嗜水氣單胞菌OprM蛋白的克隆表達(dá)與免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)

毛然然 李小艷 武瑤 張麗珊 林鎮(zhèn)平 林向民

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

嗜水氣單胞菌為氣單胞菌屬的一種革蘭氏陰性短桿菌，常導(dǎo)致淡水魚類患運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥，該疾病每年都給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成數(shù)百萬(wàn)美元的經(jīng)濟(jì)損失［1-3]，而疫苗是防控水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)感染性疾病最有效的策略之一［4]。目前的漁用疫苗主要包括滅活疫苗、減毒疫苗、核酸疫苗和亞單位疫苗等，其中亞單位疫苗是一種只保留病原體中有效的免疫原成分（外膜蛋白、糖蛋白、分泌蛋白、外毒素、胞外蛋白酶等）而不含有其他無(wú)關(guān)或者有害成分的新型疫苗，因具有組分清楚、安全性好、技術(shù)成熟、便于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛推廣。外膜蛋白（OMP）是存在于細(xì)菌外膜中所有蛋白的總稱，在維持外膜結(jié)構(gòu)、保證物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嬗兄匾饔茫?]。已有多項(xiàng)研究表明，細(xì)菌的主要外膜蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，是重要的保護(hù)性抗原，且利用致病菌的OMP做免疫原還可使魚產(chǎn)生對(duì)不同血清型菌株感染的交叉保護(hù)力［6]，因此通過(guò)制備外膜蛋白亞單位疫苗預(yù)防嗜水氣單胞菌的感染是當(dāng)今疫苗研究的主要方向之一。但是目前對(duì)嗜水氣單胞菌外膜蛋白免疫原性研究多集中于實(shí)驗(yàn)室篩選階段，需要對(duì)不同外膜蛋白免疫效果進(jìn)行全面分析，篩選出高效且適用于規(guī)?；a(chǎn)的疫苗。本文基于以上現(xiàn)狀選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白OprM為研究對(duì)象，探究OprM蛋白作為亞單位疫苗在模式生物斑馬魚體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)與嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株攻毒后的相對(duì)免疫保護(hù)率，為魚類養(yǎng)殖業(yè)疫苗研究提供理論依據(jù)與實(shí)踐參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒與斑馬魚 本實(shí)驗(yàn)所需的原核表達(dá)載體pET-32a（+）、嗜水氣單胞菌 ATCC 7966和嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株LP-2為本實(shí)驗(yàn)室保存；健康斑馬魚 200條（0.3±0.1 g）購(gòu)于福州花鳥市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)一周，每天喂食1次，換水1次，24 h供氧。

1.1.2 試劑和引物 LB培養(yǎng)基：20 g 胰蛋白酶胨，20 g NaCl、10 g 酵母粉溶于2 000 mL ddH2O；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶購(gòu)買自Thermo公司；大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買于全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 Omega公司；氨芐青霉素（AMP）購(gòu)自生工生物工程有限公司；引物由福州博尚生物公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 以嗜水氣單胞菌ATCC 7966總基因組為模板，用oprM基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)所得特異性片段用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 基因克隆引物序列

1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 用質(zhì)粒提取試劑盒 pET-32a質(zhì)粒，對(duì)克隆的目的片段和提取的 pET-32a 質(zhì)粒分別用Hind III 和EcoR I 進(jìn)行雙酶切。酶切后進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在 LB（含100 μg/mL AMP）平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.3 重組菌株的表達(dá)和純化 挑取單克隆至 5 mL LB培養(yǎng)基（含 100 μg/mL AMP），37℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。然后轉(zhuǎn)移至 200 mL 新鮮 LB 培養(yǎng)液（含100 μg/mL AMP）中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.3-0.6，加入 1 mmol/L IPTG 于 16℃誘導(dǎo)菌株10-12 h。然后在 4℃、10 000 r/min下離心，棄上清，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，將菌體重懸于5 mmol/L 咪唑溶液中，進(jìn)行超聲破碎處理。離心收集沉淀，所得沉淀溶解于 8 mol/L Urea 緩沖液中，通過(guò) Ni-NTA 樹脂柱進(jìn)行純化（過(guò)程中使用6 mol/L，4 mol/L，2 mol/L Urea緩沖液梯度復(fù)性）。SDS-PAGE檢測(cè)所純化條帶，并將獲得的蛋白存放于-20℃。

1.2.4 腹腔注射斑馬魚 將實(shí)驗(yàn)組OprM 蛋白與對(duì)照組BSA分別與弗氏佐劑以 1∶1 的比例均勻混合，充分乳化。接著對(duì)斑馬魚進(jìn)行腹腔注射，每尾免疫3 μg。免疫14 d后，對(duì)各組進(jìn)行再次加強(qiáng)免疫，注射量與第一次相同，持續(xù)到28 d。

1.2.5 蛋白免疫后斑馬魚免疫反應(yīng)檢測(cè) 利用Trizon法分別提取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組斑馬魚內(nèi)臟RNA：將斑馬魚內(nèi)臟取出后，加入液氮并置于研缽中研碎，然后向各樣本中加入1 mL的Trizon，靜置5 min；接著加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩，靜置2-3 min，2-8℃、12 000 r/min下離心15 min；然后吸取上層水相并加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min，2-8℃、12 000 r/min下離心10 min，去上清；最后加入1 mL75%乙醇，振蕩混勻，2-8℃、7 500 r/min下離心5 min，去上清，干燥沉淀，測(cè)濃度后于-20℃保存。并利用qPCR技

表2 PCR定量免疫相關(guān)基因表達(dá)的引物

1.2.6 斑馬魚攻毒 取保存于-80℃ 的嗜水氣單胞菌LP-2于37℃，200 r/min下活化16-18 h，再轉(zhuǎn)接至 5 mL 試管中，37℃，200 r/min 搖至 OD=1.0，1×PBS稀釋菌液至 1×105CFU/mL，（25倍斑馬魚半數(shù)致死量）。將魚用1.2.4的方法處理后，每尾注射20 μL進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，每組魚為30尾，3次重復(fù)。最后每天記錄攻毒結(jié)果，連續(xù)記錄兩周，繪制相對(duì)存活率曲線。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌oprM基因的擴(kuò)增

以嗜水氣單胞菌 ATCC 7966 的基因組 DNA 為模版，根據(jù)oprM基因特異性引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得大小 1 416 bp片段，與預(yù)期oprM基因大小相符合（圖1-A）。用質(zhì)粒提取試劑盒提取 pET-32a 載體質(zhì)粒，其大小約為 5 900 bp，核酸電泳結(jié)果與預(yù)期相一致（圖1-B）。

2.2 重組菌雙酶切驗(yàn)證結(jié)果

將克隆的目的片段和載體 pET-32a 用EcoR I和HindIII 進(jìn)行雙酶切后，回收目的片段，將目的片段與載體連接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21 獲得重組高表達(dá)菌株。所得菌株提取質(zhì)粒后用EcoRI 和Hind III 進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)兩條分別位于 1 500 bp 和 5 000 bp 左右的清晰條帶，電泳結(jié)果驗(yàn)證說(shuō)明該重組菌成功，含有目的基因oprM。術(shù)對(duì)其進(jìn)行免疫相關(guān)基因表達(dá)情況鑒定，相關(guān)基因引物如表2。

圖1 oprM 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（A）與pET-32a質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果（B）

圖2 高表達(dá)重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)及其純化

所得高表達(dá)重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和Ni-NTA樹脂柱純化后，樣品跑SDS-PAGE分析。如圖3所示，條帶1為IPTG誘導(dǎo)后重組菌全菌表達(dá)情況，可以發(fā)現(xiàn)存在明顯高表達(dá)條帶。條帶2中為經(jīng)Ni-NTA樹脂柱純化后獲得的純化蛋白，條帶單一，與目的蛋白位置一致，表明蛋白純化成功。

2.4 重組蛋白免疫相關(guān)基因表達(dá)

免疫斑馬魚28 d后，利用Trizon法提取內(nèi)臟RNA，用qPCR技術(shù)檢測(cè)7種免疫相關(guān)基因（Lyz，MHCI，MHCII，IL-1β，IL-8，IL-10和IL-15） 的mRNA表達(dá)情況［7]。注射OprM蛋白組與BSA對(duì)照組相比，大多數(shù)免疫相關(guān)基因都上調(diào)（變化倍數(shù)＞2），其中MHCI和IL-10的表達(dá)量升高的情況最為顯著，MHCI的表達(dá)量提高216.6倍，IL-10表達(dá)量提高了70.1倍。IL-1β，IL-8和IL-15表達(dá)量也有顯著的增大（圖4）。

圖3 重組菌表達(dá)與純化SDS-PAGE結(jié)果

圖4 斑馬魚的免疫相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果

2.5 攻毒試驗(yàn)結(jié)果

分別用3 μg OprM蛋白與BSA免疫斑馬魚，28 d后再用嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株LP-2攻毒后繼續(xù)觀察2周，如圖5所示，注射BSA的斑馬魚在攻毒后3天內(nèi)陸續(xù)死亡，而注射OprM蛋白后相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)到89.47%（相對(duì)免疫保護(hù)率=［（對(duì)照組死亡率-免疫組死亡率）/對(duì)照組死亡率]×100%）［8]。該結(jié)果表明，OprM 蛋白具有高效的免疫保護(hù)作用［9]。

3 討論

圖5 攻毒后注射免疫下接種的斑馬魚的累積存活率

嗜水氣單胞菌是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類爆發(fā)性傳染病的主要病原［10]，它還可以感染人和動(dòng)物［11]，能引發(fā)人類的中耳炎、敗血癥及創(chuàng)傷面感染、腹膜炎以及急性腸胃炎等疾?。?2-13]。以往防治這類危害的直接方法就是投放抗生素，但是傳統(tǒng)的抗生素防治手段因易造成耐藥性和藥物殘留等問(wèn)題已在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中限制使用［14]。在如此嚴(yán)峻環(huán)境面前，一種新型治療方法的開(kāi)發(fā)已迫在眉睫。疫苗作為一種無(wú)毒害，且高效便捷的治療方式，是對(duì)抗嗜水氣單胞菌的可持續(xù)替代品，深受人們的青睞。針對(duì)水生生物的疫苗主要有傳統(tǒng)疫苗、基因工程疫苗和亞單位疫苗等。其中亞單位疫苗因具有安全性高、治療效果好且成本低等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。細(xì)菌外膜蛋白具有較好的免疫原性，是一種潛在的疫苗候選蛋白，其中嗜水氣單胞菌外膜蛋白疫苗研究已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，例如 Maiti等［15]評(píng)估了兩種重要的嗜水氣單胞菌外膜蛋白Aha1和OmpW的免疫原性，通過(guò)將這些蛋白在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)，純化并接種于鯉魚，結(jié)果顯示抗體水平顯著提升，分別獲得52%和71%的相對(duì)免疫保護(hù)率；Hossam等［16]研究表明，用OmpA1、Tdr和TbpA三種重組外膜蛋白免疫鯰魚，發(fā)現(xiàn)鯰魚可以很好地抵抗嗜水氣單胞菌感染，是一類較好的潛在疫苗。盡管如此，針對(duì)嗜水氣單胞菌的疫苗還未得到商業(yè)化應(yīng)用，還是有較多的外膜蛋白作為疫苗的免疫保護(hù)功能未被報(bào)道，因此尋求更全面、適用于商業(yè)化的疫苗成為現(xiàn)在抑制該菌危害的關(guān)鍵。本文以嗜水氣單胞菌的外膜蛋白OprM為研究對(duì)象，選取 pET-32a 作為連接載體，與oprM基因進(jìn)行重組表達(dá)，獲得純化蛋白OprM，并將其腹腔注射斑馬魚檢測(cè)其免疫保護(hù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，該蛋白能夠顯著提升斑馬魚體內(nèi)免疫相關(guān)基因的應(yīng)答，且免疫保護(hù)率達(dá)到89.47%。這可能是因?yàn)镺prM蛋白作為一種嗜水氣單胞菌主要的外膜蛋白，在對(duì)宿主的感染和免疫中扮演著重要的角色，是重要的保護(hù)性抗原［17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，OprM等外膜蛋白還可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)黏附素的特異性抗體，抑制細(xì)菌在體內(nèi)的定植，進(jìn)而減少機(jī)體發(fā)生病變的機(jī)會(huì)［19]。以上結(jié)果表明OprM蛋白是一種可以較好地抵御嗜水氣單胞菌病害的疫苗候選蛋白。

4 結(jié)論

本研究成功克隆表達(dá)了嗜水氣單胞菌外膜蛋白 OprM，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)能夠較好的純化出單一且濃度較高的OprM蛋白。將純化所得蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1等體積充分乳化制備成亞單位疫苗后，腹腔注射斑馬魚，分別觀察其免疫應(yīng)答反應(yīng)與相對(duì)免疫保護(hù)率。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內(nèi)免疫相關(guān)基因表達(dá)顯著提升，揭示該疫苗可以引起斑馬魚免疫應(yīng)答。此外攻毒實(shí)驗(yàn)觀察兩周后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)89.47%，具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，是一種較佳的嗜水氣單胞菌亞單位疫苗。