貝萊斯芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆、表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)分析

陳 龍，吳興利，閆曉剛，谷 巍，徐海燕，錢愛東，王春鳳，張芳毓*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林公主嶺 136100；2. 山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安 271000；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

纖維素水解一直是人們關(guān)注的焦點和研究的熱點[1]。通常，內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase，EC 3.2.1.4）主要參與纖維素分解的初始階段，與外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）和β- 葡糖苷酶（EC 3.2.1.21）以協(xié)同作用的方式誘導(dǎo)纖維素完全水解生成葡萄糖[2-3]。目前，內(nèi)切葡聚糖酶被成功應(yīng)用于洗滌劑[4-6]、動物飼料[7-9]、紙漿和造紙工業(yè)中[10]。芽孢桿菌具有較高的生長速率和較短的發(fā)酵周期，且是生產(chǎn)纖維素酶的重要種屬之一[11-14]。據(jù)報道，芽孢桿菌的纖維素酶屬于糖基水解酶5（GH5）家族[15]，研究人員已嘗試在異源宿主大腸桿菌中進(jìn)行克隆并表達(dá)纖維素酶基因[10]。雖然大腸桿菌因易于遺傳操作，是重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主，但在大腸桿菌中進(jìn)行纖維素酶基因的表達(dá)存在2 個亟待解決的問題：第一，將重組蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中一直是阻礙其直接工業(yè)化應(yīng)用的難題[10]；第二，在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，高溫導(dǎo)致內(nèi)切葡聚糖酶活性降低[16]，內(nèi)切葡聚糖酶活性受纖維素酶自身特性和高溫等環(huán)境壓力的影響[17-18]。因此，對具有高活性和熱穩(wěn)定性的重組內(nèi)切葡聚糖酶的研究仍在繼續(xù)[19]。

在前期研究中，本實驗室從杜仲樹皮內(nèi)分離到一株B. velezensis 157，具有較高的內(nèi)切葡聚糖酶活力[20-21]。本研究對編碼B. velezensis 157 的內(nèi)切葡聚糖酶基因在大腸桿菌進(jìn)行克隆和表達(dá)，并對重組酶進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 B. velezensis 157 由本實驗室分離并保存，Peasy-Blunt Cloning Kit 克隆載體購自TaKaRa公司，Trans1-T1 宿主菌購自北京全式金公司，pET-32a表達(dá)載體，BL21（DE3）宿主菌由本實驗室保存。

1.2 目的基因的克隆與序列分析 取適量純化培養(yǎng)后B. velezensis 157 菌液，根據(jù)AXYGEN 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購自AXYGEN 公司）的說明書進(jìn)行操作。根據(jù)NCBI 上已登錄的芽孢桿菌屬內(nèi)切纖維素酶基因序列（登錄號：KY797654），應(yīng)用Primer Premier 7.0 軟件設(shè)計1 對特異性引物：C1： CCATGAAAC GGTCAATTTCTATTTTTA；C2：CGCTAATT GGGT TCT GTACCCCAAATC。其中下劃線部分分別為Bam HI 和Hind III 限制性內(nèi)切酶切位點。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：0.5 μL 引物C1（濃度為0.25 μmol/L）、0.5 μL 引物C2（濃度為0.25 μmol/L）、2 μL dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸，濃度為1.25 mmol/L）、2.5 μL10×PCR 緩 沖 液（10mmol/L）、0.25 μL Ex Taq 酶（2.5 U/μL）、1 μL B. velezensis 157 基因組DNA、補(bǔ)充雙蒸水至25 μL。DNA marker、Ex Taq 聚合酶、Bam HI 和Hind III 限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶均購自TaKaRa 公司。

預(yù)變性、變性、退火、延伸的反應(yīng)參數(shù)分別為94℃5 min、30 個循環(huán)（94℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 1 min）、72℃ 10 min。取2 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，利用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒（購自AXYGEN 公司）對產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，PCR 產(chǎn)物交由庫美公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用BLAST 序列同源性分析，ORF Finder 軟件進(jìn)行開放閱讀框分析，利用NCBI 中BLASTX 程序與已知芽孢桿菌屬內(nèi)切纖維素酶基因進(jìn)行比對，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建內(nèi)切葡聚糖酶基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。內(nèi)切葡聚糖酶氨基酸序列通過EXPASY、Signal P 3.0 Server、Pfam、CLC sequence Viewer 7.5、Illustrator for biological sequences 等軟件進(jìn)行分析[23]。

1.3 pEASY-157-CMCase 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 將CMCase基因的DNA 回收產(chǎn)物與Peasy 載體連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行Trans1-T1 轉(zhuǎn)化等均按照p EASY-Blunt Cloning Kit使用說明操作。將內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆質(zhì)粒稱為pEASY-157-CMCase，提取質(zhì)粒（質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN 公司）經(jīng)PCR 驗證后，送至庫美公司測序鑒定。連接反應(yīng)體系包括4 μL PCR 產(chǎn)物和1 μL pEASYBlunt 克隆載體。

1.4 pET32a-157-CMCase 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 取實驗室凍干保存的含pET32a 質(zhì)粒的宿主菌DH5α 進(jìn)行復(fù)蘇，用液體LB 搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆?。分別利用Bam HI 和Hind III 限制性內(nèi)切酶，對測序正確的pEASY-157-CMCase 克隆質(zhì)粒與pET32a 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶 切，37 ℃水 浴4 h。50 μL 體 系：43 μL pEASY-157-CMCase 質(zhì)粒、5 μL 10×Buffer（1×K）、1 μL Hind III、1 μL Bam H I。分別回收內(nèi)切纖維素酶片段和pET-32a空載體，用T4 連接酶將目的片段與空載體連接，16℃金屬浴中過夜連接，10 μL 體系：6 μL157-CMCase 目的基因、1 μL10×連接酶緩沖液、1 μL T4 連接酶和2 μL pET32a 載體。將過夜連接的重組pET32a-157-CMCase表達(dá)質(zhì)粒先進(jìn)行DH5α 感受態(tài)轉(zhuǎn)化，利用氨芐青霉素抗性篩選單菌落并進(jìn)行提質(zhì)粒、PCR 以及雙酶切驗證，并送至庫美公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21（DE3）并驗證，并命名pET32a-157-CMCase BL21（DE3）。

1.5 ET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的表達(dá)

1.5.1 重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析 將構(gòu)建好的pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌，以1%轉(zhuǎn)接入100 mL 的液體LB（含Amp）培養(yǎng)至對數(shù)期。加入0.4 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)8 h 后，于4℃ 12 000 r/min 離心20 min，洗菌3 次，進(jìn)行超聲破碎10 min（工作時間3 s，間隔時間3 s，總定時次數(shù)200），取超聲破碎產(chǎn)物經(jīng)12 000 r/min，4℃離心20 min 后，將沉淀和上清分別與等量的2×蛋白上樣緩沖液混合，經(jīng)沸水煮沸10 min 后進(jìn)行SDSPAGE 檢測，廣譜蛋白Marker 購自北京全式金公司。

1.5.2 重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化、產(chǎn)酶部位確定及纖維素酶平板檢測 間優(yōu)化：將重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌以1%含量接入多瓶液體LB（含Amp）培養(yǎng)至對數(shù)期，設(shè)置非誘導(dǎo)對照組，其余試驗組加入0.4 mmol/L IPTG后于37℃ 分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10 h，取適量誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎處理后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。IPTG 濃度的優(yōu)化：將IPTG 的濃度設(shè)定為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的IPTG，誘導(dǎo)10 h 后，菌液經(jīng)超聲破碎處理后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。

取經(jīng)優(yōu)化誘導(dǎo)的重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌菌液15 mL，12 000 r/min，4℃離心20 min，上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，收集上清液作為上清組；加入PBS 緩沖液加到原體積重懸菌體進(jìn)行超聲破碎處理，工作時間3 s，間隔時間3 s，總定時次數(shù)200，破碎后于12 000 r/min，4℃離心20 min，上清液即為破碎菌體粗酶液；將誘導(dǎo)后的原菌液直接進(jìn)行超聲破碎處理即為上清液+菌體組。利用DNS 測定這3 部分的內(nèi)切纖維素酶活力，確定纖維素酶產(chǎn)生部位[10]。最后通過剛果紅染色法檢驗纖維素酶水解圈。上述試驗均平行操作3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.6 內(nèi)切纖維素的酶活性測定 參考文獻(xiàn)[21]配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其OD540nm值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。上清粗酶液的制備參考方法1.5.2。采用DNS 法檢測內(nèi)切纖維素酶活力以及DNS 的配置參考文獻(xiàn)[24]：以0.05 mol/L，pH 為 5.0 的檸檬酸緩沖液作為溶劑，配置含1% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的底物溶液。取100 μL 底物與50 μL 粗酶液充分混合，于50℃恒溫條件下水浴30 min，之后加入200 μL DNS 溶液終止反應(yīng)，在沸水中煮沸5 min，冰水中冷卻，加入1 mL蒸餾水混勻，取其中300 μL 加入酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀測定540 nm 下吸光值。每分鐘底物被酶解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為一個酶活力單位（IU）。

1.7 重組纖維素酶菌株的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.7.1 內(nèi)切葡聚糖酶酶促反應(yīng)的最適溫度與熱穩(wěn)定性 在pH 為 5.0 的條件下，將粗酶液與檸檬酸緩沖液混合后，分別以30～90℃為反應(yīng)溫度作用30 min，分別測定相應(yīng)內(nèi)切葡聚糖酶酶活，最高酶活值記為100%，計算出各個溫度下的相對酶活，確定出最適反應(yīng)溫度。在pH 5.0 的條件下，將粗酶液分別于40～90℃不同溫度條件下保持30 min 和60 min 后，待粗酶液溫度恢復(fù)至室溫，以標(biāo)準(zhǔn)條件（pH 為5.0，60℃作用30 min）下測定殘余內(nèi)切葡聚糖酶酶活，同時以標(biāo)準(zhǔn)條件下粗酶液的內(nèi)切葡聚糖酶酶活為100%，計算得出相對酶活，以此確定內(nèi)切葡聚糖酶酶活的熱穩(wěn)定性。

1.7.2 內(nèi)切葡聚糖酶酶促反應(yīng)的最適p H 與p H 穩(wěn)定性 在60℃的條件下，將粗酶液分別與pH 為4、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的緩沖劑的底物（1% CMC-Na）混合，作用30 min，然后測定在這些pH 條件下的內(nèi)切葡聚糖酶酶活，以酶活最高值記為100%，計算出各個pH 下的相對酶活，確定出最適反應(yīng)pH。將粗酶液分別于p H 為4、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的緩沖劑中60℃保持30 min 和60 min 后，以標(biāo)準(zhǔn)條件（pH 為5.0，60℃作用30 min）下測定殘余內(nèi)切葡聚糖酶酶活，同時以標(biāo)準(zhǔn)條件下粗酶液的內(nèi)切葡聚糖酶酶活為100%，計算得出相對酶活，確定內(nèi)切葡聚糖酶的p H 穩(wěn)定性。

1.7.3 各種金屬離子和化合物對內(nèi)切葡聚糖酶的影響 配置10 mmol/L 的 金 屬 離 子（BaCl2、CaCl2、NaCl、HgCl2、FeCl2、MgCl2、MnCl2、CoCl2、ZnCl2、CuCl2、KCl）；酶抑制劑（10 mmol/L EDTA、10 mmol/L 尿素、10 mmol/L β-疏基乙醇、1 mmol/L DMSO、1 mmol/L DEPC、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L DTT），1%（v/v）的表面活性劑（Triton-X-100、Tween-20、Tween-80、SDS），緩沖劑是0.05 mol/L p H 5.0 的檸檬酸緩沖液。測定粗酶液分別與上述溶液混合保持60 min 后的酶活。以標(biāo)準(zhǔn)條件下粗酶液的內(nèi)切葡聚糖酶酶活為100%，計算得出相對酶活，以此確定各種金屬離子和化合物對內(nèi)切葡聚糖酶酶活的影響。

1.7. 4 內(nèi)切葡聚糖酶底物專一性的測定 分別以用0.05 mol/L，pH 5.0 的檸檬酸緩沖劑配置的1%CMC-Na、水楊苷、木聚糖、Whatman 濾紙、纖維二糖、微晶纖維素作為底物，測定內(nèi)切葡聚糖酶對不同底物的酶活，確定內(nèi)切葡聚糖酶的底物專一性。

1.8 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)處理采用Graph Prism 7.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）并繪制折線圖和柱狀圖，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶基因的原核表達(dá)

2.1.1 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆與序列分析 以提取的B. velezensis 157 基因組為模板，經(jīng)PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序分析，獲得與預(yù)期片段大小相符的1 500 bp（圖1）。

圖1 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶的PCR 擴(kuò)增

2.1.2 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶基因的進(jìn)化樹分析 將 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶基因經(jīng)Blast 檢測比對，應(yīng)用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2 可見，B. velezensis 157 的內(nèi)切葡聚糖酶蛋白自成一支；與B. velezensis SCGB 574 （CP023431.1）、B. velezensis JS25R （CP009679.1）、B. velezensis NAU-B3（HG514499.1）的內(nèi)切纖維素酶基因相似度較高。

圖2 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶基因的進(jìn)化樹分析

2.1.3 重組內(nèi)切葡聚糖酶基因的蛋白序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測 纖維素酶蛋白一級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果表明由499 個氨基酸組成，分子式為C2447H3788N678O754S8，預(yù)測分子量為55.02 ku，理論等電點（pI）為8.71，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為52，帶正電荷的殘基總數(shù)為57。纖維素酶基因最大開放閱讀框ORF 分析基因大小為1 500 bp，已ATG 為起始密碼子，TAG 為終止密碼子。應(yīng)用PSIPRED 3.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，coil 無規(guī)則卷曲共計226 個氨基酸占45.29%，a- 螺旋共142 個氨基酸占28.45%，β-折疊共131 個氨基酸占26.25%。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，應(yīng)用Swiss-Model Workspace 同源建模，由于B. velezensis 157 的內(nèi)切纖維素酶基因與Bacillus sp. 3pzt.1.A 序列相似度為96.08%。因此，以3pzt.1.A序列為模板進(jìn)行同源建模，3D 模型見圖3。

圖3 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶的預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)

信號肽分析：基于Y-Max 判定，最可能的剪切位點預(yù)測在第29 和第30 之間，第30 位為最理想的剪切位點，成熟蛋白啟動的位置30 位，本蛋白具有信號肽。親疏水性分析：經(jīng)ProtScale 軟件對蛋白質(zhì)親疏水性的分析發(fā)現(xiàn)，在13 氨基酸位點處具有1 個疏水區(qū)，在143 氨基酸位點具有1 個親水區(qū)域?？缒^(qū)分析：應(yīng)用TMHMM 2.0 軟件進(jìn)行跨膜區(qū)分析，1～4 位氨基酸位于細(xì)胞內(nèi)部，5～27 位氨基酸之間形成一個典型的跨膜螺旋區(qū)，28～499 位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，表明B. velezensis 157 的內(nèi)切纖維素酶可能是一個與細(xì)胞信號傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。

利用Illustrator for Biological Sequences （IBS）軟件內(nèi)切葡聚糖酶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。由圖4 可見，5～27 氨基酸編碼跨膜區(qū)域，50～297 氨基酸編碼纖維素酶區(qū)域，屬于糖苷水解酶GH5 家族（EC 3.2.1.4），356～437 氨基酸編碼碳水化合物結(jié)合模塊，其中9～445 氨基酸編碼BglC 基因。

圖4 B. velezensis 157 內(nèi)切葡聚糖酶的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-157-CMCase 的構(gòu)建與鑒定 利用純化內(nèi)切葡聚糖酶基因構(gòu)建pET32a-157-CMCase質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR 法鑒定發(fā)現(xiàn)，在1 500 bp 處的條帶與目的基因大小相符的條帶（圖5）。

2.2.1 重組內(nèi)切葡聚糖酶基因表達(dá)條件的優(yōu)化及可溶性分析 經(jīng)IPTG 和時間誘導(dǎo)優(yōu)化后，用SDS-PAGE 檢測蛋白表達(dá)情況。從圖6 和圖7 可以看出，隨著誘導(dǎo)物濃度增加表達(dá)量無明顯變化，且加入0.4 mmol/L 誘導(dǎo)劑時菌株表達(dá)量最佳；菌株表達(dá)量最佳誘導(dǎo)時間為8 h。

圖5 重組質(zhì)粒pET32a-157-CMCase 的雙酶切鑒定

圖6 重組質(zhì)粒pET32a-157-CMCase 誘導(dǎo)劑最佳濃度的SDS-PAGE 分析

圖7 重組質(zhì)粒pET32a-157-CMCase 誘導(dǎo)劑最佳時間的SDS-PAGE 分析

2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程為y=0.462x－0.085，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)為0.999，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求，可以用于后續(xù)酶活力計算。

2.2.3 重組內(nèi)切葡聚糖酶的胞內(nèi)外分析 由圖8 可見，重組pET32a-157-CMCase 蛋白在上清中可檢測到纖維素酶活力為5.81 IU/mL，細(xì)菌沉淀中為1.61 IU/mL；誘導(dǎo)后原菌液直接超聲破碎處理纖維素酶活力可達(dá)7.41 IU/mL，其酶活力為野生菌株B. velezensis 157的2.3倍（P＜0.000 1），說明重組菌株p ET32a-157-CMCase 可進(jìn)行纖維素酶表達(dá)，且產(chǎn)生的纖維素酶主要進(jìn)行分泌表達(dá)。因此，后續(xù)采用誘導(dǎo)后上清液可直接進(jìn)行重組纖維素酶活的分析。

圖8 重組內(nèi)切葡聚糖酶的胞內(nèi)外分析

2.2.4 重組內(nèi)切葡聚糖酶的CMC 平板驗證 重組pET32a-157-CMCase 蛋白能夠在CMC-Na 篩選平板上生長，且經(jīng)過剛果紅染色后，出現(xiàn)明顯的透明圈（圖9），證明重組菌株具有分泌內(nèi)切葡聚糖酶力的能力。

圖9 重組內(nèi)切葡聚糖酶的羧甲基纖維素鈉篩選平板驗證

2.2.5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.5.1 重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度、pH 以及溫度和pH 的穩(wěn)定性 重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適酶反應(yīng)溫度和p H 分別為50℃和6（圖10-a 和10-c）。重組內(nèi)切葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性（圖10-b）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫度在40～50℃時，相對剩余酶活力均高于90%，隨著溫度升高酶活逐漸降低，當(dāng)溫度高于60℃，酶活力相對剩余酶活約為75.87%（30 min），隨著作用時間的延長，酶活力下降到72.13%（60 min）。重組內(nèi)切葡聚糖酶pH 穩(wěn)定性（圖10-d）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在p H 為5 時，相對酶活力約為86.45%左右；在p H 6～10 時耐受性良好，相對剩余酶活力均高于90%；隨作用時間的延長，對相對剩余酶活力影響不大。

2.2.5.2 不同金屬離子及添加劑對重組內(nèi)切葡聚糖酶的影響 由表1 可知，Na+、Mg2+、Mn2+可以促進(jìn)重組內(nèi)切葡聚糖酶，而Co2+、Zn2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+等金屬離子抑制內(nèi)切葡聚糖酶。表面活性劑SDS 和DTT 抑制重組內(nèi)切葡聚糖酶。

圖10 重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度（a）、pH（c）及溫度（b）和pH（d）穩(wěn)定性

2.2.5.3 重組內(nèi)切葡聚糖酶的底物專一性 從表2 可發(fā)現(xiàn)，對羧甲基纖維素鈉具有最高的酶活力，同時對微晶纖維素、纖維二糖、木聚糖、濾紙、水楊苷均有一定酶活力，對水楊苷酶活力利用能力最低。表明重組內(nèi)切葡聚糖酶具有典型內(nèi)切纖維素酶的特征。

表1 各種金屬離子和化學(xué)試劑對重組內(nèi)切葡聚糖酶的影響 %

表2 重組內(nèi)切葡聚糖酶的底物專一性 %

3 討 論

B. velezensis 157 是一株能夠分泌多種木質(zhì)纖維素酶的芽孢桿菌，包括：內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、果膠酶等[21]。本研究中，B. velezensis 157 的胞外內(nèi)切葡聚糖酶可達(dá)3.24 IU/mL，但胞外提取物成分復(fù)雜，不利于回收，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。纖維素酶在外源宿主中的過表達(dá)是解決野生菌株纖維素酶產(chǎn)量低、難回收等問題的優(yōu)良替代方法。本研究中，重組內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)量與野生菌株相比，增加了2.3 倍，說明大腸桿菌系統(tǒng)的重組表達(dá)水平更高，有望代替野生菌株作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)纖維素酶制劑，將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖[24]。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)胞外分泌的纖維素酶活性比胞內(nèi)纖維素酶活性高，在開發(fā)重組纖維素酶方面具有關(guān)鍵意義。目前，胞外纖維素酶產(chǎn)量高且能夠進(jìn)行胞外分泌表達(dá)的報道有限，重組纖維素酶的開發(fā)面臨困難重重。Kim 等[25]報道，B. circulans 和B. licheniformis中內(nèi)切葡聚糖酶可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中100%進(jìn)行胞外分泌表達(dá)。與上述報道相反，Koide 等[26]對來自B. subtilis IF03034 的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行大腸桿菌克隆和表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其胞外內(nèi)切葡聚糖酶活性僅為25%。而來自B. subtilis DLG 的內(nèi)切葡聚糖酶在大腸桿菌中胞外分泌表達(dá)甚至更少（約1%），且重組內(nèi)切葡聚糖酶大部分存在于胞質(zhì)周間或胞質(zhì)膜內(nèi)[27]。本實驗對重組內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行胞內(nèi)外分析發(fā)現(xiàn)，重組內(nèi)切葡聚糖酶在上清中可檢測到纖維素酶活力為5.81 IU/mL，細(xì)菌沉淀中為1.61 IU/mL，誘導(dǎo)后原菌液直接超聲破碎處理纖維素酶活力可7.41 IU/mL。本研究結(jié)果與Pandey 等[10]報道的重組一株Bacillus subtilis IARI-SP-1 的內(nèi)切葡聚糖酶結(jié)果相似，其重組內(nèi)切葡聚糖酶在上清中可檢測到纖維素酶活力為8.2 IU/mL，細(xì)菌沉淀中為2.8 IU/mL，誘導(dǎo)后原菌液直接超聲破碎處理纖維素酶活力可10 IU/mL。因此，說明重組Bacillus velezensis 157 的內(nèi)切葡聚糖酶可進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，且產(chǎn)生的纖維素酶主要進(jìn)行分泌表達(dá)，從SDS-PAGE 得到的重組葡聚糖酶分子量約為55 ku，與其他芽孢桿菌報道的內(nèi)切葡聚糖酶的分子量相似[28～29]。此外，重組內(nèi)切葡聚糖酶能夠在CMC 篩選平板上生長，且經(jīng)過剛果紅染色后，出現(xiàn)明顯的透明圈，再次證明重組內(nèi)切葡聚糖酶在BL21 菌株中可進(jìn)行胞外分泌表達(dá)。Yang 等[28]也利用剛果紅染色法驗證重組pET25bcelI15 菌株的胞外內(nèi)切纖維素酶活性。重組蛋白的胞外分泌生產(chǎn)比胞質(zhì)周間或胞質(zhì)膜內(nèi)更具有優(yōu)勢。細(xì)胞外生產(chǎn)不需要裂解細(xì)胞外膜來獲得目標(biāo)蛋白，可連續(xù)生產(chǎn)重組蛋白。因此，大腸桿菌系統(tǒng)可用于細(xì)胞外生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶，用于后續(xù)內(nèi)切葡聚糖酶的表征。

本實驗結(jié)果表明，重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適酶反應(yīng)溫度和pH 分別為50℃和6，在40～60℃具有一定的溫度耐受性，在pH 6～10 范圍內(nèi)具有較好的pH 耐受性；重組內(nèi)切葡聚糖酶溫度穩(wěn)定性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在60℃放置1 h，相對剩余酶活力高于70% 以上，表明重組內(nèi)切葡聚糖酶具有一定的耐熱性，適用于制漿行業(yè)等需要較高溫度的工業(yè)化生產(chǎn)。但其酶的穩(wěn)定性低于Yang 等[28]報道的重組Bacillus subtilis I15 的內(nèi)切葡聚糖酶，在65℃放置2 h 仍可保持90%以上的相對剩余酶活力。重組內(nèi)切葡聚糖酶的pH 穩(wěn)定性可以看出，在p H 為5 時，相對酶活力約為86.45%左右，在p H 6～10 時耐受性良好，相對剩余酶活力均高于90%，隨作用時間的延長，對相對剩余酶活力影響不大。重組內(nèi)切纖維素酶p H 穩(wěn)定性高于Bacillus subtilis IARI-SP-1[10]、 B. licheniformis AU01[13]、B. amyloliquefaciens DL-3[12]和B. subtilis A-53[25]等的報道。各種金屬離子和化學(xué)試劑對重組內(nèi)切葡聚糖酶的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Na+、Ca2+、Mg2+可以促進(jìn)重組內(nèi)切葡聚糖酶，而Co2+、Zn2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+等金屬離子和表面活性劑SDS 抑制重組內(nèi)切葡聚糖 酶。Zafar[30]報道，重組Bacillus subtilis JS2004 的內(nèi)切葡聚糖酶，Ca2+、Mg2+、Tween 20 能夠激活重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活，而Ni2+、Hg2+、Zn2+、Cu2+以及SDS抑制其酶活力，與本實驗結(jié)果相一致。重組內(nèi)切葡聚糖酶的底物專一性實驗發(fā)現(xiàn)，對羧甲基纖維素鈉具有最高的酶活力，同時對微晶纖維素、纖維二糖、木聚糖、濾紙、水楊苷均有一定酶活力，表明重組內(nèi)切葡聚糖酶具有典型內(nèi)切纖維素酶特征，且具有利用底物廣的特點。本實驗結(jié)果與Hakamada 等[31]報道的Bacillus sp. KSM-S237 結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

本實驗成功將野生菌株B. velezensis 157 的內(nèi)切葡聚糖酶在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行克隆和表達(dá)，成功構(gòu)建了分泌型重組內(nèi)切葡聚糖酶的大腸桿菌，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。重組內(nèi)切葡聚糖酶的分子量約為55 ku，經(jīng)0.4 mmol/L IPTG 和8 h 誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化后，在培養(yǎng)上清、菌體以及直接超聲破碎的原菌液中可檢測到內(nèi)切葡聚糖酶活力分別為5.81、1.61、7.41 IU/mL，為野生菌株內(nèi)切葡聚糖酶的2.3 倍。重組內(nèi)切葡聚糖酶具有典型內(nèi)切纖維素酶的特征，其最適酶反應(yīng)溫度和pH 分別為50℃和6，在40～60℃具有一定的溫度耐受性，在pH 6～10 范圍內(nèi)具有較好的pH 耐受性。Na+可以促進(jìn)重組內(nèi)切葡聚糖酶活力，而Co2+、Hg2+、Fe2+等金屬離子以及表面活性劑SDS 具有較強(qiáng)的抑制作用。本實驗室正試圖利用纖維素酶的過表達(dá)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，作為纖維素酶制劑用于動物生產(chǎn)。預(yù)計還將進(jìn)一步地進(jìn)行實驗條件優(yōu)化，以便最大限度地將生物質(zhì)材料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖。