗原H1、H2、20 nm金納米粒子（Au nanoparticles， AuNPs）溶液（本實(shí)驗(yàn)室自制）; 馬來酸酐、他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非、去甲基他達(dá)拉非及西地那非類藥物（上海阿拉丁試劑有限公司）; 羊抗兔IgG抗體、牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）（美國Sigma公司）; 硝酸纖維素膜、DB6吸水紙（上海杰一生物科技有限公司）; H8底板（基因有限公司）; 玻璃纖維膜（美國Ahlstrom公司）; 樣品墊處理液和金標(biāo)復(fù)溶液（廣州萬聯(lián)生物科技有限公司）; 其它試劑購自廣州化學(xué)試劑公司。保健酒和口服液購自廣州市某藥店。

實(shí)驗(yàn)中所用的溶液：0.1 mol/L K2CO3溶液（13.8 g/L），10% BSA（10 g/L BSA），包被液（pH 9.6，0.1 mol/L 碳酸鹽緩沖液），0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PB，3.117 g/L KH2PO4， 20.742 g/L Na2HPO4·12H2O）， 0.1 mol/L KOH溶液（5.6 g/L）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 半抗原的合成和鑒定 按照文獻(xiàn)＼[13＼]方法制備半抗原H1。半抗原H2的制備方法如下： 在25 mL兩口圓底燒瓶中，將117.12 mg氨基他達(dá)拉非溶于5 mL甲醇，逐滴加入溶有37.02 mg乙醛酸的甲醇（3 mL），60℃回流反應(yīng)3 h后停止加熱，常溫下繼續(xù)攪拌至白色固體析出，真空抽濾，用2 mL甲醇洗滌濾餅2次，濾渣烘干，即得白色固體狀半抗原H2，經(jīng)ESIMS質(zhì)譜鑒定合成成功（ESIMS：m/z 445.63 ＼[M＼]）。

2.2.2 人工抗原的合成與鑒定 采用活潑酯法[14，15]將半抗原H1與BSA偶聯(lián)作為免疫原（H1BSA），將H1和H2分別與載體蛋白OVA、KLH偶聯(lián)得到包被原（H1OVA、H1KLH、H2OVA、H2KLH），采用紫外掃描法并結(jié)合免疫血清的效價與抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定[14，15]，分裝于離心管中，20℃凍存。

2.2.3 抗體的制備與純化 參照文獻(xiàn)＼[16＼]，采用免疫原H1BSA免疫3只2.0～2.5 kg雌性新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。通過酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）測定抗血清效價與抑制率，進(jìn)行抗體性能鑒定。采用辛酸硫酸銨沉淀法[17]純化抗體，于20℃凍存。

2.2.4 包被原/抗體組合的篩選

分別以H1OVA、H1KLH、H2OVA、H2KLH為包被原，采用間接競爭ELISA方法，考察抗體/包被原組合效價和抑制，并結(jié)合試紙條質(zhì)控線（Control line， C line）與檢測線（Test line， T line）顯色情況確定最優(yōu)抗體/包被原組合，進(jìn)行mwLFIA方法優(yōu)化。

2.2.5 AuNPs溶液pH值優(yōu)化 采用文獻(xiàn)＼[18＼]的方法制備和鑒定AuNPs溶液。在4個裝有1 mL AuNPs溶液的離心管中，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值分別為8.0、8.5、9.0和9.5，各加入適量抗體進(jìn)行標(biāo)記，振蕩10 min，再加入20 μL 10% BSA，振蕩20 min，4℃ 12000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀加入等體積溶液振蕩復(fù)溶，裸眼觀察復(fù)溶情況，測定各復(fù)溶液在525 nm處的吸光值，將易復(fù)溶、吸光值最高的復(fù)溶液的pH值作為最佳標(biāo)記pH值。

2.2.6 標(biāo)記抗體濃度優(yōu)化 在已確定pH值的AuNPs溶液中加入適量抗體（8.0 mg/mL），終濃度分別為4.0、8.0 、12.0、16.0、20.0和24.0 μg/mL，振蕩孵育10 min后，加入20 μL 10% BSA溶液，繼續(xù)振蕩20 min，離心后棄上清液，等體積振蕩復(fù)溶， 測定525 nm吸光值，選擇維持AuNPs溶液為紅色的最低抗體濃度為最佳抗體標(biāo)記濃度[19]。

2.2.7 金標(biāo)抗體用量和包被原濃度的選擇

分別吸取2.2.6節(jié)制備的金標(biāo)抗體溶液3、6和9 μL于微孔板中，37℃烘干; 將包被原分別以2.0和4.0 mg/mL劃膜于試紙條，烘干后，通過棋盤法檢測陰性緩沖液（0.1 mol/L PB溶液）和50 ng/mL他達(dá)拉非陽性標(biāo)準(zhǔn)液，用免疫層析讀數(shù)儀測定，選擇陰性孔試紙條T/C≈1.0，T、C線顯色明顯，且陽性抑制率高的作為最佳金標(biāo)抗體量/包被原濃度組合。

2.2.8 試紙條的組裝和金標(biāo)微孔的制備

試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水紙和PVC底板四部分組成，NC膜上T線為包被原，C線為羊抗兔IgG抗體，將樣品墊、NC膜和吸水紙依次銜接粘貼在PVC底板上，切成3.05 mm寬試紙條（圖2），密封干燥保存。吸取按2.2.7節(jié)確定的金標(biāo)抗體量鋪于96孔板的微孔，振蕩均勻，37℃烘干過夜，密封干燥保存。

2.2.9 測定步驟及結(jié)果判定 吸取80 μL緩沖液于金標(biāo)微孔內(nèi)，室溫孵育5 min后，將試紙條垂直插入微孔，反應(yīng)6 min。裸眼觀察判斷： T線和C線顯色相近時，結(jié)果判定為陰性; T線顏色淺于C線時，結(jié)果判定為弱陽性; T線無色結(jié)果判定為強(qiáng)陽性; C線無色，試紙條判定為失效（圖2）。同時，采用免疫層析讀數(shù)儀讀數(shù)， 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， 并確定樣本中他達(dá)拉非及其類似物含量。

2.2.10 樣品前處理 準(zhǔn)確量取0.5 mL保健酒或口服液樣品于10 mL離心管，加入2 mL KOH溶液（0.1 mol/L）后， 用2 mL CHCl3振蕩萃取40 s，靜置分層后， 取下清液于10 mL離心管，重復(fù)萃取2次，合并下清液，50℃氮吹至干，用50 μL 0.1%乙酸甲醇溶液復(fù)溶后，加0.1 mol/L PB稀釋至0.5 mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNPs制備與鑒定

通過紫外掃描（圖3A）可知，該AuNPs溶液的最大吸收波長為525 nm， 最大吸收峰的峰寬較窄，說明制備的AuNPs顆粒均勻，通過透射電鏡（圖3B）對其進(jìn)行掃描，計算100個粒子， 得AuNPs的平均粒徑為20 nm。通過裸眼觀察（圖3B插圖）， 制備的AuNPs色澤鮮艷，澄清透明。

3.2 人工抗原的合成與鑒定

以半抗原及載體蛋白為參照對人工抗原進(jìn)行紫外光譜掃描（圖4），發(fā)現(xiàn)人工抗原的吸收光譜與半抗原和載體蛋白均有所不同，特征吸收峰位移或峰型發(fā)生一定變化，說明半抗原共價偶聯(lián)至載體蛋白表面。

后續(xù)抗血清競爭抑制實(shí)驗(yàn)顯示針對藥物和半抗原顯現(xiàn)出特異性識別反應(yīng)（表1），說明產(chǎn)生了特異性抗體，從而證明人工抗原合成成功。

3.3 包被原的篩選

采用間接競爭ELISA方法，以他達(dá)拉非（1 μg/mL）為競爭物，以同源和異源包被的方式測定純化后抗體的效價和抑制率，結(jié)果見表1，對于所有包被原，抗體H1BSA均顯示出較好的親和力和識別效果。進(jìn)一步將包被原以1 mg/mL的濃度通過劃膜包被于NC膜的檢測線上。

3.4 金標(biāo)抗體pH值與抗體濃度的確定

在不同pH值的標(biāo)記條件下制備金標(biāo)抗體（圖6A），發(fā)現(xiàn)隨著AuNPs溶液pH值增大，其吸光值先變大后變小，當(dāng)pH=9.0時，吸光值最大，此時AuNPs溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，選擇制備金標(biāo)抗體的最佳pH=9.0。同時，在不同抗體濃度下制備金標(biāo)抗體（圖6B），發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗體濃度為16.0 μg/mL時，AuNPs溶液顏色和525 nm處的吸光值開始趨向平緩，因此制備金標(biāo)抗體時選擇抗體濃度為16.0 μg/mL。

3.5 金標(biāo)抗體用量和包被原濃度的確定

采用棋盤法確定最佳抗體和包被原濃度，結(jié)果表明，金標(biāo)抗體（16.0 μg/mL）用量為9 μL、包被原濃度為4 mg/mL時，陰性T/C=1.0，T、C線顯色最明顯，陽性試紙條抑制率高達(dá)90.0%。因此，選擇金標(biāo)抗體用量為9 μL、包被原4 mg/mL組合。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取經(jīng)HPLCMS/MS確證為陰性的保健酒或口服液樣品，按照2.2.10節(jié)方法制備陰性樣品溶液，將1.0 mg/mL他達(dá)拉非類藥物溶液稀釋，分別配制成100、50 、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0 ng/mL他達(dá)拉非類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下進(jìn)行mwLFIA實(shí)驗(yàn)，用讀數(shù)儀讀取不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度下試紙條T/C值，以B/B0為縱坐標(biāo)（其中，B0為不加藥物時的T/C值，B為藥物濃度為x時的T/C值），標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，利用Origin 8.5擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢出限LOD（IC20，B/B0=0.2時所對應(yīng)的藥物濃度）、半抑制濃度（IC50，B/B0=0.5時所對應(yīng)的藥物濃度）及裸眼消線值（T線變開始變?yōu)闊o色對應(yīng)的藥物濃度，即Cutoff值）。結(jié)果表明，他達(dá)拉非類藥物的LOD為0.05～0.30 ng/mL，IC50為0.64～3.41 ng/mL，裸眼消線值在50 ～100 ng/mL之間（圖7和表2）。目前，檢測他達(dá)拉非類藥物含量多采用儀器方法（表3），本方法不僅可達(dá)到相同水平的檢出限，并且具有成本低、操作簡便、快速等優(yōu)勢，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價值。

3.7 方法的特異性和穩(wěn)定性

按公式（1）計算交叉反應(yīng)率（Crossreactivity， CR），評價抗體特異性。

為他達(dá)拉非結(jié)構(gòu)功能類似物的IC50。將他達(dá)拉非及其類似物配制成200 ng/mL溶液，進(jìn)行mwLFIA測定，與PB緩沖液對照（圖8和表4）。結(jié)果表明，本方法可對他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非和去甲基他達(dá)拉非特異性識別，而與其它結(jié)構(gòu)功能類似物無明顯交叉反應(yīng)，說明此抗體針對他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非以及去甲基他達(dá)拉非的特異性良好。

將試紙條和金標(biāo)微孔放入鋁箔袋中，37℃干燥保存，分別于第1、3、5、7天取出，采用本方法進(jìn)行檢查，幾次檢測結(jié)果相近，C、T線的顏色變化不大，靈敏度不變，表明本方法穩(wěn)定性良好。

3.8 實(shí)際樣品分析

向陰性保健酒和口服液樣品中添加他達(dá)那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，使終濃度為10、20和50 ng/mL，按照2.2.10節(jié)進(jìn)行樣品前處理后，分別采用mwLFIA和HPLCMS/MS方法[24]測定。結(jié)果（表5）表明，mwLFIA方法的平均回收率為78.7%～117.8%，RSD <15%，與HPLCMS/MS方法檢測結(jié)果一致，說明本研究建立的免疫層析檢測方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品檢測。

4 結(jié) 論

本研究建立了保健酒和口服液樣品中他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非和去甲基他達(dá)拉非同時檢測的mwLFIA方法，檢出限為0.05～0.30 ng/mL，裸眼消線值在50～100 ng/mL之間，樣品添加回收率為78.7%～117.8%，與HPLCMS/MS法檢測結(jié)果一致。本方法靈敏、快速、穩(wěn)定性好，適用于保健酒和口服液基質(zhì)中他達(dá)拉非類藥物的現(xiàn)場快速篩查。

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