授粉方法對(duì)克服菊科近緣屬雜交受精前障礙的影響

聶梅，張紅，馮雁夢(mèng)，牛顏冰，呂晉慧

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030800)

太行菊屬作為菊科菊蒿亞族植物[1]，僅包括太行菊(Opisthopappustaihangensis)和長(zhǎng)裂太行菊(Opisthopappuslongilobus)兩個(gè)種，均可分泌芳香物質(zhì)，尤以長(zhǎng)裂太行菊為佳，將其與菊屬品種雜交有可能獲得具有芳香味的菊花新品種，對(duì)于瀕危種質(zhì)資源的保存和應(yīng)用意義重大.菊花是高度雜合的異源多倍體，且為異花授粉植物，菊科不同屬間天然雜交現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，使得菊花自交親和性差、結(jié)實(shí)率低[2-3].授粉后，花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)是否正常是衡量雜交親本是否存在受精前障礙的重要標(biāo)志之一[4].近年來(lái)，研究者們使用多種授粉方法克服屬間及種間雜交障礙，如李辛雷等[5]采用的混合花粉授粉法，陳瓊等[6]使用的切割柱頭授粉法，王旭等[7]用硼酸處理柱頭等法均可提高芍藥的親和指數(shù)；耿興敏[8]用鹽水涂抹柱頭增加了杜鵑雜交結(jié)實(shí)率.關(guān)于克服菊花受精前障礙方面，目前常用的方法有混合授粉、重復(fù)授粉、切割柱頭以及花粉培養(yǎng)液等[9-10]，其中液體介質(zhì)授粉法在不同品種菊花自交中應(yīng)用較為廣泛，但在菊科近緣屬雜交中尚未見(jiàn)報(bào)道.因此，通過(guò)不同化學(xué)藥劑處理柱頭或花粉，是否增強(qiáng)異種柱頭接受異緣花粉的能力，是克服菊科不同屬間受精前障礙研究中亟待解決的問(wèn)題.本研究將太行菊屬長(zhǎng)裂太行菊與地被菊‘賽牡丹’雜交，采用不同授粉方法處理花粉及柱頭，探究其對(duì)太行菊屬及其近緣屬雜交后花粉附著、萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的影響，旨在為菊科不同屬間品種遠(yuǎn)緣雜交提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材為2個(gè)菊科近緣屬品種，長(zhǎng)裂太行菊(2n=18)為野生種，‘賽牡丹’(2n=54)為自育品種.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雜交方法 于9月中旬晴天10∶00～14∶00進(jìn)行人工授粉，授粉前母本去雄，同時(shí)剪至可見(jiàn)Y型柱頭(不能傷及柱頭)，授粉后進(jìn)行套袋隔離并做好標(biāo)記.

1.2.2 授粉方法 以長(zhǎng)裂太行菊(♀)ב賽牡丹’(♂)為親本，以新鮮花粉直接授粉作對(duì)照.

液體介質(zhì)授粉法：配制等體積的液體介質(zhì)于4 ℃冰箱中保存，使用前混入新鮮花粉100 mg.授粉后0.5、1、2、4、8、12、24 h觀(guān)察記錄.液體介質(zhì)為：

① 100 mg/L蔗糖；② 100 mg/L蔗糖+Ca2+(0.1、0.3、0.6 mg/L)；③ 100 mg/L蔗糖+硼酸(0.025、0.05、0.1 mg/L).

NaCl涂抹柱頭法：2%、5%、8% NaCl分別處理柱頭0.5、1、6、12 h，授粉后0.5、2、6、12、24 h觀(guān)察記錄.

1.2.3 熒光顯微觀(guān)察 授粉后于不同觀(guān)察時(shí)間分別取5個(gè)花序，用FAA固定液(70%酒精∶冰醋酸∶福爾馬林=90∶5∶5)固定，4 ℃下保存?zhèn)溆?觀(guān)察時(shí)用1 mol/L氫氧化鈉軟化脫色7 h，蒸餾水沖洗3～4次，用含0.1 mol/L磷酸三鉀的0.1%苯胺藍(lán)溶液浸泡4 h，用甘油做雌蕊壓片.在Olympus-BX61熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照.統(tǒng)計(jì)花粉附著和萌發(fā)情況，并計(jì)算以下指標(biāo)：

平均每柱頭附著花粉數(shù)=附著花粉數(shù)/觀(guān)察雌蕊數(shù)

平均每柱頭萌發(fā)花粉數(shù)=萌發(fā)花粉數(shù)/觀(guān)察雌蕊數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel2010和SPSS19.0軟件進(jìn)行整理分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體介質(zhì)對(duì)花粉附著和萌發(fā)的影響

2.1.1 以蔗糖為介質(zhì)對(duì)花粉附著和萌發(fā)的影響 以蔗糖為介質(zhì)授粉，柱頭上花粉的附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)均隨著授粉后時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)(圖1).其中，授粉后1 h，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)為9.8粒，為新鮮花粉的4.08倍.授粉后1～4h，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)變化不大，授粉后8 h，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)高達(dá)15.5粒，顯著高于新鮮花粉(P<0.05).超過(guò)8 h后，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)仍多于對(duì)照.

授粉后1～4 h，100 mg/L蔗糖處理下花粉萌發(fā)數(shù)均顯著高于新鮮花粉(P<0.05)，授粉后8 h，花粉萌發(fā)量最多，為3.5粒，授粉后12、24 h，蔗糖及對(duì)照處理下花粉萌發(fā)量均為0.以蔗糖為介質(zhì)授粉，花粉萌發(fā)均正常，花粉管生長(zhǎng)粗且直(圖4).

2.1.2 以Ca2+為介質(zhì)對(duì)花粉附著與萌發(fā)的影響

不同濃度Ca2+授粉后花粉的附著數(shù)和萌發(fā)數(shù)均隨著授粉后時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)(圖2).其中，授粉后2 h，0.1 mg/L Ca2+處理花粉的附著數(shù)和萌發(fā)數(shù)分別為8.1粒、3.6粒，顯著高于其他處理(P<0.05)，比對(duì)照提前6 h達(dá)到最大值，授粉超過(guò)4 h后，對(duì)照處理花粉的附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)均顯著高于其他處理(P<0.05).授粉后1 h，0.3 mg/L Ca2+處理附著的花粉數(shù)為5粒，顯著高于對(duì)照和0.1 mg/L Ca2+處理，花粉的萌發(fā)數(shù)卻顯著低于后者(P<0.05)，且不同時(shí)間觀(guān)察柱頭上花粉的萌發(fā)數(shù)變化不大.不同時(shí)間觀(guān)察0.6 mg/L Ca2+處理后花粉的附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)均低于對(duì)照及其他處理.以不同濃度Ca2+為介質(zhì)授粉，柱頭上花粉量有所差異，花粉管正常生長(zhǎng)(圖4).

同一時(shí)間點(diǎn)不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).圖1 以蔗糖為介質(zhì)對(duì)花粉附著和萌發(fā)的影響Figure 1 Effect of sucrose on pollen attachment and germination

同一時(shí)間點(diǎn)不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).圖2 以Ca2+為介質(zhì)授粉對(duì)花粉附著與萌發(fā)的影響Figure 2 Effect of pollination with Ca2+ on pollen attachment and germination

2.1.3 以硼酸為介質(zhì)對(duì)花粉的附著與萌發(fā)的影響 不同濃度硼酸授粉后花粉的附著數(shù)和萌發(fā)數(shù)均隨著授粉后時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)(圖3).其中，授粉后1～8 h內(nèi)，對(duì)照處理柱頭上附著量顯著高于不同濃度硼酸處理(P<0.05)(圖3-A).授粉后4 h，0.025、0.05 mg/L硼酸及對(duì)照處理附著數(shù)均達(dá)到最大值，分別為7.4粒、6.5粒、13.4粒，授粉后2 h，0.1 mg/L硼酸處理附著數(shù)為4.8粒，比其他處理提前2 h達(dá)到最值.

授粉后1 h，0.025 mg/L硼酸處理花粉的萌發(fā)數(shù)顯著高于其他處理(P<0.05)(圖3-B).授粉后2～8 h，不同濃度硼酸處理花粉的萌發(fā)數(shù)均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，授粉后12、24 h，各處理花粉的萌發(fā)量接近0.以不同濃度硼酸為介質(zhì)授粉，花粉管萌發(fā)正常(圖4).

2.2 不同濃度NaCl處理柱頭對(duì)花粉附著與萌發(fā)的影響

由圖5可知，不同處理花粉的附著數(shù)均隨著NaCl濃度的升高而增加.同一濃度下，花粉附著數(shù)隨著NaCl處理柱頭時(shí)間的增加而降低，最佳處理時(shí)間為0.5 h.其中，不同濃度NaCl處理柱頭0.5 h、1 h，不同時(shí)間觀(guān)察，8%NaCl處理附著的花粉數(shù)顯著高于其他處理(P<0.05).授粉后24 h，8% NaCl處理柱頭0.5 h花粉的附著數(shù)高達(dá)32粒，分別為對(duì)照(新鮮花粉)、2% NaCl和5% NaCl處理的6.97倍、1.84倍、2.09倍.不同濃度NaCl處理柱頭6 h，黏附的花粉數(shù)存在差異.授粉后6、12 h，2%、5% NaCl處理花粉的附著數(shù)顯著高于8%NaCl處理(P<0.05)，授粉后0.5～12 h，8% NaCl處理附著數(shù)變化不大，授粉后24 h附著數(shù)達(dá)到最大值.

同一時(shí)間點(diǎn)不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).圖3 以硼酸為介質(zhì)授粉對(duì)花粉附著與萌發(fā)的影響Figure 3 Effect of pollination with boric acid on pollen adhesion and germination

A1～A4：100 mg/L 蔗糖授粉后0.5、1、2、8 h；B1～B2：0.1 mg/L、0.3 mg/L Ca2++100 mg/L蔗糖授粉后1 h；B3～B4：0.025 mg/L、0.05 mg/L硼酸+100 mg/L蔗糖授粉后1 h.A1～A4：0.5,1,2 and 8 h after pollination with 100 mg/L sucrose；B1～B2：0.1 mg/L,0.3 mg/L Ca2++100 mg/L sucrose for 1 h after pollination；B3～B4：0.025 mg/L,0.05 mg/L Boric acid +100 mg/L sucrose for 1 h after pollination.圖4 不同液體介質(zhì)對(duì)花粉附著及萌發(fā)的影響Figure 4 Effects of different liquid mediums on pollen adhesion and germination

A～D：不同濃度NaCl處理0.5、1、6、12 h后花粉的附著數(shù)；E～G：不同濃度NaCl處理0.5、1、6 h后花粉的萌發(fā)數(shù).A～D: The adhesion number of pollen after treatment of 0.5,1,6 and 12 h with different concentrations NaCl；E～G: The germination number of pollen after treatment of 0.5,1 and 6 h with different concentrations NaCl.圖5 不同濃度NaCl處理柱頭對(duì)花粉附著與萌發(fā)旳影響Figure 5 Effects of different concentrations of NaCl treatment on pollen attachment and germination

隨著授粉后時(shí)間的增加，不同濃度NaCl處理柱頭相同時(shí)間，花粉萌發(fā)數(shù)變化趨勢(shì)存在差異.其中，8%NaCl處理6 h，授粉后0.5 h，花粉的萌發(fā)數(shù)顯著高于2%、5% NaCl處理及對(duì)照(P<0.05),不同濃度處理柱頭12 h，花粉萌發(fā)數(shù)均為0.此外，不同濃度NaCl處理對(duì)花粉管的影響不同.其中，2%NaCl處理柱頭0.5、1 h，花粉管頂端出現(xiàn)破裂、分叉現(xiàn)象，5%NaCl處理柱頭0.5 h后，花粉管出現(xiàn)扭曲現(xiàn)象，8%NaCl處理柱頭0.5 h后，花粉萌發(fā)正常，花粉管頂端未出現(xiàn)異常(圖6).

A～C：2%、5%、8% NaCl分別處理柱頭0.5、1、6 h后授粉.A～C:2%,5%,8% NaCl respectively deal with the stigma for 0.5,1,6 h before pollination.圖6 不同濃度NaCl處理0.5、1、6 h后花粉的附著和萌發(fā)Figure 6 Pollen attachment and germination after different concentrations of NaCl treatment for 0.5、1、6 h

3 討論

菊花是孢子體型自交不親和植物，其雌蕊柱頭為干性的，通?；ǚ哿１灰种撇课怀霈F(xiàn)在柱頭上.授粉后花粉的黏附與萌發(fā)數(shù)量少、胼胝質(zhì)過(guò)多沉淀、花粉管異常生長(zhǎng)，均可導(dǎo)致雜交親本產(chǎn)生受精前障礙，增加受精失敗的概率.

3.1 液體介質(zhì)授粉法對(duì)花粉附著和萌發(fā)的影響

適宜的糖分可改善干燥型柱頭的濕潤(rùn)度和花粉的活力，花粉易萌發(fā)[9].糖類(lèi)物質(zhì)除了為花粉萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)外，同時(shí)還具維持外界環(huán)境的滲透壓，以促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)[11].鄧盛斌[12]、徐芬芬等[13]認(rèn)為，適宜的蔗糖利于花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng).羅鳳霞等[14]發(fā)現(xiàn)，花粉培養(yǎng)液添加100 mg/L蔗糖對(duì)百合雜交結(jié)籽普遍有促進(jìn)作用.以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，授粉后1～8 h，100 mg/L蔗糖可明顯促進(jìn)花粉附著和花粉萌發(fā)，且花粉管生長(zhǎng)正常.孫春青等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，人工授粉后24 h，平均每柱頭上萌發(fā)的花粉數(shù)量最多，這與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異，授粉后8 h，長(zhǎng)裂太行菊柱頭上花粉附著量最大，超過(guò)8 h后，其花粉附著量仍多于對(duì)照，但花粉萌發(fā)數(shù)降為0，說(shuō)明100 mg/L蔗糖可促進(jìn)花粉附著，且促進(jìn)作用持續(xù)較久.

Ca2+是花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)，且外源鈣可作為萌發(fā)時(shí)群體效應(yīng)的替代因子[16].本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Ca2+明顯促進(jìn)花粉附著和萌發(fā)，高濃度Ca2+則表現(xiàn)出抑制作用.這與賈文慶等[17]、鄭昀曄等[18]研究結(jié)論一致，外源鈣可顯著提高地被菊柱頭上異緣花粉的萌發(fā)率.薛曉敏等[19]、儲(chǔ)立民等[20]、姚成義等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+主要影響花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)速度.本研究中不同濃度Ca2+處理后花粉管粗且直，但對(duì)于花粉管生長(zhǎng)速度的影響有待深入研究.孫鵬等[22]發(fā)現(xiàn)授粉后2 h，授粉作用促使柱頭胞外基質(zhì)的鈣含量增加，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，0.1 mg/L Ca2+授粉后2 h，明顯促進(jìn)花粉附著和萌發(fā)，隨著授粉后時(shí)間的增加，促進(jìn)作用減弱.在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，0.3 mg/L Ca2+授粉后1 h促進(jìn)花粉附著，但不利于花粉萌發(fā)，這可能是由地被菊柱頭上存在的某種抑制物所致.

硼元素可增加氧的吸收，還可促進(jìn)糖平衡，與糖結(jié)合能極大地提高花粉的萌發(fā)率，且利于花粉管的形成、萌發(fā)[23].迄今有關(guān)硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的研究多數(shù)認(rèn)為一定濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng).蔣桂華等[24]發(fā)現(xiàn)，0.3 g/L硼酸促進(jìn)草莓花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng).杜玉虎等[25]發(fā)現(xiàn)，0.02%硼酸可顯著促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng).韓志強(qiáng)等[26]認(rèn)為0.015 g/L硼酸處理后，棗花粉的萌發(fā)率最高.這與本試驗(yàn)結(jié)果并不一致，且硼酸濃度高于試驗(yàn)中的處理水平，0.025 mg/L硼酸授粉后1 h花粉萌發(fā)量顯著多于對(duì)照，不同濃度硼酸授粉后0.5～24 h花粉附著量均低于對(duì)照，這可能與不同親本花粉的內(nèi)源硼含量有關(guān).

硼離子是酯化果膠的主要成分，參與花粉管壁脫酯化過(guò)程，可增加花粉管壁的可塑性[27].外源硼利于花粉管形成及生長(zhǎng)，這與試驗(yàn)中熒光顯微觀(guān)察的結(jié)果一致，不同濃度硼酸處理后花粉管正常生長(zhǎng)，粗且直.

3.2 NaCl涂抹柱頭法對(duì)花粉附著和萌發(fā)的影響

NaCl可破壞柱頭表面的蛋白層，對(duì)異源花粉的排斥力下降，說(shuō)明鹽處理在一定程度上能克服受精障礙[28].本研究得出，不同濃度NaCl處理柱頭，授粉后24 h內(nèi)，對(duì)花粉附著及萌發(fā)均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用，但花粉管生長(zhǎng)情況存在差異.安彩泰等[29]發(fā)現(xiàn)，10%NaCl溶液處理柱頭后顯著提高甘藍(lán)型油菜的萌發(fā)率.羅鳳霞等[14]認(rèn)為，食鹽水對(duì)花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用不穩(wěn)定.耿興敏等[8]、李建廠(chǎng)等[30]認(rèn)為，0.3%與1.0%鹽介質(zhì)均對(duì)花粉萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的負(fù)效應(yīng).試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同濃度NaCl處理柱頭0.5 h，授粉后24 h，柱頭上花粉附著量最高，但花粉的萌發(fā)量顯著少于對(duì)照.由此可推斷，花粉與雌蕊柱頭相互識(shí)別作用的過(guò)程中，雌蕊柱頭上可能存在抑制因子,阻礙了花粉的正常萌發(fā)，因而僅有較少花粉能夠在柱頭萌發(fā).NaCl通過(guò)破壞柱頭表面的乳突細(xì)胞，減少了胼胝質(zhì)反應(yīng)，達(dá)到了克服雜交障礙的作用[31].本研究中，隨著處理時(shí)間的增加，不同濃度NaCl涂抹柱頭均可抑制萌發(fā)，這是由于NaCl處理過(guò)久，致使乳突細(xì)胞出現(xiàn)萎蔫，影響柱頭活性.試驗(yàn)中較低濃度(2%、5%)NaCl處理后花粉管出現(xiàn)扭曲、分叉現(xiàn)象，這與NaCl溶液克服自交不親和的作用機(jī)理相悖[32]，可能是不同物種特性對(duì)NaCl的濃度要求不一.

4 結(jié)論

采用不同液體介質(zhì)授粉，花粉附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)授粉后24 h內(nèi)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，100 mg/L蔗糖可顯著促進(jìn)花粉的附著和萌發(fā).低濃度Ca2+(0.1 mg/L)促進(jìn)花粉的附著及萌發(fā)，高濃度Ca2+(0.6 mg/L)則表現(xiàn)出抑制作用.0.025 mg/L硼酸對(duì)花粉萌發(fā)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用.授粉后24 h內(nèi)，不同濃度NaCl處理柱頭后，花粉附著及萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)情況存在差異.高濃度(8%)NaCl處理柱頭可顯著促進(jìn)花粉附著及萌發(fā)，且花粉管生長(zhǎng)粗且直，低濃度(2%、5%)NaCl處理下花粉管出現(xiàn)分叉、扭曲等異?，F(xiàn)象.

綜上可知，采用不同授粉方法有利于克服太行菊屬與菊屬雜交受精前障礙，從一定程度上提高菊科近緣屬雜交親和性.一般認(rèn)為,花粉內(nèi)外源鈣促進(jìn)萌發(fā)的效果不如硼離子顯著，但試驗(yàn)中硼酸對(duì)花粉附著及萌發(fā)的作用不如鈣離子明顯，是否受父母本正反交的影響，還有待深入研究.