甜菜夜蛾核多角體病毒VP39基因的克隆與生物信息學(xué)分析

李賽男，李 萌，趙海洲，姜玉霞

(肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 肇慶 526061)

桿狀病毒是一類(lèi)特異性感染節(jié)肢動(dòng)物的病源微生物，具有宿主特異性，每種病毒只限感染一種或少數(shù)幾種親緣關(guān)系較近的昆蟲(chóng)，對(duì)人畜無(wú)害，已被認(rèn)為是最安全的生物殺蟲(chóng)劑之一[1-2]。此外，桿狀病毒還被用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)外源重組蛋白[3]、基因治療[4]以及作為重組抗原表位的展示系統(tǒng)[5]。迄今為止，已從600多種昆蟲(chóng)中分離出桿狀病毒，主要來(lái)自鱗翅目(如蝴蝶和蛾)、膜翅目(如蜻蜓)和雙翅目(如蚊子)[6]。桿狀病毒基因組DNA呈雙鏈閉合環(huán)狀，大小約為80～180 kbp，預(yù)測(cè)編碼89～183個(gè)ORF[7]。自苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)全基因組[8]測(cè)序被完成以來(lái)，已有超過(guò)80株桿狀病毒基因組序列被測(cè)定。最新的桿狀病毒分類(lèi)方法根據(jù)完成全基因組測(cè)序的桿狀病毒中的29個(gè)核心基因編碼的氨基酸序列，將桿狀病毒科分成4個(gè)屬，分別為Alphabaculovirus、Betabaculovirus、Gammabaculovirus和Deltabaculovirus[9]。根據(jù)對(duì)多角體蛋白基因的進(jìn)化分析，Alphabaculovirus又可以進(jìn)一步分為Group I和Group II NPV[10]。

甜菜夜蛾核多角體病毒(SpodopteraexiguaMNPV,SeMNPV)是Group II NPV的成員，其基因組全序列測(cè)定已經(jīng)完成并已發(fā)表[11]。VP39是昆蟲(chóng)桿狀病毒的核心基因之一，在感染的晚期表達(dá)，其編碼蛋白VP39疊環(huán)排列在核蛋白核心(nucleoprotein core)的周?chē)鶾12]，是桿狀病毒核衣殼的最主要結(jié)構(gòu)蛋白[13-15]。肌動(dòng)蛋白(actin)在桿狀病毒入侵以及在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中具有重要作用[16-19]。細(xì)胞中，actin以?xún)煞N形式存在，即單體(Globular actin,G-actin)和多聚體(Filamentous actin,F-actin)。研究發(fā)現(xiàn)，VP39與G-actin和F-actin都可以結(jié)合，但更傾向于結(jié)合G-actin[20]。在體外，純化的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)單粒包埋型核多角體病毒VP39蛋白能與G-actin以1∶5的比例結(jié)合，因此提出VP39蛋白在體外誘導(dǎo)G-actin形成F-actin索的模型：首先，VP39與G-actin以1∶1的分子比例結(jié)合形成核，然后這個(gè)核誘導(dǎo)其他4個(gè)G-actin聚集在它的周?chē)纬闪垠w，接著許多六聚體互相結(jié)合形成微絲，最后微絲扭曲形成索狀結(jié)構(gòu)[21]。但具體體內(nèi)VP39結(jié)合G-actin所發(fā)揮的作用目前尚不明確。此外，有研究表明，AcMNPV VP39能與它本身以及其他病毒蛋白，如多角體蛋白、ODV-EC27、ODV-E56、IE1、38K和ODV-E66，以及宿主的kinesin-1具有相互作用[22-25]，推測(cè)VP39參與了病毒入侵以及在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程。

本文選取了國(guó)內(nèi)外尚未進(jìn)行研究的SeMNPV VP39(Sevp39)基因作為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)了Sevp39基因編碼的Sevp39蛋白的理化特性、序列模式特性及二級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了Sevp39及其同源蛋白的序列比對(duì)，為今后研究Sevp39蛋白在病毒入侵和在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中所擔(dān)負(fù)的功能，探討宿主細(xì)胞蛋白與VP39蛋白間的相互作用機(jī)制，深入研究宿主與桿狀病毒之間的相互作用關(guān)系等提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

克隆載體pMD18-T和Premix Ex Taq Hot Start Version PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher公司；X-gal、IPTG和氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；DNA分子質(zhì)量購(gòu)自東盛公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

甜菜夜蛾核多角體病毒毒株SeMNPV-SeUS1為中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送(其引自美國(guó)加州大學(xué)Riverside分校B.A.Federici教授實(shí)驗(yàn)室)；大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α為肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存。

1.2 SeMNPV基因組DNA的提取

SeMNPV基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[26]的方法進(jìn)行。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR

利用DNASTAR軟件，參照SeMNPV基因組全序列[11](Genbank accession No.NC_002169)中的Sevp39全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增Sevp39基因全長(zhǎng)的引物，由深圳華大基因股份有限公司合成。上游引物P1：5’-GAATTCATGGCTCTGACGCCTGTCTCCTCGA-3’，下劃線(xiàn)部分為引入的EcoRI酶切位點(diǎn)；下游引物P2：5’-GGTACCCTAGACGACGGCCGTGGGCCGAAG -3’，下劃線(xiàn)部分為引入的KpnI酶切位點(diǎn)。PCR模板為SeMNPV基因組DNA，反應(yīng)體系為50 μL。PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)為：98 ℃，3 min；98 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收Sevp39基因的PCR產(chǎn)物。

1.4 質(zhì)粒酶切分析及序列測(cè)定

將回收的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒T-Sevp39，用EcoRI和KpnI進(jìn)行雙酶切鑒定，并在深圳華大基因股份有限公司對(duì)插入的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與Sevp39基因序列進(jìn)行比較。

1.5 生物信息學(xué)分析

將克隆并測(cè)序得到的Sevp39基因序列及其編碼的氨基酸序列作為原始數(shù)據(jù)，利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器或生物學(xué)分析軟件，有針對(duì)性地分析了該基因及其編碼蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)等。一級(jí)結(jié)構(gòu)采用DNASTAR軟件根據(jù)Sevp39基因序列推導(dǎo)出Sevp39蛋白的氨基酸序列，預(yù)計(jì)編碼的Sevp39蛋白的預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、化學(xué)特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與模式的預(yù)測(cè)用DNASTAR軟件、EBI (http://www.ebi.ac.uk)和ExPASy (http://www.expasy.org)等網(wǎng)站上的ProtParam和MotifScan (https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)，用Psipred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)等在線(xiàn)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。在GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST搜索引擎尋找Sevp39同源序列，用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比較，用GeneDoc軟件進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sevp39基因的擴(kuò)增

以SeMNPV基因組DNA為模板，從SeMNPV基因組中用PCR方法擴(kuò)增了Sevp39基因，擴(kuò)增片段大小為981 bp (圖1)，與預(yù)期大小相符?；厥誔CR產(chǎn)物，連入pMD18-T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒T-Sevp39，用EcoRI和KpnI進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得981 bp的目的片段和2692 bp的載體片段，與預(yù)期大小一致(圖2)。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1.PCR產(chǎn)物

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1.重組質(zhì)粒T-Sevp39的EcoRI/KpnI雙酶切

2.2 T-Sevp39重組體測(cè)序

將酶切鑒定正確的T-Sevp39重組體進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明：除Sevp39第308位的堿基由G突變成T (圖3，紅色標(biāo)記堿基)，其余所有堿基與Genbank上公布的SeMNPV基因組全序列(Genbank accession No.NC_002169)中的Sevp39序列完全一致(圖3)。雖然進(jìn)行了多次重復(fù)，測(cè)序結(jié)果均顯示在Sevp39第308位的堿基由G突變成T，原因可能是病毒毒株SeMNPV-SeUS1經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)，在該位點(diǎn)發(fā)生了變異。該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致該編碼氨基酸的密碼子由GGT變?yōu)镚TT，從而氨基酸由甘氨酸(Gly)變成纈氨酸(Val) (圖3，紅色方框標(biāo)注)，但是在培養(yǎng)病毒過(guò)程中，并沒(méi)有觀察到SeMNPV病毒的形態(tài)發(fā)生受到影響，因此該位點(diǎn)突變不影響Sevp39的功能。

圖3 Sevp39核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用在線(xiàn)軟件ProtParam和DNASTAR軟件分析Sevp39編碼的氨基酸序列的基本特征，結(jié)果如表1所示。Sevp39編碼326個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為37 ku，蛋白等電點(diǎn)為5.859；氨基酸組成中帶負(fù)電荷氨基酸(Asp、Glu) 35個(gè)，占10.7%；帶正電荷氨基酸(Arg、Lys) 32個(gè)，占9.8%；親水性氨基酸128個(gè)，占39.3%，疏水性氨基酸176個(gè)，占54.0%；Sevp39蛋白在大腸桿菌中的半衰期大于10 h，蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為42.31，是不穩(wěn)定蛋白(蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)大于40.00就為不穩(wěn)定蛋白)。

運(yùn)用MotifScan分析發(fā)現(xiàn)(表2)，Sevp39蛋白序列中包含3個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)(153-156、174-177、223-226)、2個(gè)可能的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(40-43、110-113)、6個(gè)可能的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(11-13、53-55、83-85、175-177、226-228、300-302)、1個(gè)可能的N-豆蔻?；稽c(diǎn)(267-272)和1個(gè)可能的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(146-152)。

表1 Sevp39編碼蛋白氨基酸含量

注:* 疏水氨基酸， #親水氨基酸

表2 Sevp39蛋白序列模式分析結(jié)果

BLAST搜索Sevp39的同源蛋白，并用Clustal W軟件比較其與同源蛋白的序列相似性。分析發(fā)現(xiàn)，Sevp39除與Neodiprionabietis(Neab)NPV、Neodiprionlecontii(Nele)NPV、Neodiprionsertifer(Nese)NPV 和Culexnigripalpus(Cuni)NPV的VP39蛋白序列相似性較低，介于12%～18%之間，與其余同源蛋白的序列相似性均大于30%，保守性適中。

從每個(gè)桿狀病毒屬中選擇Sevp39同源蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示出6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基(Cys) (圖4)，其中：Cys17、Cys48、Cys131存在于在所有的同源蛋白中；Cys28、Cys35存在于除NeabNPV、NeleNPV、NeseNPV、CuniNPV外的其他桿狀病毒的同源蛋白中；Cys168則存在于除CuniNPV外的其他桿狀病毒的同源蛋白中。

用Psipred分析Sevp39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示Sevp39可能形成7個(gè)α螺旋和14個(gè)β折疊(圖5)。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)所確定的保守Cys在圖中以星號(hào)標(biāo)出以指示其在二級(jí)結(jié)構(gòu)中的分布情況，發(fā)現(xiàn)上述6個(gè)保守的Cys中只有Cys17參與構(gòu)成β折疊。

3 討論

在SpltMNPV中，VP39基因的轉(zhuǎn)錄在病毒感染后6 h即可檢測(cè)到，并且轉(zhuǎn)錄起始于保守的桿狀病毒晚期啟動(dòng)子ATAAG中的第2個(gè)堿基A。Western blotting分析表明：VP39蛋白存在于BV和ODV的核衣殼中，因此VP39基因被認(rèn)為是一個(gè)桿狀病毒晚期結(jié)構(gòu)基因[27]。最近，有研究表明，家蠶核多角體病毒VP39基因的突變導(dǎo)致在培養(yǎng)細(xì)胞及家蠶幼蟲(chóng)體內(nèi)的感染性芽生型病毒粒子和包涵體的產(chǎn)生顯著下降[28]。因此，VP39在病毒復(fù)制過(guò)程中具有重要作用。

為揭示VP39的作用機(jī)理，本文運(yùn)用DNASTAR等生物學(xué)軟件分析了Sevp39基因及其編碼蛋白Sevp39。結(jié)果表明：Sevp39蛋白在大腸桿菌中的半衰期大于10 h，是不穩(wěn)定蛋白。Sevp39蛋白有多個(gè)位點(diǎn)可以發(fā)生糖基化修飾和磷酸化修飾。蛋白質(zhì)的脫磷酸化和磷酸化在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用，糖基化、磷酸化位點(diǎn)可能是Sevp39蛋白完成其生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

同源性分析表明，Sevp39與絕大部分桿狀病毒同源蛋白的序列相似性均大于30%，保守性適中。從每個(gè)桿狀病毒屬中選擇Sevp39同源蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示出6個(gè)高度保守的Cys，分別是Cys17、Cys28、Cys35、Cys48、Cys131、Cys168。利用Psipred在線(xiàn)軟件分析Sevp39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示Sevp39可能形成7個(gè)α螺旋和14個(gè)β折疊，6個(gè)高度保守的Cys中只有Cys17參與了β折疊的形成。Cys在蛋白質(zhì)中常形成二硫鍵，其中存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵通過(guò)影響蛋白空間結(jié)構(gòu)而決定其功能；存在于蛋白之間的二硫鍵，形成蛋白之間一種共價(jià)鍵相互作用的方式。在對(duì)猴空泡病毒(Simian vaculating virus)、乳頭狀瘤病毒(Papillomavirus)的研究中均發(fā)現(xiàn)，核衣殼主要蛋白通過(guò)保守Cys之間的二硫鍵構(gòu)成寡聚體來(lái)參與衣殼的裝配[29-30]。因此，推測(cè)Sevp39蛋白6個(gè)保守的Cys參與了蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成，在Sevp39的功能中具有重要作用。后續(xù)將致力于VP39蛋白中保守Cys的功能研究。

Eleven representative sequences were selected and aligned using Clustal X 1.83 and were edited with GeneDoc software.The VP39 protein sequences used are as follows:SeMNPV (NP_037835.1),AcMNPV (NP_054119.1),HyphantriacuneaNPV (HcNPV,YP_473253.1),LymantriadisparMNPV (LdMNPV,NP_047729.1),SpodopteralituraMNPV (SpltMNPV,NP_258349.1),AgrotissegetumGV (AgseGV,YP_006258.1),Xestiac-nigrumGV (XecnGV,NP_059259.1),NeabNPV (YP_667940.1),NeleNPV (YP_025289.1),NeseNPV (YP_025196.1) and CuniNPV (NP_203328.1).Amino acids with black shading denote 100% conservation in all sequences.Those with dark gray and light gray shading represent 80% and 60% conservation in all sequences,respectively.The asterisks indicate the location of the conservative cysteine amino acids.

圖4 Sevp39蛋白與其他昆蟲(chóng)桿狀病毒VP39氨基酸序列的同源性比較

圖5 Sevp39二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果