檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用

郭 都，孫慧慧，孫 正，孫 怡，夏效東，石 超*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

副溶血性弧菌是一種嗜鹽的革蘭氏陰性菌，最適宜生長(zhǎng)在含鹽量為2%～4%的環(huán)境中，因此主要存在于江河湖海、海底沉積物、各類海產(chǎn)品及鹽漬食品中[1-2]。該菌在天然水產(chǎn)品中有很高的攜帶率，在溫暖的季節(jié)尤其是夏季檢出率可以高達(dá)90%[3]。近幾年來，隨著人們生活水平的提高以及對(duì)海鮮食品喜愛程度的增加，海鮮空運(yùn)越來越普遍，水產(chǎn)品消費(fèi)量大幅上升，副溶血性弧菌引發(fā)的食物中毒事件也呈現(xiàn)逐年增加的態(tài)勢(shì)[4]。食用被副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海鮮，尤其是貝類，可能會(huì)導(dǎo)致以腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、腹痛、低熱為主要癥狀的急性胃腸炎等疾病[5]。因此，有效預(yù)防和控制副溶血性弧菌對(duì)于保障公眾健康具有重要意義。

為降低海產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，目前采取的主要控制措施包括物理保鮮、化學(xué)防腐劑保鮮以及生物保鮮等技術(shù)[6-8]。物理保鮮技術(shù)如輻照殺菌和超高壓殺菌雖然能夠很大程度地保留食品的營(yíng)養(yǎng)和香味，但是因其對(duì)技術(shù)及工廠安全防護(hù)措施方面的要求較高，導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用成本較高[9]；化學(xué)防腐劑雖然具有良好的抑菌效果，但易使菌體產(chǎn)生耐受性，且有可能改變食品的自然風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)，往往具有潛在毒性，不易被消費(fèi)者接受[10]。因此，尋求安全、有效的控制海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的方法具有重要意義。

近年來，植物源活性物質(zhì)因具有天然、安全和營(yíng)養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注，越來越多的研究者將目光投向天然的植物源活性物質(zhì)，研究其抑制食源性致病菌的功效[11-12]。植物源活性物質(zhì)是植物中天然存在的一大類化合物，廣泛分布于水果、蔬菜、豆類、堅(jiān)果等植物中，賦予植物顏色、味道以及香氣，并且可以保護(hù)植物體免受自由基、病毒、細(xì)菌以及真菌的影響[13]。檸檬醛（C10H16O）是檸檬草油的主要成分，已被歐盟委員會(huì)承認(rèn)可作為食品中的調(diào)味成分（EU 872/2012），且被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)應(yīng)用，被公認(rèn)為是安全的成分（GRAS 182.60）。研究表明，檸檬醛可通過損傷線粒體對(duì)黃曲霉、指狀青霉等真菌的細(xì)胞形態(tài)造成破壞[14-16]。對(duì)于一些致病細(xì)菌來說，檸檬醛也表現(xiàn)出一定的抑菌活性，如檸檬醛對(duì)硫酸鹽還原菌[17]、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌[18]以及阪崎克羅諾腸桿菌[19]均具有一定的抑制作用。除此之外，研究表明檸檬醛還具有殺蟲驅(qū)蟲、抗炎和抗氧化等多種生物活性[20-22]。但目前檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用及抑菌機(jī)理鮮有報(bào)道。

本研究以副溶血性弧菌為研究對(duì)象，從7 種植物源活性物質(zhì)中篩選出對(duì)副溶血性弧菌抑菌效果較好的物質(zhì)，探究其對(duì)副溶血性弧菌的抑菌作用，并從其對(duì)細(xì)胞膜功能及通透性影響的角度研究其抑菌機(jī)理，旨在為檸檬醛作為一種植物源抑菌劑控制副溶血性弧菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血性弧菌（Vibrio pharahaemolyticus）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802和ATCC 33847購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物寄存庫。其余副溶血性弧菌分離菌株（240、243、245、247、248、253、256和260）均由香港理工大學(xué)食物安全及科技研究中心從鮮蝦中分離得到。

植物源活性物質(zhì)檸檬醛、丁香酸、阿魏酸、綠原酸、硫辛酸、原兒茶酸和原兒茶醛（純度≥98%）成都曼斯特生物科技有限公司；3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS） 北京陸橋技術(shù)有限公司；DiBAC4(3)熒光探針 美國(guó)Sigma公司；ATP檢測(cè)試劑盒（S0026） 碧云天生物技術(shù)有限公司；Live/Dead?BaclightTM細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；二甲基亞砜（純度≥99.5%） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；5804R低溫冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Max M2多功能微孔板檢測(cè)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；A1激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM） 日本Nikon公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；SCIENTZ-IID超聲波裂解儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及菌懸液制備

將凍存于－80 ℃冰箱的副溶血性弧菌于3% NaCl TSA平板劃線并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化。隨后挑取單菌落接種于30 mL 3% NaCl TSB中，將培養(yǎng)液置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h（120 r/min）。將培養(yǎng)后的菌懸液離心（5 000×g、4 ℃、5 min）并去除上清液，隨后使用pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌兩次。最后用PBS重懸菌體沉淀，調(diào)整菌懸液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.50±0.05，使菌液濃度約為108CFU/mL，備用。

1.3.2 植物源活性物質(zhì)對(duì)副溶血性弧菌最小抑菌濃度的測(cè)定

植物源活性物質(zhì)對(duì)副溶血性弧菌最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定參照歐洲臨床微生物和感染病學(xué)會(huì)藥敏委員會(huì)的方法[23]，采用瓊脂稀釋法測(cè)定。首先按照1.3.1節(jié)的方法活化副溶血性弧菌并制備菌懸液。隨后，將TCBS培養(yǎng)基煮沸溶解后冷卻至45～50 ℃，將培養(yǎng)基加入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再向其中分別加入檸檬醛、丁香酸、阿魏酸、綠原酸、硫辛酸、原兒茶酸以及原兒茶醛，使各孔植物源活性物質(zhì)的終質(zhì)量濃度分別為5.00、2.50、1.25、1.00、0.80、0.60、0.40、0.30、0.20、0.15、0.10、0.05 mg/mL，充分?jǐn)嚢杌靹?。待培養(yǎng)基凝固后，吸取2 μL菌懸液接種至各孔中央。將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀測(cè)結(jié)果，肉眼能觀察到副溶血性弧菌不生長(zhǎng)的最小質(zhì)量濃度為該植物源活性物質(zhì)對(duì)副溶血性弧菌的MIC。實(shí)驗(yàn)以不含有植物源活性物質(zhì)的TCBS培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，含有0.10 mg/mL卡那霉素的TCBS培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照。卡那霉素溶液使用無菌水配制，并使用0.22 μm濾膜過濾。

1.3.3 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線的影響

檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線的影響的測(cè)定參照Shi Chao等[19]的方法。按1.3.1節(jié)的方法活化副溶血性弧菌，使用3% NaCl TSB調(diào)節(jié)菌懸液OD600nm為0.50±0.05，并稀釋100 倍體積。向蜂窩板每孔中加入125 μL菌懸液（約106CFU/mL），隨后每孔加入125 μL使用3% NaCl TSB溶解的檸檬醛溶液，使檸檬醛終質(zhì)量濃度分別為2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC和1/32 MIC。實(shí)驗(yàn)設(shè)置不添加檸檬醛的菌懸液作為對(duì)照組（CK），同時(shí)設(shè)置3% NaCl TSB作為背景空白對(duì)照組。將樣品置于微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中，于37 ℃下每隔1 h測(cè)定24 h內(nèi)各孔樣品在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜電位的影響

檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜電位的測(cè)定參照Li Guanghui等[24]的方法進(jìn)行，將1.3.1節(jié)所得菌懸液加入96 孔板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。再向每孔中加入0.5 μL 1 μmol/L DiBAC4(3)熒光染料并使染料均勻地分布于菌懸液中，置于37 ℃孵育30 min。隨后向?qū)?yīng)樣品孔中添加檸檬醛溶液，使檸檬醛的終質(zhì)量濃度依次為0（CK）、MIC（0.1 mg/mL）和2 MIC（0.2 mg/mL），處理5 min后，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔樣品的熒光強(qiáng)度：設(shè)置多功能酶標(biāo)儀激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為492 nm和515 nm，激發(fā)和發(fā)射縫隙寬度分別為3 nm和5 nm。以相對(duì)熒光強(qiáng)度反映膜電位的變化。

1.3.5 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌胞內(nèi)ATP濃度的影響

按照1.3.1節(jié)的方法活化菌種并制備菌懸液，向離心管中加入2 mL菌懸液，并添加不同質(zhì)量濃度的檸檬醛溶液，使檸檬醛終質(zhì)量濃度為0（CK）、MIC（0.1 mg/mL）和2 MIC（0.2 mg/mL）。將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。隨后將樣品置于冰上，對(duì)樣品進(jìn)行超聲破碎處理，裂解菌體細(xì)胞以檢測(cè)副溶血性弧菌胞內(nèi)ATP濃度[25]。每個(gè)樣品超聲結(jié)束后立即將其置于100 ℃下處理2～3 min，使樣品中ATP酶滅活。將樣品離心（5 000×g、5 min），取上清液，按照ATP檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各樣品的ATP濃度。

1.3.6 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的測(cè)定參照Shi Chao等[26]的方法，使用Live/Dead?Baclight細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。首先按照1.3.1節(jié)方法制備菌懸液，隨后使用體積分?jǐn)?shù)70%異丙醇溶液分別制備活菌、死菌溶液。取活菌溶液并添加檸檬醛溶液，使檸檬醛質(zhì)量濃度分別為0（CK）、MIC（0.1 mg/mL）和2 MIC（0.2 mg/mL），并在37 ℃下孵育30 min。隨后，離心（10 000×g、4 ℃、1 min）去除上清液，加入相同體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液，重懸菌體得到處理組樣品。同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線組和背景空白對(duì)照組（不含副溶血性弧菌的對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度檸檬醛-PBS溶液），按照不同比例將活菌和死菌溶液混合，得到活菌比例分別為0%、10%、50%、90%和100%的標(biāo)準(zhǔn)曲線組樣品。向96 孔黑色酶標(biāo)板中依次加入100 μL樣品組、標(biāo)準(zhǔn)曲線組以及背景空白對(duì)照組。隨后，向每孔加入100 μL 2× SYTO 9/PI染料，充分混勻，將樣品置于25 ℃下避光孵育10 min。最后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，SYTO 9染料的激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為485、542 nm，PI染料的激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為485、610 nm。

LSCM觀察：菌液制備同1.3.1節(jié)方法，使用0.85% NaCl溶液調(diào)節(jié)菌液濃度至OD600nm為0.5。添加檸檬醛于各組菌液中，使檸檬醛質(zhì)量濃度為0、MIC（0.1 mg/mL）和2 MIC（0.2 mg/mL），在37 ℃下培養(yǎng)30 min。隨后離心（10 000×g、1 min、4 ℃）去除上清液，加入相同體積的0.85% NaCl溶液，搖勻、重懸，得到處理組樣液。將SYTO 9和PI等量混合配制混合熒光染料，取3 μL混合染料加入1 mL菌液中，輕柔混勻，于暗處孵育10 min。取3～5 μL樣品滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，調(diào)節(jié)LSCM于800 倍下觀測(cè)熒光強(qiáng)度并拍照。

1.3.7 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

參照Li Guanghui等[27]的方法，利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響。按照1.3.1節(jié)中的方法制備菌懸液，隨后加入檸檬醛使得檸檬醛質(zhì)量濃度分別為0、MIC（0.1 mg/mL）、2 MIC（0.2 mg/mL）和4 MIC（0.4 mg/mL），并置于37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2 h和4 h。在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取出樣品進(jìn)行離心（5 000×g、10 min、4 ℃），棄去上清液，使用PBS洗滌菌體兩次，并將菌體重新懸浮于2.5%戊二醛-PBS溶液中固定12 h。依次使用PBS、無菌水洗滌菌體，并將菌體置于體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液中固定5 h，隨后使用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（30%、50%、70%、80%、90%和100%）進(jìn)行梯度洗脫，每次10 min。最后使用少量無水乙醇將菌體重懸浮，并將樣品滴加至專用圓形小玻片并貼附于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡載物臺(tái)，真空干燥2 h后噴金處理，于20 000 倍下觀察細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物源活性物質(zhì)對(duì)副溶血性弧菌的MIC

表1 7 種植物活性物質(zhì)對(duì)兩種副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MICTable 1 MICs of 7 plant extracts against two standard strains of V. parahaemolyticus

如表1所示，所測(cè)7 種植物源活性物質(zhì)均能有效抑制兩種副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中檸檬醛的抑制效果較為突出。丁香酸對(duì)兩株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802和ATCC 33847的MIC均大于5.00 mg/mL；阿魏酸、綠原酸和硫辛酸對(duì)副溶血性弧菌的MIC為5.00 mg/mL；原兒茶醛與原兒茶酸雖然具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但二者對(duì)副溶血性弧菌的MIC相差較大，原兒茶酸對(duì)副溶血性弧菌的MIC為5.00 mg/mL，而原兒茶醛對(duì)副溶血性弧菌的MIC為2.50 mg/mL；檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802和ATCC 33847的MIC分別為0.10 mg/mL和0.15 mg/mL。由此可見，檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌具有良好的抑制作用，因此，選擇檸檬醛進(jìn)行后續(xù)研究，并測(cè)定其對(duì)從水產(chǎn)品中分離的8 株分離菌的MIC。

2.2 檸檬醛對(duì)8 株副溶血性弧菌分離菌株的MIC

為驗(yàn)證檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌抑制作用的廣泛性，實(shí)驗(yàn)選取了8 株來源于新鮮水產(chǎn)品的副溶血性弧菌分離菌株，分別編號(hào)240、243、245、247、248、253、256和260。如表2所示，檸檬醛對(duì)8 株副溶血性弧菌分離菌株的MIC在0.30～0.60 mg/mL范圍內(nèi)，即該8 株副溶血性弧菌分離菌株均能被檸檬醛有效抑制。

表2 檸檬醛對(duì)8 株副溶血性弧菌分離菌株的MICTable 2 MICs of citral against eight V. parahaemolyticus strains

2.3 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖1為檸檬醛對(duì)兩株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)曲線的影響。結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度為MIC時(shí)，檸檬醛對(duì)兩株副溶血性弧菌的抑制作用均表現(xiàn)為延長(zhǎng)其生長(zhǎng)延滯期、降低其最大生長(zhǎng)速率。當(dāng)檸檬醛質(zhì)量濃度為1/2 MIC及以下時(shí)，在24 h內(nèi)，檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌的生長(zhǎng)曲線幾乎沒有影響。

圖1 副溶血性弧菌ATCC 17802（A）、ATCC 33847（B）在含有不同質(zhì)量濃度檸檬醛的3% NaCl TSB中的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of V. parahaemolyticus ATCC 17802 (A) and ATCC 33847 (B) cultured in 3% NaCl TSB with various concentrations of citral

2.4 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌胞內(nèi)ATP濃度的影響

圖2 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802胞內(nèi)ATP濃度的影響Fig. 2 Effect of citral on intracellular ATP concentration of V. parahaemolyticus ATCC 17802

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度（x）與相對(duì)熒光強(qiáng)度（y）具有良好的線性關(guān)系（y＝376 201x＋194 055，R2＝0.983 2），因此，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品中胞內(nèi)ATP的濃度。由圖2可知，檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802胞內(nèi)ATP濃度有極顯著的降低作用（P＜0.01）。未經(jīng)檸檬醛處理的副溶血性弧菌胞內(nèi)ATP濃度為（1.963±0.072）μmol/L，經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC的檸檬醛處理后，副溶血性弧菌胞內(nèi)ATP濃度降為（0.097±0.003）μmol/L；而經(jīng)2 MIC檸檬醛處理后，胞內(nèi)ATP濃度降至檢出限（0.010 μmol/L）以下。

2.5 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜電位的影響

DiBAC4(3)是一種對(duì)細(xì)胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，通常被用作細(xì)胞膜電位的指示染料。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生去極化時(shí)，染料進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)出的熒光由于鍵合激活而增強(qiáng)[28]。如圖3所示，經(jīng)檸檬醛處理后，副溶血性弧菌ATCC 17802細(xì)胞膜電位有極顯著的改變（P＜0.01）。經(jīng)MIC檸檬醛處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜電位出現(xiàn)去極化；經(jīng)2 MIC檸檬醛處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜電位出現(xiàn)更顯著的去極化，呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。

圖3 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802細(xì)胞膜電位的影響Fig. 3 Effect of citral on membrane potential of V. parahaemolyticus ATCC 17802

2.6 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

圖4 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 4 Effect of citral on membrane integrity of V. parahaemolyticus ATCC 17802

Live/Dead?BaclightTM細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞膜完整性的定性和定量研究，PI和SYTO 9是其中的兩種核酸染料。SYTO 9是一種綠色熒光小分子染料，它能夠穿透完整的細(xì)胞膜；PI為紅色熒光大分子染料，僅能穿過不完整的細(xì)胞膜，可用于識(shí)別細(xì)胞膜受損的菌體[29]。實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)不同活細(xì)菌比例標(biāo)準(zhǔn)樣品的綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度的比值，建立綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度的比值和細(xì)胞膜完整的細(xì)菌比例之間的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度的比值和細(xì)胞膜完整的細(xì)菌比例有著良好的線性關(guān)系（y＝0.845 5x＋0.440 5，R2＝0.999），可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中細(xì)胞膜完整的細(xì)菌比例。由圖4可知，與CK組相比，檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802細(xì)胞膜的完整性具有極顯著的破壞作用（P＜0.01），經(jīng)MIC檸檬醛處理后，副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性降低為CK組的（9.34±1.70）%，經(jīng)2 MIC檸檬醛處理后，副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性降低至CK組的（7.43±0.57）%。

圖5 LSCM觀察未經(jīng)檸檬醛處理（A）及經(jīng)質(zhì)量濃度MIC（B）和2 MIC（C）檸檬醛處理后副溶血性弧菌ATCC 17802細(xì)胞膜完整性（800×）Fig. 5 Membrane integrity of V. parahaemolyticus ATCC 17802 without (A) and with citral treatment at MIC (B) and 2 MIC (C)examined by LSCM (800 ×)

如圖5所示，經(jīng)MIC檸檬醛處理后的副溶血性弧菌（圖5B）絕大多數(shù)發(fā)出紅色熒光，而經(jīng)2 MIC檸檬醛處理后（圖5C），視野內(nèi)菌體幾乎全部呈現(xiàn)紅色熒光，細(xì)胞膜完整的副溶血性弧菌數(shù)量幾乎降為零。綜上所述，一定質(zhì)量濃度范圍的檸檬醛可明顯破壞副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性。

2.7 檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

圖6 掃描電子顯微鏡觀察檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802細(xì)胞形態(tài)的影響（20 000×）Fig. 6 Cell morphology of V. parahaemolyticus ATCC 17802 with and without citral treatment examined by field emission scanning electron microscope (20 000 ×)

圖6表明，未經(jīng)檸檬醛處理的副溶血性弧菌（圖6A、B）呈桿狀，形態(tài)飽滿、胞體光滑。經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC的檸檬醛處理2 h及4 h后，部分細(xì)菌出現(xiàn)表面塌陷，菌體變形（圖6C1、D1）。經(jīng)2 MIC檸檬醛處理2 h及4 h后，細(xì)菌細(xì)胞表面出現(xiàn)嚴(yán)重的皺縮和塌陷，部分細(xì)菌干癟并喪失了原本的桿狀形態(tài)（圖6C2、D2）。經(jīng)4 MIC檸檬醛處理2 h及4 h后，細(xì)菌變形程度更大，皺縮程度更加嚴(yán)重（圖6C3、D3）。在同一質(zhì)量濃度下，檸檬醛處理4 h的細(xì)菌形態(tài)的變形程度顯著高于處理2 h的菌體。綜上所述，檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞形態(tài)的破壞程度隨其質(zhì)量濃度升高及作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加。

3 討 論

食源性疾病已經(jīng)逐漸成為全球范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共健康問題，其引起的感染對(duì)于各國(guó)人民的公共衛(wèi)生及健康都造成了巨大的危害[30]，其中副溶血性弧菌廣泛存在于海產(chǎn)品中，是許多沿海國(guó)家的首要致病菌。在我國(guó)，由副溶血性弧菌引起的食物中毒發(fā)生率已經(jīng)持續(xù)幾年位居首位[31]?？股氐臑E用導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)[32]，隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)于食品的安全性提出了更高的要求。因此，尋求安全、高效而又不易導(dǎo)致耐藥的植物源天然抑菌劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。檸檬醛是多種水果、蔬菜及中草藥中的活性成分，并且已被證明具有一定的抑菌活性[17-19]，然而，檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用及機(jī)理鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802和ATCC 33847為研究對(duì)象，測(cè)定了7 種植物源活性物質(zhì)的MIC，相對(duì)于阿魏酸、硫辛酸等物質(zhì)，檸檬醛具有更低的MIC。一些研究也報(bào)道了天然物質(zhì)對(duì)副溶血性弧菌的有抑制效果，如Xie Ting等[33]得出殼聚糖對(duì)副溶血性弧菌的MIC為1.25 mg/mL的結(jié)論；Xu Defeng等[34]利用瓊脂稀釋法測(cè)定了一種來源于枯草芽孢桿菌的新型抗菌肽AMPNT-6對(duì)副溶血性弧菌的MIC，結(jié)果表明，其對(duì)副溶血性弧菌的MIC為1.25 mg/mL。相比于以上學(xué)者的研究，本研究結(jié)果表明檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌具有良好的抑制作用。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)檸檬醛對(duì)8 株副溶血性弧菌分離菌株也具有良好的抑菌效果，證明檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌具有廣泛的抗菌作用。

ATP是細(xì)菌重要的能量分子，在多種生理過程中起著重要作用，抑菌物質(zhì)可以通過影響胞內(nèi)ATP濃度發(fā)揮抑菌作用。本研究結(jié)果表明檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌胞內(nèi)ATP濃度有極顯著的降低作用（P＜0.01）。Turgis等[35]發(fā)現(xiàn)，芥末精油可使大腸桿菌O157:H7和傷寒沙門氏菌胞內(nèi)ATP濃度降低。胞內(nèi)ATP濃度的降低可能是由于質(zhì)子泵水解ATP速率增大，導(dǎo)致ATP快速消耗或是細(xì)胞膜通透性改變，使胞內(nèi)ATP通過細(xì)胞膜泄漏造成的[36]。因此，在本研究中，副溶血性弧菌胞內(nèi)ATP濃度的降低說明檸檬醛可能是通過影響細(xì)菌細(xì)胞代謝功能或細(xì)胞膜通透性，從而起到抑制副溶血性弧菌生長(zhǎng)的作用。

細(xì)胞在靜息狀態(tài)下存在于細(xì)胞膜兩側(cè)的電位差稱為膜電位，正常的膜電位對(duì)細(xì)胞存活和必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸是必不可少的[37]。本研究結(jié)果表明，檸檬醛能夠改變副溶血性弧菌的膜電位，且發(fā)生顯著的去極化。類似研究表明，綠原酸使痢疾志賀氏菌、肺炎鏈球菌細(xì)胞膜發(fā)生去極化[38]。然而，本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，檸檬醛和百里醌可使阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜發(fā)生超極化[19,25]。Bot等[39]曾提出，細(xì)胞膜電位發(fā)生超極化或去極化是由于pH值改變或細(xì)胞膜通透性改變后K＋為保持細(xì)胞內(nèi)外電位均衡而導(dǎo)致的。因此，推測(cè)檸檬醛作用于細(xì)菌后，改變了細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而改變了細(xì)胞膜電位，從而達(dá)到抑制副溶血性弧菌的效果。

為驗(yàn)證上述推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)探究了檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響，結(jié)果表明，檸檬醛顯著降低了副溶血性弧菌細(xì)胞膜的完整性。類似地，Diao Wenrui等[11]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為2 MIC（0.25 mg/mL）的茴香精油可破壞志賀氏菌細(xì)胞膜完整性。Shi Chao等[19]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為2 MIC（1.08 mg/mL）的檸檬醛使阪崎腸桿菌細(xì)胞膜完整的細(xì)菌比例顯著降低至對(duì)照組的15%（P＜0.05）。細(xì)胞膜的完整性是菌體正常生長(zhǎng)代謝的重要條件。細(xì)胞膜完整性被破壞后，可能會(huì)導(dǎo)致一些重要細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)、核酸和糖類物質(zhì)流出，從而影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝[40]。利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察檸檬醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果表明，檸檬醛可使副溶血性弧菌細(xì)胞膜皺縮，菌體表面凹陷。類似地，藍(lán)蔚青等[41]發(fā)現(xiàn)經(jīng)殼聚糖、茶多酚和溶菌酶復(fù)合保鮮劑處理后，金黃色葡萄球菌菌體發(fā)生扭曲變形、干癟破裂的現(xiàn)象。張赟彬等[42]觀察到肉桂醛可使金黃色葡萄球菌失去圓滑的球狀形態(tài)，使大腸桿菌菌體細(xì)胞凹陷、胞膜表面褶皺，但未使菌體溶解破裂。

綜上所述，檸檬醛能夠顯著改變副溶血性弧菌的細(xì)胞膜電位，使其出現(xiàn)去極化；通過降低細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度、細(xì)胞膜完整性以及破壞細(xì)菌原有光滑飽滿的細(xì)胞形態(tài)而使其正常的生理功能紊亂，從而達(dá)到抑制副溶血性弧菌生長(zhǎng)的目的。本研究結(jié)果為檸檬醛作為天然抑菌物質(zhì)應(yīng)用于食品中控制副溶血性弧菌提供了理論依據(jù)。結(jié)合本研究結(jié)果以及現(xiàn)有應(yīng)用基礎(chǔ)，檸檬醛有潛力作為新型天然抗菌物質(zhì)應(yīng)用到食品工業(yè)中控制副溶血性弧菌。然而，檸檬醛對(duì)于食品感官品質(zhì)的影響及在食品中的應(yīng)用效果及潛力需要在實(shí)際應(yīng)用前進(jìn)一步探討。