凝結(jié)芽孢桿菌影響蛋雞產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能的機理研究

邢冠潤，郎芯蕊，吳吉安，樓洪興，劉文強，張恒碩，董信陽，潘曉亮，王友明*

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310012；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江杭州 310021）

在高密度養(yǎng)殖條件下，產(chǎn)蛋雞尤其在產(chǎn)蛋后期更易受多種應(yīng)激影響，引發(fā)生產(chǎn)性能下降、發(fā)病率升高等一系列問題，應(yīng)用抗生素曾經(jīng)是解決該問題的很好手段。但近年來美國及西歐一些國家相繼禁用或限用抗生素作為飼料添加劑，我國2015 版《中國獸藥典》及農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)“農(nóng)業(yè)農(nóng)村部”）1435、1506 公告已經(jīng)明令禁止部分抗生素在蛋雞生產(chǎn)中的使用。因此，抗生素替代技術(shù)的研究備受關(guān)注，如在日糧中添加微生態(tài)制劑、植物提取物、中草藥制劑、酶制劑等，以及采用營養(yǎng)抗病技術(shù)、改變光照、加強消毒免疫等手段。凝結(jié)芽孢桿菌既具有維持腸道微生態(tài)平衡、刺激免疫、提高機體健康水平、促進消化等優(yōu)點，又具有抗逆性強、可定植等生物特性[1]，是安全飼料添加劑研究的熱點。大量研究表明，蛋雞日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌具有促進蛋雞生產(chǎn)性能的作用[2-4]，但對其可能影響蛋雞產(chǎn)蛋性能機制的研究較少。本試驗通過探究在飼糧中添加不同水平的凝結(jié)芽孢桿菌制劑對產(chǎn)蛋雞后期的生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)、腸道消化酶活性、生殖激素水平及相關(guān)受體基因表達量的影響，探究其可能的作用機制，為今后凝結(jié)芽孢桿菌制劑在蛋雞上的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 凝結(jié)芽孢桿菌制劑（菌株WS4-1 獲得中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心的菌保號CGMCCNO.7023），經(jīng)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所測定，本批次產(chǎn)品（批次號：2017091501）含凝結(jié)芽孢桿菌3.12×1011CFU/g 及其代謝產(chǎn)物，芽孢形成率85.2%。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 選取648 羽66 周齡健康、體重、產(chǎn)蛋率基本一致的“京粉1 號”蛋雞，隨機分為4 個組，每組6 個重復(fù)，每個重復(fù)27 羽。對照組飼喂無抗基礎(chǔ)飼糧，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別在無抗基礎(chǔ)料中添加3.33×106、1×107、3.33×107CFU/g 凝結(jié)芽孢桿菌。試驗于2018 年4 月21 日—6 月22 日在海鹽縣葉盛禽業(yè)養(yǎng)殖場進行，預(yù)試期1 周，飼喂基礎(chǔ)日糧，正試期8 周。

無抗基礎(chǔ)飼糧結(jié)合生產(chǎn)實踐，同時參照美國 NRC（1994）蛋雞營養(yǎng)需要配制，配方組成和主要營養(yǎng)成分見表1。蛋雞采用3 層階梯式籠養(yǎng)，每天恒定光照16 h，自然通風(fēng)，由專人飼養(yǎng)。飼喂量：前4 周·110 g/（d·只），后4 周112 g/（d·只），自由飲水，每天13:30 飼喂，15:00 收蛋，消毒、免疫程序按常規(guī)進行。

表1 無抗基礎(chǔ)日糧組成和主要營養(yǎng)成分

1.3 采樣與保存 試驗結(jié)束次日進行屠宰采樣，隨機從每組中選取大小基本一致的蛋雞12 只 （每個重復(fù)2 只） 空腹稱重（斷料12 h），頸動脈放血，待析出血清后3 000 r/min 離心10 min 分離血清，再分裝在離心管中，并于-20℃冰箱保存。取卵巢并盡量剔除大部分卵泡后置于凍存管中-80℃保存。十二指腸、空腸、回腸中段靠后1 cm 處各取0.5 g 左右黏膜，置于1.5 mL 的離心管中，-80℃冷凍保存待用。取樣稱重并記錄脾臟、肝臟、心臟、胰臟、卵巢的重量。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能 每天定時記錄各重復(fù)組的產(chǎn)蛋數(shù)、合格蛋重，計算產(chǎn)蛋率、平均合格蛋重、料蛋比。

產(chǎn)蛋率=產(chǎn)蛋數(shù)/試驗雞數(shù)×100%

平均合格蛋重=合格蛋總重/（產(chǎn)蛋數(shù)－破蛋數(shù)－軟殼蛋數(shù)）

料蛋比=日采食量/日產(chǎn)平均合格蛋重

1.4.2 器官指數(shù) 計算脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)、胰臟指數(shù)、卵巢指數(shù)等。器官指數(shù)計算公式：

器官指數(shù)=器官重（g）/宰前活重（kg）

1.4.3 血清生化指標(biāo) 測定指標(biāo)包括總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（Glob）、白球比（A/G）、堿性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（Glu）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、鈣（Ca）、磷（P）、尿素（Urea）。采用全自動生化分析儀（OLYMPUSAU5421+ISE 型，日本OLYMPUS 公司）測定，于杭州市第二人民醫(yī)院完成。

1.4.4 小腸黏膜消化酶活性 取小腸黏膜0.1 g 左右，加入4℃生理鹽水0.9 mL，加入鋼珠充分勻漿，將勻漿液在4℃ 3 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液分裝與1.5 mL 的Eppendorf 管中待測。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性及組織蛋白濃度采用考馬斯亮蘭法進行，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按說明書步驟進行。

1.4.5 血清生殖激素及卵巢受體基因表達量 血清促卵泡素（FSH）、促黃體生成素（LH）采用ELISA 試劑盒測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，試劑的配制和操作嚴格按說明書步驟進行。雌二醇（E2）在杭州市第二人民醫(yī)院完成測定。

促黃體生成素受體（LHR）及血清促卵泡素受體（FSHR）和18S RNA（內(nèi)參基因）的引物由委托寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計并合成。稱取50～100 mg 卵巢樣品，采用RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bioer）進行總RNA 提取及cDNA 合成。對樣品的cDNA 和內(nèi)參基因進行擴增，反應(yīng)程序：預(yù)變性：50.0℃，2 min；95.0℃10 min。PCR 反應(yīng)：95.0℃，10 s；60℃，30 s；采集熒光信號，共 40 個循環(huán)。熔解曲線分析：60℃升至 95.0℃，60℃保溫 1 min，95℃保溫15 s，自動采集熒光。1.5 統(tǒng)計分析 運用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計，采用單因子方差分析進行差異顯著性檢驗，最小顯著差數(shù)法（LSD）進行多重比較，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)?；虮磉_量采用 2-△△Ct法進行計算。

2 結(jié) 果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌制劑對蛋雞產(chǎn)蛋性能和器官指數(shù)的影響 由表2 可知，試驗Ⅰ組產(chǎn)蛋率較對照組相比提高了2.03%（P＜0.05）。試驗Ⅰ組平均合格蛋重較對照組降低了0.64%（P＜0.05）。試驗Ⅱ組料蛋比校對照組降低2.26%（P＜0.05）。與對照組相比，試驗Ⅱ組脾臟指數(shù)提高了104.76%（P＜0.05）；4 組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、卵巢指數(shù)無顯著差異。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞血清生化指標(biāo)的影響 由表3可知，相比對照組，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組ALP 分別提高11.58%、11.53%、19.29%（P＜0.05），試驗Ⅰ、Ⅱ組TG 分別降低16.40%、13.67%（P＜0.05），3 個試驗組的Ca 分別提高7.11%、5.58%、5.25%（P＜0.05）；相比對照組，試驗Ⅰ、Ⅲ組Urea 均降低7.94%（P＜0.05）。飼糧中添加不同水平凝結(jié)芽孢桿菌對血清TP、ALB、Glob、A/G、Glu、P、TC 均無顯著影響。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞小腸黏膜消化酶比活力的影響 由表4 可知，相比對照組，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組十二指腸淀粉酶比活力分別提高了65.63%、34.38%、25.00%（P＜0.05），十二指腸脂肪酶比活力分別提高了28.03%、56.48%、43.34%（P＜0.05）， 十 二 指 腸蛋白酶比活力分別提高了14.27%、42.58%、27.93%（P＜0.05）。相比對照組，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組空腸淀粉酶比活力分別提高了37.90%、65.32%、77.42%（P＜0.05），空腸脂肪酶比活力分別提高了36.37%、59.14%、40.18%（P＜0.05），空腸蛋白酶比活力分別提高了14.69%、52.53%、29.12%（P＜0.05）。相比對照組，試驗Ⅰ、Ⅱ組回腸淀粉酶比活力分別提高了24.00%、60.00%（P＜0.05），試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組回腸脂肪酶比活力分別提高了33.85%、53.24%、40.11%（P＜0.05），回腸蛋白酶比活力分別提高了24.05%、39.12%、28.70%（P＜0.05）。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞生產(chǎn)性能及器官指數(shù)的影響

表3 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞血清生化指標(biāo)的影響（n=12）

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞血清生殖激素和卵巢FSHR、LHR mRNA 表達量的影響 由表5 可知，相比對照組，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組FSH 分別提高14.74%、25.69%、14.74%（P＜0.05），E2分 別 提 高6.96%、8.17%、14.22%（P＜0.05）。各試驗組的血清LH 水平有提高趨勢（P＞0.05）。各試驗組的卵巢FSHR mRNA 表達量隨著劑量的升高呈先上升后下降的變化特點，與對照組相比，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別提高53.27%、58.88%、54.21%（P＜0.05）。LHR mRNA 的表達量變化規(guī)律與FSHR mRNA 類似，但各組間差異不顯著。

3 討 論

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌制劑對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能和器官指數(shù)的影響 本試驗結(jié)果表明，產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加適量的凝結(jié)芽孢桿菌可提高蛋雞產(chǎn)蛋率和降低料蛋比；可顯著提高蛋雞的脾臟指數(shù)，對心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、胰臟指數(shù)有提高趨勢。趙必遷等[2]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高產(chǎn)蛋高峰期的產(chǎn)蛋率，降低破蛋率。黃遵錫等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著降低不合格蛋率，降低料蛋比。陳曉帥等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在肉鴿飼糧中添加復(fù)合益生菌提高了乳鴿的脾臟指數(shù)、心臟指數(shù)。趙娜等[6]研究結(jié)果顯示，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可提高免疫器官指數(shù)，降低死淘率。這可能是由于凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)可大量繁殖，不斷合成有益物質(zhì)，可作為抗原刺激免疫器官生長發(fā)育，適度提高蛋雞免疫水平[7]，從而提高蛋雞生產(chǎn)性能。

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞血清生化指標(biāo)的影響 本試驗中，在產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高血清中ALP、Ca、P 含量，顯著降低血清中TG、Urea 含量，對TP、ALB、Glob、A/G、Glu 含量均有提高作用，TC 含量有降低趨勢。林麗花等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在黃羽肉雞飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌對血清中TP、ALB、ALP 含量均有提高作用。黃世猛等[9]報道，凝結(jié)芽孢桿菌能降低蛋雞血清TG 和TC 含量，促進蛋雞Ca、P 的消化吸收。以上研究結(jié)果提示，凝結(jié)芽孢桿菌具有加強蛋白質(zhì)合成代謝[10]，降低分解代謝的作用，改善腸道健康，提高Ca、P 吸收，為蛋雞生產(chǎn)性能的提高提供營養(yǎng)保證，從而提高蛋雞生產(chǎn)性能。

表4 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞小腸黏膜消化酶比活力的影響（n=12）

表5 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞血清生殖激素水平和卵巢FSHR 、LHR mRNA 表達量的影響（n=12）

3.3 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞小腸黏膜消化酶比活力的影響 本試驗發(fā)現(xiàn)，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞小腸黏膜淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶比活力?？锶旱萚11]研究表明，飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高武昌魚的蛋白酶活力、蛋白質(zhì)利用效率和生長率。曾麗莉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌能顯著提高肉鴨十二指腸淀粉酶活性和胰蛋白酶活性。這可能由于凝結(jié)芽孢桿菌可產(chǎn)生乳酸降低腸道pH，產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶類和酶促因子，降解果膠、葡聚糖、纖維素等復(fù)雜的碳水化合物[13-15]，提高腸道中消化酶的比活力，改善機體消化功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進而提高蛋雞生產(chǎn)性能。

3.4 凝結(jié)芽孢桿菌對蛋雞血清生殖激素及卵巢受體基因表達量的影響 本試驗研究表明，添加不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌顯著提高了FSH 和E2的濃度，對LH 有提高趨勢；卵巢LHR mRNA 和FSHR mRNA 的表達量與LH 和FSH 呈相同的變化規(guī)律。Lei 等[16]報道，地衣芽孢桿菌能提高蛋雞血清FSH 和E2含量。丁陽等[17]研究認為，血清FSH 含量與卵巢FSHR mRNA、LHR mRNA 表達量呈較強的正相關(guān)。該菌可能是通過提高機體代謝、蛋白合成、調(diào)控激素分泌等途徑，使卵巢生殖系統(tǒng)更加健康，促進卵巢上繁殖相關(guān)受體基因表達，從而對卵巢上卵泡發(fā)育造成影響，進而提高其產(chǎn)蛋性能。

4 結(jié) 論

凝結(jié)芽孢桿菌制劑可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，提高蛋雞生產(chǎn)性能。凝結(jié)芽孢桿菌提高蛋雞生產(chǎn)性能的主要機理：①適當(dāng)提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的免疫力、消化能力，進而改善血清生化指標(biāo)，提高蛋白合成能力。②促進性腺激素釋放和卵巢上繁殖相關(guān)受體基因表達。