菌藻混合體系去除Cr（VI）的條件優(yōu)化及Cr（VI）還原酶活性的測(cè)定

楊勝男 劉娜 宋東輝，2

（1. 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；2. 天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，重金屬鉻作為電鍍、制革、印染和制藥等行業(yè)的化工原料［1]會(huì)因泄漏和不合理排放而進(jìn)入地下水，最終排入海洋，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。自然條件下鉻主要有Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）兩種存在形式［2]，其中Cr（Ⅵ）毒性約為Cr（Ⅲ）的100倍，具有很強(qiáng)的水溶性和遷移能力，并且致癌致畸變作用為Cr（Ⅲ）的1 000倍［3]，Cr（Ⅵ）污染的治理是我國(guó)環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

目前的研究中，鉻污染治理的方法主要有吸附法、化學(xué)還原法、離子交換法和混凝法等。這些方法成本較高，容易造成二次污染，去除效果不好。而微生物修復(fù)技術(shù)因其成本低，效益高，無(wú)二次污染等特點(diǎn)，在處理鉻污染方面凸顯巨大的發(fā)展?jié)摿?。微藻可以吸附重金屬，同時(shí)利用環(huán)境微生物產(chǎn)生的CO2和等合成自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)，同時(shí)釋放O2；而細(xì)菌或真菌可以利用水中O2對(duì)有機(jī)污染物進(jìn)行分解、轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生CO2和上述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以維持藻類的生長(zhǎng)繁殖［4]。因此，菌藻組合體系治理鉻污染，可以利用菌藻兩類生物之間的生理功能協(xié)同作用，達(dá)到更加理想的去除污染物的效果［5]。

本研究從天津某印染廢水中篩選出兩種Cr（Ⅵ）耐受菌，將菌藻組合后降解Cr（Ⅵ）的效果更好。通過對(duì)菌藻混合體系的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了在更短時(shí)間內(nèi)提高Cr（Ⅵ）去除率的效果，旨為進(jìn)一步開展菌藻混合體系的應(yīng)用提供理論依據(jù)并奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和微藻來(lái)源 實(shí)驗(yàn)所用Cr（Ⅵ）去除菌分離自天津某印染廠印染廢水。羊角月牙藻（SelenastrumcapricornutumFACHB-271）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)（FACHB）。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基配方依據(jù)參考文獻(xiàn)［6]配置。（2）BG-11培養(yǎng)基配方依據(jù)參考文獻(xiàn)［7]配置。

1.2 方法

1.2.1 Cr（Ⅵ）去除菌的篩選及鑒定 將2 mL印染廢水接入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，平板中涂布劃線分離3次，28℃培養(yǎng)24 h，得到耐受Cr（Ⅵ）的菌株。將純化的菌株轉(zhuǎn)接入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，在同樣條件下振蕩培養(yǎng)。每隔12 h取樣一次，8 000 r/min，離心5 min，測(cè)定上清液中Cr（Ⅵ）的濃度，篩選出高效去除Cr（Ⅵ）的細(xì)菌，并在-80℃冰箱中保存。

將篩選得到的菌株進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增分析，PCR引物經(jīng)華大基因公司測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)。再與EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫(kù)（http ：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）［8]典型菌株的16S rRNA基因進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA6.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.2 菌藻混合去除Cr（Ⅵ）研究 將篩選出的兩株Cr（Ⅵ）高效去除菌以1∶1的比例加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，細(xì)菌接入總量為5%，與單獨(dú)細(xì)菌去除Cr（Ⅵ）效果進(jìn)行比較。將混合菌分別以總接菌量為1%、3%、5%、7%及9%加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，對(duì)去除Cr（Ⅵ）效果進(jìn)行比較。將羊角月牙藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（個(gè)數(shù)約為5×107個(gè)/mL）以不同接藻量與細(xì)菌混合加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，分別以細(xì)菌和單獨(dú)藻做對(duì)照，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。采用二苯碳酰二肼分光光度法［9]對(duì)鉻離子濃度進(jìn)行測(cè)定，鉻的去除率參考文獻(xiàn)［10]中公式計(jì)算。微藻的葉綠素a的測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)［11]中的公式計(jì)算。

1.2.3 菌藻混合去除Cr（Ⅵ）的條件優(yōu)化 采用三步法進(jìn)行菌藻混合體系對(duì)Cr（Ⅵ）去除的優(yōu)化研究。首先根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Placket-Burman設(shè)計(jì)［12]，以Cr（Ⅵ）去除率為響應(yīng)值，選出對(duì)菌藻體系去除Cr（Ⅵ）影響較大的3個(gè)因素。然后利用最陡爬坡設(shè)計(jì)得到最佳區(qū)域，最后利用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化和驗(yàn)證［13]。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到擬合響應(yīng)面模型的最優(yōu)條件，并對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。數(shù)據(jù)處理采用Minitab17軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 粗酶液的制備及酶活性的測(cè)定 分別將兩株除鉻菌接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，參考文獻(xiàn)［14]制

2 結(jié)果

2.1 菌種的分離及鑒定

圖1 兩株細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的效果

所以最終選取羊角月牙藻10%接藻量與混合菌混合進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化去除實(shí)驗(yàn)。

圖3 菌藻混合體系對(duì)Cr（Ⅵ）的去除情況

2.3 菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）條件的優(yōu)化

2.3.1 菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的單因素試驗(yàn) 分別以pH值、溫度、接菌量、NaCl濃度、重金屬離子和外加碳源作為單因素條件，考察Cr（Ⅵ）的去除效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌藻混合體系在pH6.0時(shí)對(duì)Cr（Ⅵ）去除率最高，24 h達(dá)到84.3%，48 h達(dá)到95.6%（圖4-A）；在溫度33℃時(shí)對(duì)Cr（Ⅵ）去除效果最好，48 h去除率達(dá)到95.9%（圖4-B）。當(dāng)接菌量為5%時(shí)，對(duì)Cr（Ⅵ）去除效果最好，24 h去除65.3%，48 h達(dá)到了94.8%（圖4-C）。通過加入不同NaCl濃度發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl濃度為1%時(shí)，對(duì)Cr（Ⅵ）去除效果最好，48 h去除率達(dá)到96.5%（圖4-D）。外加1%（W/V））檸檬酸鈉、半乳糖、丙酮酸鈉、蔗糖及葡萄糖為碳源，以葡萄糖和丙酮酸鈉對(duì)Cr（Ⅵ）去除的影響最大（圖4-E）。分別選擇Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+和Mn2+作為金屬離子以10 mg/L的濃度加入培養(yǎng)基中，其中只有Cu2+對(duì)Cr（Ⅵ）的去除起促進(jìn)作用，另外4種離子均起抑制作用（圖4-F）。

2.3.2 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，Minitab17軟件分析結(jié)果如表2所示。由分析可知，實(shí)驗(yàn)得到的參照項(xiàng)P值為0，小于顯著性水平0.05，說(shuō)明得到的回歸方程顯著，即該模型在整個(gè)回歸區(qū)域擬合性較好。溫度、Cu2+和葡萄糖3個(gè)因素對(duì)Cr（Ⅵ）去除率影響顯著。這3個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化表明，溫度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率有顯著負(fù)效應(yīng)，Cu2+和葡萄糖對(duì)Cr（Ⅵ）去除率有顯著正效應(yīng)（表3）。剩下的影響因素中，pH值的P值為0.036，小于0.05，Cr（Ⅵ）去除率也有顯著性。其他因素的P值均大于0.05，對(duì)Cr（Ⅵ）去除率沒有顯著影響。

圖4 pH值（A）、溫度（B）、接菌量（C）、NaCl濃度（D）、外加碳源（E）、重金屬離子（F）對(duì)菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的影響

表1 Placket-Burman設(shè)計(jì)各因素與水平

2.3.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 從表4中可以看出，第3組即溫度30℃，Cu2+30 mg/L，葡萄糖質(zhì)量濃度2%時(shí)Cr（Ⅵ）去除率最高，以此條件為中心點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面分析。

表2 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以Cr（Ⅵ）去除率為響應(yīng)值，以溫度、Cu2+濃度和葡萄糖含量設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見表5。利用Minitab17對(duì)15組試驗(yàn)的響應(yīng)值進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)式方程為：3.061X2X3。根據(jù)模型構(gòu)建的方程做偏微分處理，求出模型中X1=-0.126 7，X2=-0.469 2，X3=0.204 1?？傻玫饺コ鼵r（Ⅵ）的最優(yōu)理論條件為：溫度29.74℃，Cu2+濃度27.65 mg/L，葡萄糖含量2.41%（W/V）時(shí)，由回歸方程得出的最優(yōu)Cr（Ⅵ）去除率為97.01%。

表3 Placket-Burman設(shè)計(jì)分析結(jié)果

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表6中可看出，模型方程P值為0，證明該模型是顯著的，在回歸方程中對(duì)Y值影響是極顯 著 的，和X2X3對(duì)Y值影響是顯著的，其他幾項(xiàng)對(duì)Y值均不顯著。

由表7可知該模型顯著系數(shù)P值為0.003，＜0.01， 失 擬 項(xiàng) 系 數(shù)P值 為 0.302，＞0.05， 說(shuō) 明該回歸模型擬合度好，無(wú)需再調(diào)整。其回歸系數(shù)R2=0.969 3，調(diào)整后為0.914 0，這兩個(gè)值都高于0.900，且較為接近，所以可以用該模型分析響應(yīng)值。

表6 回歸實(shí)驗(yàn)顯著性分析結(jié)果

表7 回歸方程方差分析

用Minitab17分析表5的試驗(yàn)結(jié)果，得到響應(yīng)曲面圖和等高線圖（圖5-圖7）。葡萄糖含量和Cu2+濃度，葡萄糖含量和溫度這兩組的交互作用對(duì)Cr（Ⅵ）去除影響較顯著（圖6和圖7）。最終，響應(yīng)面法優(yōu)化后的菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的最佳反應(yīng)條件為：29.74℃，Cu2+濃度為27.65 mg/L，葡萄糖含量為2.41%（W/V），丙酮酸鈉含量2%（W/V），接菌量7%，pH7.0，NaCl濃度為0時(shí)，24 h內(nèi)菌藻混合體系對(duì)Cr（Ⅵ）去除率達(dá)到97.89%。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證擬合的回歸模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行Cr（Ⅵ）的去除實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，菌藻混合體系在24 h時(shí)對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率達(dá)到了97.89%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合性，表明回歸方程可以比較真實(shí)的預(yù)測(cè)各個(gè)因素對(duì)菌藻體系去除Cr（Ⅵ）的影響。與優(yōu)化前的相比菌藻混合體系24 h內(nèi)對(duì)Cr（Ⅵ）去除率提高30%左右，優(yōu)化后去除效果明顯。

2.4 兩株細(xì)菌Cr（Ⅵ）還原酶活性測(cè)定

2.4.1 不同溫度和pH值對(duì)Cr（Ⅵ）還原酶的影響 從圖8-A中可以看出，兩株細(xì)菌Cr（Ⅵ）還原酶在20-50℃范圍內(nèi)的相對(duì)酶活都可達(dá)到80%以上，其中30℃時(shí)酶的相對(duì)活性最高。這與菌藻混合體系對(duì)Cr（Ⅵ）去除效果最好時(shí)的溫度33℃基本一致。

不同pH值條件下兩株細(xì)菌胞內(nèi)Cr（Ⅵ）還原酶的相對(duì)活性結(jié)果如圖8-B所示。菌株S-3的Cr（Ⅵ）還原酶的最適范圍偏酸性，而D-7的Cr（Ⅵ）還原酶最適范圍偏堿性。如pH為8.0時(shí)，D-7 Cr（Ⅵ）還原酶相對(duì)活性達(dá)到了92.59%，而S-3只有77.43%。菌株S-3的Cr（Ⅵ）還原酶最適pH值為6.0，菌株D-7的Cr（Ⅵ）還原酶最適pH值為7.0。

圖5 溫度和Cu2+濃度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖6 葡萄糖和Cu2+濃度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖7 葡萄糖含量和溫度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的曲面圖（A）和等高線圖（B）

2.4.2 Cr（Ⅵ）還原酶動(dòng)力學(xué)曲線 不同Cr（Ⅵ）濃度下，菌株S-3和D-7 Cr（Ⅵ）還原酶動(dòng)力學(xué)曲線如圖9所示。結(jié)果表明，菌株S-3 Cr（Ⅵ）還原酶 的Km=86.94 μmol/L，Vmax=2.71 μmol/（L·min），菌 株 D-7 Cr（ Ⅵ ） 還 原 酶 的Km=103.18 μmol/L，Vmax=3.38 μmol/（L·min）。

圖8 不同溫度（A）和pH值（B）條件下Cr（Ⅵ）還原酶的相對(duì)活性

圖9 菌株S-3（A）和D-7（B）Cr（Ⅵ）還原酶動(dòng)力學(xué)曲線

3 討論

微生物修復(fù)技術(shù)在處理水體鉻污染方面具有突出的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多的Cr（Ⅵ）還原菌被發(fā)現(xiàn)，如大腸桿菌（Escherichia coli）［15]、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）［16]等。本實(shí)驗(yàn)從印染廢水中篩選到兩株能夠去除Cr（Ⅵ）的細(xì)菌S-3和D-7，分別屬于沙雷氏菌屬（Serratia）和代爾夫特菌屬（Delftia）。二者混合后對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效果比單一菌株的效果要好，說(shuō)明兩種細(xì)菌對(duì)Cr（Ⅵ）的去除存在互相促進(jìn)作用。菌藻之間的相互作用主要有信號(hào)傳導(dǎo)、營(yíng)養(yǎng)交換和基因轉(zhuǎn)移3種方式，其中營(yíng)養(yǎng)交換最為主要。藻類在自身代謝的過程中會(huì)分泌出許多可溶性有機(jī)物，如維生素、碳水化合物、肽，以及生長(zhǎng)因子和促進(jìn)因子等，分泌出的有機(jī)物中有些會(huì)被細(xì)菌利用用于自身生長(zhǎng)［17]。目前已經(jīng)有很多菌藻共生的研究，可用于修復(fù)各種廢水。如劉玉沛［5]報(bào)道的小球藻與赤紅球菌固定后對(duì)苯酚的降解率比單獨(dú)赤紅球菌對(duì)苯酚的降解率提高了將近1倍。Safonova等［18]從石油污染的廢水中篩選得到的紅球菌，與小球藻作用能夠?qū)?.04 mg/L的Cu2+去除達(dá)到62%以上。將混合菌與羊角月牙藻以不同比例混合發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微藻接藻量為10%時(shí)去除效果最好，而接藻量達(dá)20%以上反而對(duì)Cr（Ⅵ）的去除起到了抑制作用。這可能是因?yàn)樵孱愖陨淼拇x過程會(huì)產(chǎn)生類黃酮類和縮酚酸等物質(zhì)［19]，當(dāng)受到氧化脅迫時(shí)產(chǎn)生的防御性物質(zhì)［20]會(huì)對(duì)細(xì)菌起到一定的抑制作用［21]，進(jìn)而對(duì)細(xì)菌去除Cr（Ⅵ）會(huì)有一定的影響。同時(shí)微藻的光合產(chǎn)氧降低了對(duì)氧氣供應(yīng)的需求［22]。同時(shí)細(xì)菌通過提供CO2和其他刺激生長(zhǎng)方式來(lái)促進(jìn)微藻的光合自養(yǎng)［23]，廢水中的有害物質(zhì)會(huì)有效地去除。另一方面，細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中也會(huì)產(chǎn)生對(duì)微藻生長(zhǎng)有影響的物質(zhì)，如Morel等［24]報(bào)道的Delftiasp.JD2在含有Cr（Ⅵ）的環(huán)境中培養(yǎng)可以生成IAA，可對(duì)微藻的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。所以推測(cè)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件雖然不適合羊角月牙藻的生長(zhǎng)，但是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中分泌出的物質(zhì)會(huì)為微藻提供營(yíng)養(yǎng)，所以會(huì)使培養(yǎng)基中微藻葉綠素含量有適當(dāng)?shù)纳摺?/p>

環(huán)境因素對(duì)菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）有一定影響。pH值影響微生物代謝過程中酶的活性進(jìn)而影響自身的生長(zhǎng)和污染物的去除［25]。本研究中的菌藻混合體系在較大的pH范圍內(nèi)能正常生長(zhǎng)，推測(cè)該菌藻體系中的兩種細(xì)菌各自最適pH值疊加有較寬的適應(yīng)范圍。溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素，最佳適應(yīng)溫度30-35℃與已報(bào)道的Cr（Ⅵ）還原菌大多數(shù)細(xì)菌的最佳溫度相似［26]。碳源可為Cr（Ⅵ）提供電子供體，促進(jìn)微生物對(duì)Cr（Ⅵ）的還原。本研究在添加葡萄糖和丙酮酸鈉后促進(jìn)了Cr（Ⅵ）的還原，與潘翠等［27]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖可明顯促進(jìn)芽孢桿菌菌株（Bacillussp.）對(duì)Cr（Ⅵ）的還原基本一致。細(xì)菌接菌量對(duì)Cr（Ⅵ）的去除有較為明顯的影響。因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞密度與Cr（Ⅵ）的去除能力存在一定的關(guān)系［28]。Mabroukik等［29]報(bào)道的Streptomycessp.MS-2接種量在5%-15%范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。本研究中Cu2+對(duì)培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)有一定的影響，同時(shí)可對(duì)細(xì)菌中Cr（Ⅵ）還原酶起促進(jìn)作用。已經(jīng)報(bào)道的許多抗Cr（Ⅵ）細(xì)菌都具有較強(qiáng)的耐鹽性［30]。本研究的兩種細(xì)菌對(duì)NaCl都有很好的耐受性，且在0-4%范圍內(nèi)，菌藻混合體系對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率都達(dá)到了90%以上。

響應(yīng)面法在微生物降解去除污染物方面被廣泛使用。張海濤等［31]利用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株zhtI（Acinetobacter guillouiae）降解苯酚，降解率達(dá)到93.23%。賀強(qiáng)禮等［32]對(duì)菌株YH1（Pseudomonas corrugate）降解叔丁基鄰苯二酚進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，降解率可達(dá)98.21%。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化菌藻混合體系后，在提高Cr（Ⅵ）去除率的同時(shí)，縮短了處理時(shí)間。這在快速處理含鉻廢水，控制有效成本方面具有很好的借鑒意義。

溫度和pH值會(huì)影響酶的相對(duì)活性。如魏斐等［33]篩選出C-2蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensisC-2）中的還原酶最適pH值為7.0，并且在25-37℃范圍內(nèi)保持良好活性。Pal等［34]從土壤中篩選出的Bacillus sphaericusAND303中Cr（Ⅵ）還原酶的Km為 158.12 μmol/L，Vmax為 1 432 nmol/（L·min）。本研究中的S-3和D-7來(lái)自印染廢水，其Cr（Ⅵ）還原酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)與其他Cr（Ⅵ）還原菌存在一定差異，表明不同細(xì)菌Cr（Ⅵ）還原酶活性因其適應(yīng)的生長(zhǎng)環(huán)境不同而有一定差別。

4 結(jié)論

從印染廢水中篩選到兩株除Cr（Ⅵ）菌，經(jīng)16S rRNA鑒定分別屬于沙雷氏菌屬和代爾夫特菌屬，并且在等比例混合后去除Cr（Ⅵ）效果優(yōu)于單獨(dú)菌株的去除效果。菌藻混合體系中，羊角月牙藻以10%的接藻量去除Cr（Ⅵ）的效果最好。通過Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法分析，確定菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的最優(yōu)條件為：溫度29.74℃，Cu2+27.65 mg/L，葡萄糖2.41%（W/V），丙酮酸鈉2%（W/V），接菌量7%，pH7.0，NaCl濃度為0時(shí)，24 h內(nèi)菌藻混合體系對(duì)Cr（Ⅵ）去除率達(dá)到97.89%。菌株S-3和D-7的Cr（Ⅵ）還原酶最適pH值分別為6.0和7.0。菌株S-3 Cr（Ⅵ）還原酶的Km為 86.94 μmol/L，Vmax為 2.71 μmol/（L·min），菌株D-7 Cr（Ⅵ）還原酶的Km為103.18 μmol/L，Vmax為 3.38 μmol/（L·min）。