魚類內(nèi)臟蛋白的開發(fā)和應(yīng)用研究進(jìn)展

鄭子懿，李 琳*，蘇 丹，李光輝

（電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東 中山 528402）

全球人均魚肉消費(fèi)量已從1960年的9.9 kg升至2014年的20.1 kg[1]。與此同時，在鮮魚加工過程中產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，包括內(nèi)臟、魚頭、魚骨、魚鱗、魚皮等。根據(jù)魚的種類不同，這些副產(chǎn)物的總質(zhì)量可占鮮魚總質(zhì)量的50%～70%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，這些副產(chǎn)物中50%左右被直接丟棄，僅有30%被初步加工為低值的動物飼料、肥料或發(fā)酵魚露[2]。魚類加工副產(chǎn)物若得不到妥善處理，極易污染土壤和水源[3]。另一方面，企業(yè)往往忽視了魚類加工副產(chǎn)物潛在價(jià)值的開發(fā)。魚類加工副產(chǎn)物通常含有膠原蛋白、糖胺聚糖、多不飽和脂肪酸、磷脂、維生素、酶、活性肽等多種生物活性物質(zhì)[4]。這些成分決定魚類加工副產(chǎn)物有著極大的精深加工潛力。對此類副產(chǎn)品進(jìn)行有目的的加工，不僅能夠提升加工單元的額外收益，也能夠避免因直接丟棄而引發(fā)的環(huán)境污染。

魚內(nèi)臟一般可占整魚質(zhì)量的7.5%～15.0%[5]。魚內(nèi)臟蛋白類物質(zhì)的質(zhì)量可達(dá)內(nèi)臟干質(zhì)量的20%以上，其所占比例與魚種類、年齡、季節(jié)、飼料及其他因素有直接關(guān)系[6]。本文涉及到的魚內(nèi)臟蛋白類物質(zhì)的加工產(chǎn)品有5 類，分別為生物活性肽、細(xì)菌素、生物降解膜、蛋白胨和內(nèi)臟酶。本文將逐一對上述產(chǎn)品的加工技術(shù)及其產(chǎn)品功能特性的研究進(jìn)展、成果進(jìn)行綜述，并展望魚類內(nèi)臟蛋白類物質(zhì)的未來研究方向和發(fā)展趨勢。

1 魚內(nèi)臟源生物活性肽的制備工藝和功能特性

1.1 魚內(nèi)臟源生物活性肽的制備工藝

通過酸堿法水解或酶法水解將魚內(nèi)臟蛋白轉(zhuǎn)化為低分子質(zhì)量肽或游離氨基酸，是提高魚內(nèi)臟蛋白生物活性的常見方法[7]。在酸堿水解或酶解之前，需要進(jìn)行一系列的預(yù)處理工藝。若預(yù)處理工藝不當(dāng)，蛋白溶液極易發(fā)生氧化、變色甚至產(chǎn)生惡臭味和有毒物質(zhì)[8]。預(yù)處理手段通常包括破碎、擠壓、熱處理、脫脂、過濾、均質(zhì)等一系列操作單元。熱處理的目的是將魚內(nèi)臟酶類滅活，若需用魚內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶進(jìn)行自水解，則可不進(jìn)行熱處理這一預(yù)處理工藝[2,9-10]。

用酸或堿水解魚內(nèi)臟蛋白已被廣泛研究[11-12]。酸堿水解法最主要的優(yōu)勢是成本低，因此在工業(yè)中的應(yīng)用較為廣泛。然而在酸堿水解過程中，必需氨基酸如色氨酸、蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸容易被破壞，導(dǎo)致氨基酸損失[13]。此外，從產(chǎn)品角度來說，因需要對酸或堿液進(jìn)行中和，所以所得蛋白水解液含鹽量通常較高。因此，采用酸堿法制備活性肽需要后續(xù)的納米過濾、離子交換樹脂等方法除鹽[14]。

與酸堿水解法不同，通過酶解法獲得魚內(nèi)臟蛋白酶解液的反應(yīng)條件通常較為溫和，且具有品質(zhì)可控、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)[15]。因此近年來，越來越多的學(xué)者采用酶法水解魚內(nèi)臟蛋白制備活性肽。在酶解工藝中，因不同種類的蛋白酶對切割位點(diǎn)具有選擇性，所以蛋白酶種類的選擇極其重要。綜合文獻(xiàn)來看，在魚內(nèi)臟蛋白酶解工藝中常用的商用蛋白酶有堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等[15-16]。顯然，蛋白酶的高價(jià)格是制約酶解法制備魚內(nèi)臟蛋白酶解液在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的主要因素。出于降低成本的考慮，部分研究者們利用魚類內(nèi)源蛋白酶系水解內(nèi)臟蛋白[17]。

在酸堿水解或酶解步驟之后，為了去除水解液中未完全水解的、不具有生物活性的蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)，通常會采用離心、鹽析、微孔過濾、納米膜過濾、超濾等手段處理酶解液[18-19]。之后，根據(jù)肽理化性質(zhì)的不同，采用親和層析、凝膠層析、疏水層析、纖維素層析、離子交換層析、分子排阻色譜、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳中的一種或幾種方法組合的方式，對生物活性肽進(jìn)行靶向分離純化[19-20]。魚內(nèi)臟蛋白水解制備活性肽的工藝流程如圖1所示。后續(xù)如需對肽的氨基酸序列進(jìn)行鑒定，常采用質(zhì)譜分析，如連續(xù)流快原子轟擊質(zhì)譜、電噴霧離子質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜等[21-23]。此外，核磁共振法也可用于氨基酸個數(shù)小于30的肽的氨基酸序列分析[24]。

圖1 魚內(nèi)臟蛋白水解制備活性肽的工藝流程Fig. 1 Flow chart for preparation of bioactive peptides by hydrolysis of fish viscera

1.2 魚內(nèi)臟源生物活性肽的生理活性

關(guān)于魚內(nèi)臟蛋白水解物中肽的生理活性的研究較多。國內(nèi)方面，李致瑜等通過Alcalase蛋白酶酶解大黃魚內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)肽的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為85.97%，羥自由基清除率為75.79[25]。楊曉軍等以斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟為原料，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后得到血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制率為72.34%的活性肽[26]。國外方面，Kumar等用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶水解馬鮫魚內(nèi)臟蛋白，之后采用離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離得到一種抗氧化肽，并用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定出氨基酸序列為Ala-Cys-Phe-Leu。這種抗氧化肽在0.2 mg/mL下對羥自由基和DPPH自由基的清除率分別可達(dá)59.1%和89.2%[27]。與此相似，Ganesh等用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶水解烏鯧內(nèi)臟蛋白，鑒定出一種氨基酸序列為Ala-Met-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala的抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)其具有抗DNA氧化損傷的作用[16]。Bougatef等利用沙丁魚內(nèi)臟自身蛋白酶系來酶解內(nèi)臟蛋白，并從中分離并鑒定出一種ACE抑制肽，但未測定其氨基酸序列[28]。Motamedzadegan等采用中性蛋白酶來改善黃鰭金槍魚內(nèi)臟酶系酶解內(nèi)臟蛋白工藝，并確定了最佳水解工藝所需的溫度、酶添加量等工藝[29]。表1總結(jié)了近年來國內(nèi)外關(guān)于酶解魚內(nèi)臟蛋白制備活性肽的研究進(jìn)展。這些活性肽雖然有潛在的生理功效，但缺乏完善的臨床實(shí)驗(yàn)而無法對其生理功效提供實(shí)質(zhì)性證據(jù)，導(dǎo)致其尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

表1 魚內(nèi)臟蛋白酶解物中活性肽的氨基酸序列及生理活性Table 1 Amino acid sequences and bioactivities of peptides from protein hydrolysates of fish viscera

2 細(xì)菌素

細(xì)菌素是某些細(xì)菌合成的一類具有抑菌活性的多肽、蛋白或蛋白復(fù)合物。細(xì)菌素對人體無毒副作用，且不影響食品風(fēng)味，因此可作為天然防腐劑和保鮮劑[38]。細(xì)菌素一直是食品天然防腐劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。魚腸道菌群的種類十分豐富，研究表明其中存在多種可合成較強(qiáng)抑菌活性細(xì)菌素的細(xì)菌。國內(nèi)研究方面，安俊瑩等從寶石石斑魚腸道解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06中分離出一種可抑制單核增生李斯特菌的細(xì)菌素[39]。鄧梅等從額爾齊斯河冷水魚腸道篩選到一株產(chǎn)細(xì)菌素的耐低溫腸球菌Enterococcussp. MB2-1，研究發(fā)現(xiàn)此細(xì)菌素可抑制革蘭氏陽性菌李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，此細(xì)菌素對胃蛋白酶、胰蛋白酶和尿素敏感，但對過氧化氫酶、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉，吐溫-80和乙二胺四乙酸穩(wěn)定[40]。國外研究方面，Ghomrassi等從地中海8 種魚類的內(nèi)臟腸球菌中分離出細(xì)菌素，發(fā)現(xiàn)得到的細(xì)菌素對病魚中致病菌（副乳房鏈球菌、漫游球菌、肉桿菌、寒黃桿菌等）具有廣譜抑菌作用[41]。Sarra等從黑斑小鯛腸道中分離出3 種屎腸球菌，發(fā)現(xiàn)這3 種屎腸球菌可產(chǎn)生抑制食品腐敗菌和魚類致病菌的細(xì)菌素[42]。

表2 魚腸道菌株細(xì)菌素的抑菌特性Table 2 Antibacterial properties of bacteriocins from fish intestinal bacteria

3 內(nèi)臟蛋白生物降解膜

魚蛋白，包括魚明膠蛋白、肌原纖維蛋白、肌漿蛋白等已被廣泛開發(fā)為食品包裝的生物膜[59-61]。但是，將魚內(nèi)臟蛋白開發(fā)為食品級生物降解膜的研究還比較少見。Abdelhedi等采用Purafect蛋白酶，在pH 10、溫度50 ℃、水解時間580 min、比酶活力6 U/mg的條件下水解前鰭星鯊內(nèi)臟蛋白，并用超濾法得到分子質(zhì)量小于1 kDa的肽。所得肽液（6%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）與0.95%甘油（塑化劑）混合并在40 ℃下均質(zhì)30 min，制成成膜溶液。將適量成膜溶液涂于有機(jī)硅樹脂板上干燥成膜，研究發(fā)現(xiàn)所得生物降解膜比骨明膠膜抗拉強(qiáng)度更好，但斷裂拉伸率低于骨明膠膜。同時，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟蛋白-明膠混合膜的機(jī)械強(qiáng)度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高于內(nèi)臟蛋白-明膠雙層膜，而變形性小于雙層膜。混合膜在相對濕度為30%～84%的條件下阻止水分轉(zhuǎn)移的能力強(qiáng)于雙層膜[62]。

4 蛋白胨

通過酶解等手段，將魚類加工副產(chǎn)物加工為微生物培養(yǎng)所需蛋白胨的研究已進(jìn)行了數(shù)10 年。魚類加工副產(chǎn)物制備蛋白胨的一般步驟包括洗凈、破碎、脫脂、混合液調(diào)整pH值、蛋白酶酶解、煮沸滅酶、離心、脫鹽、濃縮、干燥、粉碎等。國內(nèi)關(guān)于魚內(nèi)臟蛋白胨的研究較少。國外方面，Vázquez等將金槍魚、黃線喉盤魚、劍魚、虹鱒魚的內(nèi)臟制成各類蛋白胨，以滿足不同種微生物（如假單胞菌、弧菌、玫瑰桿菌等）的生長需要。實(shí)驗(yàn)表明這些魚內(nèi)臟來源的蛋白胨含有豐富多肽和游離氨基酸，比商業(yè)培養(yǎng)基更適于微生物培養(yǎng)[63]。Gildberg等用甲酸和磷酸處理冷肚魚內(nèi)臟蛋白并將所得自溶物作為3 種病原菌的氮源，發(fā)現(xiàn)與月示蛋白胨相比，廣布肉桿菌的生長速度增長了兩倍[64]。與此類似的，Klompong等發(fā)現(xiàn)黃鰭金槍魚內(nèi)臟蛋白經(jīng)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶處理后所得蛋白胨對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長促進(jìn)作用優(yōu)于商業(yè)蛋白胨[6]。以上研究為魚內(nèi)臟蛋白胨在發(fā)酵工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用提供了一定理論基礎(chǔ)。顯然，單一品種的魚內(nèi)臟蛋白不可能適用于所有種類微生物的生長。因此，選擇不同種類魚的內(nèi)臟蛋白并調(diào)整制備工藝，開發(fā)為不同種類微生物生長所需的蛋白胨，具有較大的發(fā)掘潛力。

5 內(nèi)臟酶

魚內(nèi)臟中的酶活性通常較高，這種特質(zhì)一方面決定了內(nèi)臟這一副產(chǎn)物難以長時間保持完整性；另一方面又為從中提取高活性的酶提供了可能性。國內(nèi)方面，張培等用硫酸銨分級沉淀法從金鯧魚內(nèi)臟中提取出一種酸性蛋白酶，發(fā)現(xiàn)該酸性蛋白酶酶解魚皮明膠的能力和提取蝦殼中蝦青素的能力均優(yōu)于豬胃蛋白酶；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該酸性蛋白酶的分子質(zhì)量為18.5 ku，最適pH值為4.0，最適反應(yīng)溫度為35 ℃[65]。國外方面，Ketnawa等用雙水相萃取法從湄公河巨鲇內(nèi)臟中提取肽酶，發(fā)現(xiàn)這種肽酶對溫度、鹽濃度有很強(qiáng)的耐受性[66]。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，該肽酶水解魚皮明膠的能力強(qiáng)于牛胰蛋白酶，且明膠水解液具有ACE抑制活性以及DPPH自由基和2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基清除活性[67]。Saranya等從大比目魚胃部分離出的一種高活性蛋白酶并將其應(yīng)用于山羊皮脫毛工藝中，結(jié)果表明經(jīng)該蛋白酶脫毛后的山羊皮，與傳統(tǒng)脫毛工藝后所得的山羊皮粒面效果相當(dāng)，且廢水中的固形物更少，從而降低了后續(xù)廢水處理的成本[68]。Younes等從赤鲉內(nèi)臟中分離出一種堿性蛋白酶，可作為洗滌劑的添加劑并可應(yīng)用于蝦副產(chǎn)物脫蛋白[69]。

6 結(jié) 語

通過多種技術(shù)手段提高魚內(nèi)臟蛋白類物質(zhì)的附加值，不僅可帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益，也可完善我國魚類加工副產(chǎn)品綜合利用產(chǎn)業(yè)鏈。但在現(xiàn)階段，對魚內(nèi)臟蛋白類物質(zhì)的研究仍停留在實(shí)驗(yàn)方面，工業(yè)化應(yīng)用仍偏少，導(dǎo)致其未能達(dá)到資源增值、惠及民生的目的。因此，仍需通過實(shí)驗(yàn)不斷增強(qiáng)對內(nèi)臟蛋白類物質(zhì)特性的了解，并與其他領(lǐng)域成熟產(chǎn)品建立密切聯(lián)系，實(shí)現(xiàn)共同發(fā)展。

如前所述，魚內(nèi)臟蛋白水解物具有多種生理活性，對水解物生理活性的研究涉及到抗氧化、ACE抑制、免疫調(diào)節(jié)、金屬離子螯合、抑菌、抗糖尿病等多個方面。但國內(nèi)外關(guān)于其抗癌能力、抗過敏及其他生理活性的研究還不夠深入。此外，鮮見通過微生物發(fā)酵方式制得魚內(nèi)臟源活性肽的研究。另一方面，大多數(shù)關(guān)于魚內(nèi)臟水解物中活性肽的研究為體外實(shí)驗(yàn)，到目前為止，鮮見關(guān)于將魚內(nèi)臟源活性肽加入谷物、甜點(diǎn)或肉類等使之成為功能性食品的報(bào)道。

目前，乳酸菌細(xì)菌素是唯一商業(yè)化使用的細(xì)菌素。從自然界中篩選菌種，并運(yùn)用合適育種方法得到高產(chǎn)細(xì)菌素菌株，具有廣闊的開發(fā)前景。近年來，魚內(nèi)臟源產(chǎn)細(xì)菌素的研究主要集中在菌種分離篩選和抑菌特性的研究，關(guān)于其分子結(jié)構(gòu)鑒定及耐藥機(jī)制的研究還不完全。此外，關(guān)于魚內(nèi)臟源細(xì)菌素的體外實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)?zāi)酥寥梭w實(shí)驗(yàn)的研究還不完善，這也限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，對魚內(nèi)臟產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌的相關(guān)基因組測序工作也需完善。

將魚內(nèi)臟蛋白應(yīng)用于生物降解膜的研究還較少。綜合已報(bào)道的文獻(xiàn)來看，還需要一定的研究工作來全面提高魚內(nèi)臟蛋白降解膜的拉伸強(qiáng)度、斷裂延伸率、穿刺強(qiáng)度等機(jī)械性能，以及阻水性、阻氣性等阻隔性能。若能改善其制備工藝，并與其他生物降解膜的性能進(jìn)行綜合對比，應(yīng)當(dāng)能拓展此類生物降解膜在食品工業(yè)中的開發(fā)利用。

商業(yè)蛋白胨的價(jià)格通常較高，且可能存在營養(yǎng)素比例不平衡、微生物利用率較低等缺點(diǎn)。以魚內(nèi)臟蛋白通過外源酶酶解或內(nèi)源酶自水解等手段將魚內(nèi)臟蛋白研制為蛋白胨，可能會彌補(bǔ)商業(yè)蛋白胨的缺陷。由于水生環(huán)境中重金屬（汞、鎘、砷、鉻、鉛）超標(biāo)問題日益突出，魚內(nèi)臟中重金屬含量通常比其他組織要高[70]。重金屬離子可能對微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，因此需將重金屬離子的檢測納入此類蛋白胨的質(zhì)量控制指標(biāo)。此外，在工業(yè)應(yīng)用之前，也需對此類蛋白胨的澄清度、亞硝酸鹽含量、酸堿度、含氮量、氨基氮含量、干燥質(zhì)量損失、熾灼殘?jiān)康瘸Ｒ姷鞍纂死砘笜?biāo)進(jìn)行測定，檢測其是否滿足相關(guān)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

酶類尤其是蛋白酶市場需求量極大，但目前市場酶制劑的價(jià)格通常較高。以廉價(jià)而豐富的魚類內(nèi)臟酶作為酶的來源，具有極大的市場競爭優(yōu)勢。多項(xiàng)研究表明魚內(nèi)臟酶普遍具有良好的酸堿穩(wěn)定性和耐鹽能力，且活性較高。因此，在提取純化、酶活性、酶學(xué)性質(zhì)等多方面繼續(xù)進(jìn)行深入研究，才能拓展其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。