水凝膠納米纖維復(fù)合基底捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究

王志利 丁丕 高田 陳昌沖 曹翼 孫娜 裴仁軍

摘要：循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）檢測(cè)被認(rèn)為是一種極具發(fā)展前景的癌癥液體活檢技術(shù)。血液中CTCs數(shù)量非常稀少，因此，從血液中高效捕獲高純度、高活性的CTCs極具挑戰(zhàn)。為提高CTCs捕獲純度，本研究通過(guò)自由基聚合反應(yīng)在玻璃片表面修飾厚度約2.3μm的聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸甲酯（PCBMA）水凝膠，具有抗粘附作用，并提供一種類(lèi)似細(xì)胞外基質(zhì)的柔軟界面。在水凝膠表面修飾抗上皮粘附分子（EpCAM）抗體后，對(duì)靶細(xì)胞的捕獲效率僅約20%。為提高捕獲效率，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)在水凝膠表面覆蓋一層直徑約200nm的殼聚糖納米纖維，使捕獲基底具有納米結(jié)構(gòu)，最后引入EpCAM抗體作為親和捕獲分子用于特異性捕獲EpCAM高表達(dá)的CTCs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此水凝膠納米纖維復(fù)合基底對(duì)靶細(xì)胞捕獲效率可達(dá)85%，比平面水凝膠基底的捕獲效率提高了4倍多;對(duì)陰性細(xì)胞的粘附率僅0.5%，并且97%的捕獲細(xì)胞保持活性。對(duì)模擬病人樣本中少量靶細(xì)胞的捕獲效率可達(dá)79.9%。本研究所發(fā)展的捕獲基底通過(guò)親和捕獲分子、抗粘附水凝膠和納米纖維結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTCs的高效率捕獲。

關(guān)鍵詞：循環(huán)腫瘤細(xì)胞;高效捕獲;納米結(jié)構(gòu);水凝膠抗粘附界面

1引言

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是一些攜帶原始腫瘤信息并從腫瘤部位脫落后，經(jīng)過(guò)遷移、轉(zhuǎn)化等過(guò)程，最終進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞[1～3]。CTCs檢測(cè)為腫瘤的研究提供了一種非侵入性方式，因此被認(rèn)為是最具發(fā)展前景的液體活檢技術(shù)，對(duì)腫瘤的早期診斷、預(yù)后監(jiān)控、藥物評(píng)估以及個(gè)體化治療具有指導(dǎo)意義[4，5]。然而，CTCs在血液中非常稀少，且存在異質(zhì)性，因此，從血液中高效、高純度捕獲CTCs仍然面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[6]。目前，已經(jīng)發(fā)展了多種分離技術(shù)用于CTCs捕獲，如密度梯度離心法[7]、濾膜過(guò)濾方法[8]、水動(dòng)力分離法[9]、介電泳（DEP）細(xì)胞分離法[10]、納米基底親和捕獲方法[11]、磁珠親和捕獲分離技術(shù)[12]和微流控技術(shù)[13]等。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面存在的微納米結(jié)構(gòu)可與納米結(jié)構(gòu)基底形成較強(qiáng)的局部作用，同時(shí)，納米結(jié)構(gòu)基底為親和捕獲分子的修飾提供更多的靶點(diǎn)，有望大幅度提高捕獲效率[14]。納米結(jié)構(gòu)基底（如納米柱、納米線(xiàn)、納米纖維等）已經(jīng)應(yīng)用于CTCs捕獲[15，16]。Liu等[17]制備了基于金屬有機(jī)骨架（MOF）結(jié)構(gòu)的納米基底，引入抗體作為親和捕獲分子，用于細(xì)胞的識(shí)別和捕獲以及作為藥物的響應(yīng)性釋放載體。Wang等[18]通過(guò)在磨砂片表面原位生長(zhǎng)硅納米線(xiàn)并修飾EpCAM抗體用于靶細(xì)胞PC-3的捕獲，捕獲效率達(dá)85%，隨著硅納米線(xiàn)長(zhǎng)度增加，捕獲效率可進(jìn)一步提高。但是，納米結(jié)構(gòu)的引入增加了基底對(duì)血細(xì)胞或其它干擾細(xì)胞的非特異粘附，在一定程度上降低了對(duì)靶細(xì)胞的捕獲效率和純度，尤其是對(duì)CTCs的鑒定和分析存在嚴(yán)重干擾的白細(xì)胞也會(huì)被部分捕獲，因此，對(duì)于CTCs的研究首先需要發(fā)展能夠高效高純度捕獲CTCs的平臺(tái)。

目前，為降低基底對(duì)非特異性細(xì)胞的粘附作用，主要在納米結(jié)構(gòu)表面修飾抗粘附分子如牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇（PEG）等[19，20]。Sun等[19]將BSA蛋白通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方式引入到二氧化鈦納米棒表面，達(dá)到較好的抗粘附效果。研究發(fā)現(xiàn)，兩性離子聚合物的親水性是PEG分子的7～8倍，并具有良好的抗粘附性能[21]。其中，CBMA聚合物在抗蛋白、細(xì)菌和細(xì)胞吸附等方面具有優(yōu)異的性能，將CBMA接枝到金表面，該表面在較廣pH和離子強(qiáng)度范圍內(nèi)均具有優(yōu)異的抗蛋白吸附能力[22]。而且CBMA化合物具有雙鍵和羧基官能團(tuán)，為其廣泛使用提供了基礎(chǔ)。本研究引入CBMA來(lái)解決靶細(xì)胞捕獲過(guò)程中的非特異性吸附問(wèn)題，以期提高靶細(xì)胞的捕獲純度。同時(shí)，相比無(wú)機(jī)納米材料制備的“硬”界面，細(xì)胞更偏向于“軟”的捕獲界面，為了對(duì)捕獲的CTCs進(jìn)行后續(xù)研究，需要基底界面具有更好的細(xì)胞相容性以保持細(xì)胞的活性[23]。水凝膠的結(jié)構(gòu)與活體組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECMs）相似，具有良好的親水性和抗粘附性能，因此被廣泛應(yīng)用于人工ECMs合成的基礎(chǔ)成分和CTCs分離基底[24，25]。

本研究構(gòu)建了一層水凝膠作為捕獲界面基層，此基層由兩性離子化合物CBMA形成，具有良好的抗粘附性能和類(lèi)似于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。為提高水凝膠基層對(duì)CTCs的捕獲效率，在此基層上覆蓋一層殼聚糖納米纖維，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)在纖維表層修飾PEG分子，最終將抗體修飾到其表面。利用水凝膠基層、殼聚糖纖維的納米結(jié)構(gòu)以及抗體的特異性提高CTCs的捕獲效率和純度，對(duì)靶細(xì)胞捕獲效率可達(dá)85%，對(duì)陰性細(xì)胞的粘附率僅0.5%，對(duì)模擬血液樣本中少量靶細(xì)胞的捕獲效率達(dá)到79.9%。此基底為CTCs的高效、高純度捕獲提供了新的平臺(tái)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

DW-N303-1ACD8高壓直流電源發(fā)生器（天津東文高壓電源股份有限公司）;W0109-1B微量進(jìn)樣器（保定蘭格恒流泵有限公司）;FEIQuanta400F環(huán)境掃描電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）;Hitachi*CT6E日立臺(tái)式離心機(jī)（高壹工機(jī)商業(yè)（上海）有限公司）;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;FormaSeriesⅡ細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）;NikonECLIPSETi熒光倒置顯微鏡（日本NIKON公司）;Varian核磁共振波譜儀（美國(guó)瓦里安有限公司）。

殼聚糖（CS，MW=190-310kDa，脫乙酰度為85%）、聚（環(huán)氧乙烯）（PEO，MW=1000kDa）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）、過(guò)硫酸銨（APS）、N，N-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯（DMAEM，98%）、β-丙內(nèi)酯（98%）、甲基丙烯酸-3-（三甲氧基甲硅烷基）丙酯（MPS）、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）、25%戊二醛（GA）、人白細(xì)胞分離液（Ficoll-Paque）、碘化丙啶（PI）、鈣黃綠素（AM）、細(xì)胞膜綠色熒光探針（DiO）、細(xì)胞膜紅色熒光探針（DiI）（試劑級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）;達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、懸浮細(xì)胞1640培養(yǎng)基（RPMI1640）、最低必需培養(yǎng)基（MEM）、0.25%（w/V））胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）（試劑級(jí)，GibcoBRL，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）;N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、乙酸、丙酮、無(wú)水乙醚（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;氨基-聚乙二醇-羧基（NH2-PEG2000-COOH，試劑級(jí)，北京鍵凱科技有限公司）;鏈霉親和素（SA，試劑級(jí)，北京索萊寶科技有限公司）;生物素修飾的抗EpCAM抗體（anti-EpCAM，試劑級(jí)，上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）、人前列腺癌細(xì)胞系（PC-3）、人胚胎腎細(xì)胞系（293T）、人慢性骨髓性白血病細(xì)胞系（K562）和人宮頸癌細(xì)胞系（HeLa）分別使用添加體積比為10%FBS的DMEM、RPMI1640和MEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞系均來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1水凝膠納米纖維復(fù)合基底的構(gòu)建（1）CBMA制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有技術(shù)合成[23]。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將11.89gDMAEM溶解于80mL無(wú)水丙酮，冰浴下攪拌，逐滴加入5.73gβ-丙內(nèi)酯，15℃反應(yīng)5h。離心，用無(wú)水丙酮和無(wú)水乙醚洗滌，真空抽干，4℃保存。（2）雙鍵官能團(tuán)修飾將1cm×1cm玻片，置于含0.5mLMPS的50mL乙醇溶液中，清洗，干燥。（3）水凝膠基層合成根據(jù)文獻(xiàn)[26]方法合成水凝膠層。用2.5μL40%（w/V）CBMA溶液、2.5μL1%（w/V）MBA溶液、0.15μLAPS（10%（w/V））和TEMED（5%（w/V））配制水凝膠溶液。立即轉(zhuǎn)移至干凈大玻片上，然后將步驟（2）修飾后的玻片倒扣在水凝膠溶液上，20min后可觀察到水凝膠成型。將水凝膠修飾的玻片從大玻片上取下，保存于干燥器中待用。（4）水凝膠纖維復(fù)合基底的構(gòu)筑殼聚糖納米纖維根據(jù)本研究組前期建立的方法制備[22]。將殼聚糖與PEO按照質(zhì)量比9∶1溶解于90%（V/V）乙酸-水，制成3%（w/w）的溶液，室溫?cái)嚢?h。將電紡溶液轉(zhuǎn)移至5mL注射器中，采用5#針頭，針頭與鋁箔間距為10cm，電壓18kV，在水凝膠層表面電紡，4%氨水處理，清洗，過(guò)夜干燥。樣品命名為CS@Hydrogel。（5）纖維表面修飾PEG將CS@Hydrogel玻片與2.5%戊二醛反應(yīng)2h，清洗后與1mg/mLNH2-PEG2000-COOH溶液過(guò)夜孵育，PBS清洗。樣品命名為PEG-CS@Hydrogel。（6）anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底的構(gòu)筑將PEG-CS@Hydrogel玻片用0.1mol/LEDC和0.025mol/LNHS活化，與10μg/mLSA溶液反應(yīng)，PBS清洗，氮?dú)獯蹈?，滴?μmol/Lanti-EpCAM抗體溶液，4℃反應(yīng)過(guò)夜，F(xiàn)BS封閉10min。樣品命名為anti-EpCAM-CS@Hydrogel。

2.3.2anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底最佳捕獲時(shí)間的考察分別使用濃度為10μg/mL的DiO和DiI對(duì)K562和MCF-7染色20min，PBS清洗，計(jì)數(shù)，分別將0.25×105MCF-7和1×105K562細(xì)胞與anti-EpCAM-CS@Hydrogel玻片孵育不同時(shí)間，PBS清洗，熒光顯微鏡記錄細(xì)胞的捕獲情況，計(jì)算捕獲效率，選擇最佳孵育時(shí)間用于后續(xù)細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)。捕獲效率定義為捕獲的細(xì)胞與最初加入細(xì)胞的百分比。

2.3.3anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底捕獲效率的考察將MCF-7細(xì)胞染色，清洗，計(jì)數(shù)，將0.25×105MCF-7細(xì)胞與不同修飾界面的基底孵育40min，清洗，用倒置熒光顯微鏡記錄捕獲的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算捕獲效率。

2.3.4anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底特異性的考察分別對(duì)HeLa、K562、293T、MCF-7和PC-3這5種細(xì)胞進(jìn)行染色，清洗，計(jì)數(shù)，配制成固定濃度的細(xì)胞溶液，分別與anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底孵育40min，清洗，熒光顯微鏡記錄結(jié)果，統(tǒng)計(jì)捕獲效率。

2.3.5anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底捕獲細(xì)胞活性的考察將MCF-7與anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底孵育40min，清洗，然后與AM和PI的混合溶液孵育20min，清洗。同時(shí)將捕獲前的MCF-7進(jìn)行AM和PI的雙染色處理，作為對(duì)照。其中AM標(biāo)記活細(xì)胞，PI標(biāo)記死細(xì)胞。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率定義為活細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量的百分比。

2.3.6anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底靈敏度的考察將不同個(gè)數(shù)（10、20、50、100和200）DiI預(yù)染的MCF-7分別分散到1mL處理過(guò)的健康志愿者新鮮的抗凝血中，模擬病人血液樣本。同時(shí)用PBS溶液替代血液作對(duì)照組。分別與Lab-TekTM4孔腔室內(nèi)的anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底孵育，清洗，用熒光顯微鏡記錄捕獲的細(xì)胞數(shù)。

血液的處理方法：SepMateTM-15離心管中加入5mLFicoll-Paque，然后將PBS稀釋1倍的抗凝全血加入離心管中，2000r/min離心20min，提取白細(xì)胞（WBCs），PBS清洗，最后根據(jù)最初的血液體積加入等量的PBS分散，備用。

3結(jié)果與討論

3.1基底的制備和表征

合成的CBMA用1HNMR（400MHz）表征，結(jié)果如下：δ6.01（s，1H，dCH），5.63（s，1H，dCH），4.51（t，2H，OCH2），3.65（t，2H，CH2N），3.54（t，2H，NCH2），3.05（s，6H，NCH3），2.59（t，2H，CH2COO），1.80（s，3H，dCCH3）。

anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底的構(gòu)建和修飾見(jiàn)圖1。首先通過(guò)自由基聚合反應(yīng)在玻片表面合成PCBMA抗粘附水凝膠基層。該水凝膠層作為捕獲基底需有一定的硬度和交聯(lián)密度，同時(shí)又能保留良好的吸水能力，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，最終確定20%（w/V）CBMA和0.5%（w/V）MBA滿(mǎn)足要求。如圖2A和2B所示，此水凝膠層表面平整，厚度約2.3μm，完全覆蓋玻片。在水凝膠形成過(guò)程時(shí)，玻片表面修飾的雙鍵參與反應(yīng)，使水凝膠通過(guò)化學(xué)方式結(jié)合在玻片表面，保證了水凝膠層在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不會(huì)脫落。對(duì)水凝膠層進(jìn)行水接觸角測(cè)試（圖2C和2D），落在水凝膠表面的測(cè)試液滴立刻被吸收，說(shuō)明水凝膠層具有良好的吸水能力。利用靜電紡絲技術(shù)在水凝膠表面覆蓋一層殼聚糖納米纖維（圖2E和2F），纖維直徑約200nm，且稀疏地分布在水凝膠層上，通過(guò)SEM觀察到水凝膠層依然裸露在外，并未被纖維層掩蔽，使其依然能夠發(fā)揮抗粘附作用。此外，水凝膠基層吸水膨脹變?nèi)彳洉r(shí)，纖維的一部分會(huì)嵌入到水凝膠中，起到了防止纖維層脫落的作用。然后用戊二醛將PEG分子的氨基端修飾到殼聚糖纖維表面，另

一端的羧基通過(guò)EDC/NHS活化后與SA上的氨基反應(yīng)，最后通過(guò)親和素與生物素的特異相互作用將生物素化的抗體修飾在CS@Hydrogel基底上。此水凝膠納米纖維復(fù)合基底主要是利用水凝膠的抗粘附、纖維的納米結(jié)構(gòu)及抗體特異識(shí)別的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)CTCs的高效高純度的捕獲。

3.2不同孵育時(shí)間下的捕獲效率

基底與細(xì)胞的孵育時(shí)間會(huì)影響基底對(duì)靶細(xì)胞的捕獲效率，同時(shí)也會(huì)影響對(duì)非特異性細(xì)胞的粘附，因此在實(shí)驗(yàn)中利用陰性模型細(xì)胞K562和陽(yáng)性模型細(xì)胞MCF-7，考察不同孵育時(shí)間下，anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底對(duì)K562和MCF-7細(xì)胞的捕獲效率以確定最佳孵育時(shí)間。不同孵育時(shí)間下兩種細(xì)胞的捕獲效率如圖3所示。隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，40min后，對(duì)MCF-7的捕獲效率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定水平，而對(duì)K562細(xì)胞的非特異性粘附依然在增加，這可能是由于時(shí)間的延長(zhǎng)增加了非特異細(xì)胞與基底的作用，導(dǎo)致其在清洗時(shí)不能被清除，在60min時(shí)達(dá)到了6%。為了確保靶細(xì)胞的純度，減弱非特異性細(xì)胞的粘附作用，后續(xù)的捕獲實(shí)驗(yàn)采用40min的孵育時(shí)間。

3.3不同修飾基底的細(xì)胞捕獲效率

使用MCF-7作為模型細(xì)胞，不同修飾的界面互相作為對(duì)照，考察基底的抗粘附性能和捕獲效率。主要選取了5種界面：（1）Hydrogel：玻片上修飾CBMA水凝膠層，無(wú)任何修飾;（2）anti-EpCAM-Hydrogel：通過(guò)EDC/NHS活化Hydrogel界面，修飾SA，最后將生物素化的EpCAM抗體修飾在水凝膠表面，修飾過(guò)程見(jiàn)圖4;（3）CS@Hydrogel：Hydrogel表面覆蓋纖維后無(wú)任何處理;

（4）SA-CS@Hydrogel：CS@Hydrogel表面修飾PEG后，通過(guò)EDC/NHS活化PEG的羧基端，連接SA;（5）anti-EpCAM-CS@Hydrogel：在SA-CS@Hydrogel表面連接生物素化的EpCAM抗體。這5種界面的捕獲效率如圖5A所示，Hydrogel界面的細(xì)胞粘附率為0.20%，說(shuō)明PCBMA水凝膠基層具有很好的抗粘附作用。

anti-EpCAM-Hydrogel界面的捕獲效率僅約為18%，這可能是由于水凝膠的抗粘附性阻礙了細(xì)胞與基底抗體的作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞的捕獲效率低。為提高捕獲效率，在水凝膠基層表面覆蓋一層分布均勻的薄納米纖維，構(gòu)成了水凝膠納米纖維復(fù)合基底（CS@Hydrogel），該基底對(duì)細(xì)胞的粘附率也僅為0.22%，說(shuō)明水凝膠基層依然能夠起到抗粘附作用。纖維層的厚度和密度會(huì)影響水凝膠基層的抗粘附作用，因此需嚴(yán)格控制電紡條件。在同樣的捕獲條件下，anti-EpCAM-CS@Hydrogel界面對(duì)細(xì)胞的捕獲效率可達(dá)85%，相比于平面水凝膠anti-EpCAM-Hydrogel界面，水凝膠納米纖維復(fù)合基底的捕獲效率提高了4倍多，其中納米結(jié)構(gòu)起到了關(guān)鍵作用。同時(shí)，對(duì)孵育時(shí)間40min時(shí)，anti-EpCAM-Hydrogel和anti-EpCAM-CS@Hydrogel界面捕獲的細(xì)胞進(jìn)行了SEM觀察（圖5B和5C），anti-EpCAM-Hydrogel界面上的細(xì)胞依然處于收縮狀態(tài)，而anti-EpCAM-CS@Hydrogel界面上的細(xì)胞已經(jīng)鋪展并有偽足產(chǎn)生，進(jìn)一步說(shuō)明納米纖維結(jié)構(gòu)有效促進(jìn)了基底對(duì)靶細(xì)胞的捕獲。

3.4基底的特異性和捕獲細(xì)胞的活性

為了證實(shí)anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底對(duì)細(xì)胞的捕獲具有特異性，選擇了5種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分別是作為陰性模型細(xì)胞（EpCAM低表達(dá)）的HeLa、K562及293T，陽(yáng)性模型細(xì)胞（EpCAM高表達(dá)）的MCF-7和PC-3[27，28]。這5種細(xì)胞主要是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞表面EpCAM蛋白的表達(dá)情況確定其作為陽(yáng)性模型細(xì)胞還是陰性模型細(xì)胞，并用于相應(yīng)細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)。在孵育40min后，此基底對(duì)MCF-7和PC-3細(xì)胞的捕獲效率超過(guò)85%，而對(duì)EpCAM低表達(dá)的HeLa、293T、K562的捕獲效率分別為2.6%、2.2%和0.5%（圖6A），表明此基底對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞的捕獲具有良的選擇性。

通過(guò)死/活雙熒光染色對(duì)anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底所捕獲細(xì)胞的活性進(jìn)行評(píng)估。作為對(duì)照，對(duì)相同數(shù)量的未與基底進(jìn)行孵育的細(xì)胞也進(jìn)行雙染色處理。如圖6B所示，捕獲前的細(xì)胞和捕獲后的細(xì)胞存活率分別為98.4%和97.5%，兩者之間的差異很小，說(shuō)明此基底具有良好的生物相容性，對(duì)細(xì)胞后續(xù)的研究以及培養(yǎng)有重要意義。

3.5基底的靈敏性

為了驗(yàn)證anti-EpCAM-CS@Hydrogel能否用于臨床血液中少量CTCs的捕獲，進(jìn)行了模擬樣本實(shí)驗(yàn)。將DiI預(yù)染色的10、20、50、100和200個(gè)MCF-7細(xì)胞分散到1mL處理過(guò)的血液中，制成臨床病人模擬樣本，與anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底孵育，清洗，固定，用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。另外，用PBS溶液代替處理后的血液作為對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)圖7。

血液中的白細(xì)胞對(duì)CTCs后續(xù)鑒定及分析應(yīng)用的干擾最大，因此本研究主要考慮白細(xì)胞的影響。對(duì)PBS和白細(xì)胞中少量MCF-7細(xì)胞的捕獲效率分別為84.5%和79.9%。即當(dāng)1mL血液中有10個(gè)CTCs時(shí)，基底約可捕獲到8個(gè)，且在兩種介質(zhì)中的捕獲效率并無(wú)顯著差異，說(shuō)明此基底具有較好的靈敏度，表明anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底可用于臨床血液樣本的檢測(cè)。

4結(jié)論

通過(guò)水凝膠抗粘附性、纖維的納米結(jié)構(gòu)和親和捕獲分子抗體的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTCs的高效高純度捕獲。此水凝膠納米纖維復(fù)合基底可進(jìn)一步用于檢測(cè)臨床癌癥患者血液樣本，探索其實(shí)際應(yīng)用潛能。此基底具有良好的生物相容性，也可進(jìn)一步研究捕獲細(xì)胞的原位培養(yǎng)和增殖。

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