整合定性策略用于大黃素代謝物的高通量靶向鑒定

蔡芳 任繁棟 任達兵 劉韶 易倫朝

摘 要：采用超高效液相色譜四極桿軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，使用Thermo scientific Hypersil GLOD色譜柱，以0.1%甲酸乙腈為流動相，應(yīng)用梯度洗脫程序?qū)δI間質(zhì)纖維化大鼠血清中的大黃素及其代謝物進行了分析。將質(zhì)量虧損、中性丟失、診斷碎片離子過濾等技術(shù)互相融合，提出了一種可高通量靶向鑒定藥物有效成分在體內(nèi)的代謝物的方法，并將本方法應(yīng)用到大黃素大鼠血液代謝物的鑒定中，鑒定出大黃素在大鼠體內(nèi)的11種代謝物及39種可能的代謝物，并證明大黃素在大鼠體內(nèi)的Ι相代謝途徑主要是氧化和羥基化，Ⅱ相代謝途徑主要是硫酸酯化和葡萄糖醛酸化。本方法有效減少了定性分析過程中基質(zhì)和干擾離子的影響，提高了代謝物定性分析的效率和準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù); 質(zhì)量虧損; 診斷碎片離子; 中性丟失; 大黃素

1 引 言

超高效液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Ultra high performance liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry， UPLCHRMS）作為一種強大的分析工具，可為化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供豐富的信息[1，2]。 然而，由于數(shù)據(jù)的高復(fù)雜度，也給高通量靶向鑒定目標(biāo)代謝物帶來困難。同時，目標(biāo)代謝物分析過程中容易受到其它代謝物或基質(zhì)的干擾，甚至在某些情況下，干擾離子的強度遠高于真正的質(zhì)譜特征，從而難以從原始數(shù)據(jù)中快速鑒定目標(biāo)化合物，增加了代謝物的定性分析的難度。

目前，UPLCHRMS數(shù)據(jù)處理的策略主要有質(zhì)量虧損過濾（Mass defect filtering， MDF）、氮規(guī)則過濾（Nitrogen rule filtering， NRF）、中性丟失過濾（Neutral loss filtering， NLF）和診斷碎片離子過濾（Diagnostic fragment ion filtering， DFIF）等。質(zhì)量虧損是指在核形成和穩(wěn)定時，不同的元素或其同位素需要吸收或釋放不同的能量，進而導(dǎo)致能量發(fā)生變化。簡言之，即是一種元素或者化合物的精確質(zhì)量與其最接近整數(shù)值之間的差值[3]。質(zhì)量虧損過濾可以有效地凈化色譜圖，排除期望質(zhì)量范圍外的化合物，降低質(zhì)譜解析的復(fù)雜度[4]。然而，僅采用質(zhì)量虧損過濾很難全面地過濾干擾離子。診斷碎片離子過濾的方法是基于具有相同或相似骨架的化合物在相同的碰撞電壓下會有相似的質(zhì)譜裂解，產(chǎn)生相似的碎片信息而提出的。這種方法有助于物質(zhì)裂解規(guī)律的推測[5]。物質(zhì)在裂解過程中，會失去一些不帶電荷的基團，例如CH3、SO3、H2O等。這些中性丟失信息有助于推測物質(zhì)發(fā)生的反應(yīng)類型、取代基的種類及其質(zhì)譜裂解規(guī)律，可快速、有效地為物質(zhì)發(fā)生的代謝反應(yīng)提供合理的證據(jù)，但是，不能推測化合物的主體結(jié)構(gòu)信息[6]。質(zhì)量虧損過濾可有效地凈化譜圖，篩選已知與未知化合物信息; 中性丟失過濾有助于了解化合物的裂解規(guī)律及官能團特征; 診斷碎片離子過濾可以篩選具有相同骨架的化合物。單一過濾策略常難以避免定性分析過程中的假陽性和假陰性。整合多種過濾方法可在高通量定性分析多種化合物的同時，提高定性效率和準(zhǔn)確性，有望成為高通量靶向定性分析的有效方法。

大黃是蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃及藥用大黃的干燥根或干燥莖[7]。大黃中含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、鞣質(zhì)類、有機酸等化合物。大黃素是大黃中的重要活性成分，也是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)標(biāo)志物之一[8，9]。本研究僅以大黃提取液中的大黃素為研究對象，采用整合定性分析策略對其在血液中的Ⅰ相代謝物和II相代謝物進行高通量靶向篩選和定性分析，并以此為例說明整合定性分析策略高通量靶向篩選、定性分析代謝物的過程和有效性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Q Exactive臺式四極桿軌道阱高分辨質(zhì)譜（美國Thermo Scientific公司）; MXF微型渦旋混合器（上海偉進生物科技有限公司）; MilliQ A10超純水機（德國Merck公司）。

乙腈、甲醇（質(zhì)譜純，德國Merck公司）; 甲酸（色譜純，SigmaAldrich公司）; 大黃素（Lot code： 151008）、大黃酸（Lot code： 150528），純度>98%（上海源葉生物科技有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 大黃單煎液的制備 取18 g大黃藥材，加入10倍量的蒸餾水加熱回流1.5 h，傾出提取液后，藥渣用8倍量的水再加熱回流提取1 h，合并兩次煎液，濃縮至100 mL。

2.2.2 動物實驗 SPF級SD雄性大鼠40只（6～8周齡，體重： 180～220 g），生長狀態(tài)良好，購自長沙斯萊克實驗動物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃， 相對濕度55%±2%，清潔無菌的環(huán)境中，每天給予12 h光照。所有大鼠自由采食、自由飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，對其進行稱重、編號，并根據(jù)體重采用隨機區(qū)組設(shè)計對大鼠進行分組，共3組： 假手術(shù)組（16只），UUO模型對照組（14只），大黃提取物干預(yù)組（10只）。所有大鼠飼養(yǎng)于中南大學(xué)動物部大鼠房。實驗均嚴(yán)格按照中南大學(xué)動物管理委員會的管理條例使用和處理動物。大鼠在手術(shù)前一天下午禁食。

UUO大鼠模型制備： 手術(shù)前稱量并記錄每只大鼠的體重，根據(jù)體重計算（按0.35 mL/100 g計算）所需麻藥（10%水合氯醛溶液）劑量，進行腹腔麻醉。將大鼠脊柱及左側(cè)約4 cm×6 cm大小的區(qū)域剃毛備皮，絡(luò)合碘消毒; 在肋脊角下、脊柱左側(cè)做長約1.5 cm的縱行切口，分離肌肉，并剪開腹膜，暴露出左側(cè)腎臟，剝離腎蒂周圍脂肪與筋膜，分離輸尿管，于緊靠腎盂處及離腎盂約1.5 cm處結(jié)扎輸尿管，并從中間剪斷; 逐層縫合組織與皮膚。

給藥： 自手術(shù)當(dāng)天大鼠麻醉蘇醒后，連續(xù)14天灌胃。干預(yù)組給予大黃單煎液灌胃，灌胃體積： 1 mL/100 g。 模型組灌胃生理鹽水。每日定時灌胃給藥，并觀察大鼠情況。

采血： 大鼠處死前24 h禁食，腹腔麻醉后心臟采血，血清樣本置于80℃保存。

2.2.3 大黃代謝物的檢測 （1）血清樣品的制備 樣品解凍后，取大黃提取物干預(yù)組大鼠血清樣本300 μL于離心管中，加入1200 μL乙腈去蛋白，渦旋1 min后，在4℃下14500 r/min離心10 min。取上清液，常溫下氮氣吹干，再加入150 μL甲醇復(fù)溶，渦旋1 min后，在4℃下14500 r/min，離心10 min。取上清液置于進樣瓶中待進樣。（2）液相分離條件 色譜柱為Thermo scientific Hypersil GLOD （100 mm×2.1 mm ID，1.9 μm）分析柱。流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸，梯度洗脫： 0～4.0 min，5%～15% B; 4.0～8.0 min，15%～25% B; 8.0～14.0 min，25%～30% B; 14.0～16.0 min，30%～33% B; 16.0～22.0 min，33%～45% B; 22.0～23.0 min，45%～55% B; 23.0～25.0 min，55%～60% B; 25.0～28.0 min，60%～90% B; 28.0～29.0 min，90%～5% B; 29.0～30.0 min，5% B。柱溫： 35℃，流速： 0.2 mL/min，進樣量2 μL。（3）質(zhì)譜條件 HESI離子源離子化模式： 負(fù)離子模式; 掃描模式： full MS （resolution 35000） 和 MS/MS （resolution 17500）; 掃描范圍： m/z 100～1000; 噴霧電壓： ×3.2 kV; 毛細管溫度： 320℃; 鞘氣壓力： 3 MPa; 輔助氣壓力： 0.8 MPa; 探針（Probe）溫度： 350℃; SLens RF level： 50; 碰撞能量： 25、35和50 eV。

2.3 數(shù)據(jù)處理過程

首先，采用MZ mine2.32軟件對UPLCHRMS數(shù)據(jù)進行色譜峰的構(gòu)建、解卷積及分子式的預(yù)測等處理[10，11]。然后，通過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換軟件MS convert將其轉(zhuǎn)換為.mzXML格式的數(shù)據(jù)，并運用RStudio1.0.44運行自編的R語言腳本文件對提取到的數(shù)據(jù)進行質(zhì)量虧損過濾、中性丟失、診斷碎片離子過濾，以縮小代謝物的鑒定范圍[12]。最后通過數(shù)據(jù)庫（HMDB、Scifinder、Chemspider、MassBank）匹配、查閱參考文獻，實現(xiàn)大黃素代謝物的定性分析。其數(shù)據(jù)處理的流程如圖1所示。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)量虧損過濾分析

藥物在體內(nèi)經(jīng)過Ι相和Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化后，其性質(zhì)會發(fā)生變化，但藥物的核心結(jié)構(gòu)不會發(fā)生徹底的改變。因此，藥物代謝物的質(zhì)量虧損與藥物原型成分的質(zhì)量虧損值相似[13，14]。大黃素在體內(nèi)可能發(fā)生的Ι相和Ⅱ相反應(yīng)的質(zhì)量數(shù)變化及其質(zhì)量虧損值如電子版文后支持信息表S1所示。根據(jù)文獻報道，大黃素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑主要包括氧化、羥基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化[15，16]。本研究以大黃素的母體結(jié)構(gòu)為Ι相反應(yīng)的模板分子，大黃素發(fā)生硫酸酯化、葡萄糖醛酸化后的產(chǎn)物為Ⅱ相反應(yīng)的主要模板分子，并基于大黃素在體內(nèi)可能發(fā)生的代謝途徑及其代謝后物質(zhì)的質(zhì)量變化，設(shè)定了3個不同的質(zhì)量虧損窗口。質(zhì)量虧損窗口的設(shè)定是影響質(zhì)量虧損過濾效果的關(guān)鍵因素，窗口設(shè)定范圍過大會導(dǎo)致非目標(biāo)代謝物的干擾，而窗口設(shè)定范圍太小又將會使目標(biāo)代謝物被過濾掉。本研究中質(zhì)量虧損范圍主要依據(jù)大黃素在體內(nèi)可能發(fā)生的Ι相代謝反應(yīng)出現(xiàn)的最大分子量的變化確定。Ι相反應(yīng)質(zhì)量變化最大的是3次羥基化（見電子版文后支持信息表S1），質(zhì)量變動47.9847 Da，因此，將3個模板分子的質(zhì)量范圍設(shè)定為模板整數(shù)值加減48 Da。其質(zhì)量虧損窗口的設(shè)定結(jié)果如表1所示。根據(jù)設(shè)定的質(zhì)量虧損窗口，從UPLCHRMS獲得的13115個質(zhì)譜碎片中篩選出344種可能與大黃素代謝有關(guān)的代謝物，有效地去除了背景離子的干擾，縮小了定性分析的范圍。

3.2 中性丟失過濾分析

化合物在裂解過程中會失去一些不帶電荷的基團，如CH3、CO、CO2、H2O、CHO和O等，即中性丟失?；诖簏S素的結(jié)構(gòu)特點，并查閱相關(guān)文獻[15，17～19]，分析大黃素在體內(nèi)的代謝途徑（如電子版文后支持信息圖S1所示），運用R studio軟件運行自編的R腳本文件對數(shù)據(jù)進行中性丟失過濾，其過濾結(jié)果如表2所示。

單一的中性丟失過濾得到的質(zhì)譜干擾信息仍然較多，且不能準(zhǔn)確地定性分析出目標(biāo)化合物。因此，在質(zhì)量虧損過濾的基礎(chǔ)上，選擇出現(xiàn)頻率較高且具有代表性的中性丟失進行過濾，其過濾結(jié)果如圖2所示。結(jié)合質(zhì)量虧損過濾和中性丟失過濾有效地縮小了質(zhì)譜定性分析的范圍，減少了定性分析過程中非靶向代謝物的干擾，同時也有助于下一步代謝物裂解規(guī)律的總結(jié)和代謝物結(jié)構(gòu)的推斷。通過中性丟失過濾與質(zhì)量虧損過濾策略的有效結(jié)合，本研究從55個質(zhì)譜碎片中篩選出36種可能的代謝物。

3.3 診斷碎片離子過濾及物質(zhì)的定性分析分析

為了排除質(zhì)量虧損過濾與中性丟失過濾過程中的假陽性結(jié)果，運用診斷碎片離子過濾對原始數(shù)據(jù)進行篩選，結(jié)合質(zhì)量虧損過濾與中性丟失過濾的結(jié)果對36種可能的代謝物進行進一步的篩選。診斷碎片離子的確定主要基于大黃素在體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成其它游離型的蒽醌類物質(zhì)（大黃酚、大黃酸及蘆薈大黃素），及其在代謝過程中母體結(jié)構(gòu)不會發(fā)生改變，且裂解規(guī)律相似的原理[15，20，21]。本研究對大黃素代謝物的裂解情況和規(guī)律進行了總結(jié)和歸納，確定了大黃素代謝物的診斷碎片離子，其診斷碎片離子的結(jié)構(gòu)及其相互轉(zhuǎn)化后的代謝物的裂解規(guī)律，如電子版文后支持信息圖S2所示。

進一步篩選診斷碎片離子，定性分析出了11種代謝物，主要是大黃素經(jīng)Ι相反應(yīng)（主要是氧化、羥基化、去甲基化）和Ⅱ相反應(yīng)（主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化）的產(chǎn)物，或者是經(jīng)Ι相反應(yīng)再經(jīng)Ⅱ相反應(yīng)的產(chǎn)物，這與文獻＼[15，22＼]報道大黃素的Ⅱ相反應(yīng)主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化一致，其定性分析結(jié)果如表3所示，其可能的結(jié)構(gòu)如電子版文后支持信息圖S3所示。診斷碎片離子過濾有效排除了定性分析過程中的假陽性。造成這些代謝物的假陽性主要是由于同一類化合物的裂解具有相似的規(guī)律，而一些分子質(zhì)量大的代謝物會產(chǎn)生與小分子質(zhì)量代謝物相同的碎片信息，因此將一些分子質(zhì)量大的代謝物的碎片定性分析為一種代謝物。

基于文獻報道的信息、大黃素可能發(fā)生的Ι相反應(yīng)及其分子式改變的情況（如電子版文后支持信息表S1所示），預(yù)測其代謝物可能的分子式，通過準(zhǔn)確質(zhì)荷比信息，提取不同質(zhì)荷比的一級質(zhì)譜圖，并判斷其峰形，然后對比文獻報道的信息，對沒有二級質(zhì)譜的物質(zhì)進行定性分析。最后從一級質(zhì)譜中初步定性分析出39種代謝物，其定性分析結(jié)果如表4所示，其可能的結(jié)構(gòu)如圖3所示。

4 結(jié) 論

整合定性分析策略有效減少了質(zhì)譜定性分析過程中干擾離子的影響，提高了準(zhǔn)確定性分析的覆蓋率，減少了定性分析過程中的假陽性。但是，由于一些代謝物的質(zhì)譜信息缺失，如沒有二級質(zhì)譜，無法對其進行準(zhǔn)確定性分析。為了實現(xiàn)更多代謝物的準(zhǔn)確定性分析，應(yīng)對UPLCHRMS的數(shù)據(jù)采集方式、質(zhì)譜參數(shù)等進行優(yōu)化，使更多的代謝物離子化，擴大檢測的范圍，使代謝物產(chǎn)生豐富的二級質(zhì)譜。 同時，為了更有效地運用本方法進行靶向代謝物的定性分析，應(yīng)充分了解代謝物的類型、結(jié)構(gòu)特點及其在體內(nèi)或者體外的轉(zhuǎn)化途徑，合理有效地運用不同的質(zhì)譜過濾器，實現(xiàn)代謝物的準(zhǔn)確定性分析。

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