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    FAM134B介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬對(duì)膿毒癥的影響

    2019-09-17 01:20:00楊勇高甜甜吳狄凌伍國(guó)寶黃佳李金秀
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膿毒癥誘導(dǎo)

    楊勇,高甜甜,吳狄凌,伍國(guó)寶,黃佳,李金秀

    (中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,湖南 長(zhǎng)沙 410011)

    膿毒癥是全身性炎癥反應(yīng)綜合征,是急危重患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)生的主要因素包括大的手術(shù),感染及嚴(yán)重?zé)齻萚1]。膿毒癥病程發(fā)展迅速,其發(fā)病率及病死率居高不下,是重癥醫(yī)學(xué)所面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)[2]。早期的研究顯示,膿毒癥的發(fā)生主要是由于過度炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致體內(nèi)炎癥反應(yīng)失衡,大量炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)等釋放,導(dǎo)致組織及器官的損害[3-4]。隨著研究的進(jìn)一步深入,發(fā)現(xiàn)膿毒癥的發(fā)病過程十分復(fù)雜,涉及機(jī)體炎癥、免疫和凝血功能障礙等多個(gè)方面,同時(shí),其對(duì)細(xì)胞功能代謝的影響也越來(lái)越受到關(guān)注[5]。膿毒癥致死率較高,臨床表現(xiàn)缺乏特異性,近年來(lái),其發(fā)病機(jī)制的研究具有一定的臨床參考價(jià)值,深入且全面了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床診斷治療及預(yù)后具有重要意義[6]。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是最大的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng),在蛋白質(zhì)及脂質(zhì)合成,離子穩(wěn)態(tài),細(xì)胞器之間通訊中發(fā)揮重要功能[7]。為滿足細(xì)胞在不同應(yīng)激下的功能,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要,其中自噬在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。2015年研究發(fā)現(xiàn),在真核細(xì)胞中存在的某些特殊蛋白可以介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)選擇性程序性降解,其中FAM134B 作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白,可以通過與LC3 Ⅱ相互作用,幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎裂,形成小的片段從而被自噬體包裹,并與溶酶體融合降解[10-11]。早期對(duì)FAM134B基因的研究中發(fā)現(xiàn),其在感覺神經(jīng)疾病患者中存在突變,F(xiàn)AM134B敲除小鼠同樣可以表現(xiàn)出這種感覺缺陷。在這些小鼠中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在痛覺感知神經(jīng)元細(xì)胞體中累積無(wú)法有序降解,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受損[10-11]?,F(xiàn)在越來(lái)越多的研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在很多疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的功能,本研究利用膿毒癥大鼠及細(xì)胞模型,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在膿毒癥發(fā)病的中的功能及相關(guān)機(jī)制。通過檢測(cè)膿毒癥大鼠腦組織及相關(guān)細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B表達(dá)及分布,自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況,進(jìn)一步了解FAM134B 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在膿毒癥發(fā)生中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    雄性SD 大鼠,體重250~300 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,N2a 細(xì)胞系來(lái)源于ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心),LC3 抗體、Activated-Caspase-3 抗體、Caspase-3 抗體、LC3 抗體、Beclein1抗體及FAM134B 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,β-actin 抗體、脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司,BSA 蛋白定量試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司,引物購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,其他相關(guān)生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 膿毒癥大鼠模型的復(fù)制 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)方法誘發(fā)SD 大鼠膿毒癥,使用4 ml/kg 水合氯醛通過腹腔注射麻醉,打開腹腔,在離盲腸4 cm處結(jié)扎,CLP 6 h 后注射抗生素,同時(shí)觀察大鼠相關(guān)改變,確定為膿毒癥大鼠模型[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[行政許可決定書文號(hào):SYXK(湘)2017-0002]。

    1.2.2 膿毒癥大鼠模型中腦部組織總RNA 及總蛋白的提取 SD 大鼠分為兩組,正常大鼠組(對(duì)照組)及CLP 誘發(fā)膿毒癥大鼠組(CLP組),每組8 只。在不同處理后,對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉和灌注固定,剝?nèi)∈竽X。將大鼠的頭部剪下,用剪刀剝?nèi)∑つw,再用鑷子和剪刀將大鼠腦外堅(jiān)硬的外膜剝除,小心地取出完整的腦部,加入1 ml 的Trizol,勻漿研碎,室溫5 min。加入200 μl 氯仿,劇烈搖蕩離心管,4℃、11 600 r/min 離心10 min;轉(zhuǎn)移水相于一新EP 管,加0.7 倍體積異丙醇,4℃、11 600 r/min 離心10 min;棄上清液,加入1 ml 75%酒精,混勻,4℃、11 600 r/min 離心2 min,重復(fù)2 遍;棄上清,室溫干燥5 min,溶于DEPC 水中,測(cè)光密度(OD)值。同時(shí)取一部分腦部于勻漿器中,加入適量的蛋白酶抑制劑的SDS 裂解緩沖液中,冰上勻漿后靜置20 min,轉(zhuǎn)移至EP 管中,4℃、11 600 r/min離心5 min,取上清液即得到腦組織的總蛋白。

    1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)FAM134B mRNA 的表達(dá) Trizol 法提取組織總RNA,紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè),逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,qRT-PCR 檢測(cè)FAM134B、β-actin mRNA 的Ct 值,擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火34 s,40 個(gè)循環(huán);做熔解曲線。以各基因Ct值與β-actin mRNA Ct 值的差值為△△Ct,計(jì)算各基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平,并以正常組為參照做歸一處理,其他各組與其做比較。

    1.2.4 N2a 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 N2a 細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS 加DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中,37℃、5%二氧化碳CO2,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時(shí)使用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。研究LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞分為3組,分別為對(duì)照組、10 mg/L LPS 處理組及20 mg/L LPS 處理組;研究過表達(dá)FAM134B 對(duì)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞分為3組,分別為對(duì)照組、20 mg/L LPS 處理組及FAM134B 過表達(dá)+20 mg/L LPS處理組[FAM134B OE+ LPS(20 mg/L)組]。

    1.2.5 Western blotting 檢測(cè)FAM134B、LC3、Beclin1及Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá) 利用BSA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量,并不同樣品取等量的蛋白質(zhì)(20 μg);12% SDS-Page 變性膠電泳,條件為80 V,20 min 后,將電壓調(diào)至120 V,繼續(xù)電泳90 min;恒流290 mA 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,5%脫脂牛奶封閉1 h 后,孵育使用相關(guān)一抗,4℃振搖過夜;次日5% PBST 洗膜,10 min,4 次;孵育對(duì)應(yīng)的二抗,振搖1 h,5% PBST 洗膜,10 min,3 次;暗房曝光顯影,并進(jìn)行相應(yīng)的定量分析。

    1.2.6 免疫熒光檢測(cè)FAM134B 亞細(xì)胞分布 培養(yǎng)的N2a 細(xì)胞胰蛋白酶消化后接種至24 孔板爬片中,經(jīng)不同處理后,使用4%多聚甲醛固定,0.1% Triton/PBS進(jìn)行滲透打孔后;5% BSA/PBS 進(jìn)行封閉;一抗室溫孵育1 h;PBS 洗5 次,5 min/次;孵育相對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育1 h;PBS 洗5 次,5 min/次;Dapi 染細(xì)胞核3 min,轉(zhuǎn)移反扣至載玻片上,封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察及拍照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組間比較用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 膿毒癥大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B的表達(dá)情況

    采用CLP 方法成功復(fù)制膿毒癥大鼠模型,對(duì)照組FAM134B mRNA 表達(dá)水平為(1.000±0.223),CLP組為(0.430±0.251),兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.229,P=0.032),CLP組FAM134B mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組。對(duì)照組和CLP組FAM134B FAM134B 蛋白表達(dá)水平分別為(0.398±0.112)和(1.000±0.185),兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 5.021,P=0.019),CLP組中FAM134B 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組,見圖1。

    圖1 膿毒癥大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B 的表達(dá)情況

    2.2 LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡

    免疫熒光結(jié)果顯示,對(duì)照組中,F(xiàn)AM134B 主要呈現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布,同時(shí),在20mg/L LPS 處理組中,可以看到在細(xì)胞質(zhì)中FAM134B 呈現(xiàn)很多點(diǎn)狀分布,在LPS 處理后,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成及降解穩(wěn)態(tài)被破壞,大量不能降解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集在細(xì)胞中。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,各組FAM134B、LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 表達(dá)水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS 處理組FAM134B蛋白總量下降,10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組FAM134B 蛋白總量與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LPS 處理組FAM134B 蛋白總量下降。同時(shí),10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 表達(dá)量與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LPS 處理組增加。10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組凋亡相關(guān)蛋白Activated Caspase-3 表達(dá)與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LPS 處理組高于對(duì)照組。利用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡率,對(duì)照組、10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組細(xì)胞凋亡率分別為(4.87±1.24)%、(11.12±1.33)%及(20.85±3.72)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.400,P =0.000),10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05),見圖2和表1。

    2.3 過表達(dá)FAM134B 對(duì)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    圖2 LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡

    表1 不同濃度LPS 處理N2a 細(xì)胞后LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    表1 不同濃度LPS 處理N2a 細(xì)胞后LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    注:?與對(duì)照組比較,P <0.05。

    組別 LC3-Ⅱ Beclin1 Activated Caspase-3對(duì)照組 1.00±0.134 1.00±0.183 1.00±0.153 10 mg/L LPS 處理組 1.88±0.244? 1.92±0.252? 2.21±0.312?20 mg/L LPS 處理組 3.95±0.449? 3.87±0.321? 4.56±0.572?F 值 69.220 95.422 88.635 P 值 0.000 0.000 0.000

    過表達(dá)FAM134B 后LPS 處理,各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。過表達(dá)FAM134B 后處理LPS,F(xiàn)AM134B OE+LPS(20mg/L)組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 及凋亡相關(guān)蛋白Activated Caspase-3 與20mg/L LPS 處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),F(xiàn)AM134B OE+LPS(20mg/L)組的表達(dá)量減少。利用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞儀分析,對(duì)照組、20mg/L LPS 處理組、FAM134B OE+LPS(20 mg/L)組凋亡率分別為(4.87±1.24)%、(20.85±3.72)%及(9.65±2.67)%,經(jīng)單因素方差析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.180,P =0.000);FAM134B OE+LPS(20mg/L)組細(xì)胞凋亡與20 mg/L LPS 處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),F(xiàn)AM134B OE+LPS(20 mg/L)組較20 mg/L LPS 處理組細(xì)胞凋亡率減少,F(xiàn)AM134B 對(duì)LPS 對(duì)細(xì)胞損害具有一定保護(hù)作用,見圖3和表2。

    圖3 過表達(dá)FAM134B 減少LPS 對(duì)細(xì)胞的損害

    表2 過表達(dá)FAM134B 后各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    表2 過表達(dá)FAM134B 后各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    注:①與對(duì)照組比較,P <0.05;②與20 mg/L LPS 處理組比較,P <0.05。

    組別 LC3-Ⅱ Beclin1 Activated Caspase-3對(duì)照組 1.00±0.134 1.00±0.183 1.00±0.153 20 mg/L LPS 處理組 3.95±0.449① 3.87±0.321① 4.56±0.572①FAM134B OE+ LPS(20 mg/L)組 0.95±0.119② 0.87±0.154② 1.06±0.172②F 值 72.341 65.883 76.982 P 值 0.000 0.000 0.000

    3 討論

    炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在膿毒癥發(fā)病中起到重要作用[13]。膿毒癥發(fā)生時(shí),中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放IL-lα、IL-1β、IL-6 以及TNF-α 等促炎癥因子[14]。該炎癥因子可誘發(fā)過量的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂,促使細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)LPS 和促炎因子誘導(dǎo)細(xì)胞激活iNOS 活性,增加過氧化物水平,可直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等病理生理?yè)p害[15-16]。

    之前的膿毒癥發(fā)病機(jī)制研究較多的關(guān)注炎癥反應(yīng),氧化應(yīng)激及線粒體損傷在膿毒癥發(fā)病中的作用,較少考慮到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在膿毒癥發(fā)病中的功能[17-18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞生命中一個(gè)重要的細(xì)胞器,在蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,且其參與細(xì)胞中膜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)等,參與線粒體功能的維持[19-20]。FAM134B 作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個(gè)重要蛋白,2015年研究發(fā)現(xiàn),其可以通過與LC3B 相互作用,幫助將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎裂,形成小片段從而被自噬體包裹,并與溶酶體融合降解,從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B 表達(dá)下降;LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡且過表達(dá)FAM134B減少LPS 對(duì)細(xì)胞的損害[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞凋亡及功能維持等生命過程中發(fā)揮重要作用,其與多種疾病相關(guān),包括神經(jīng)退行性疾病,缺血再灌注損傷,糖尿病等[9]。阿爾茲海默相關(guān)基因PS-1突變可以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而導(dǎo)致神經(jīng)元退行性死亡[21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以降低帕金森病相關(guān)基因Parkin 的表達(dá),影響其對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白如α-synuclein 等的清除,α-synuclein 蛋白的異常聚集是導(dǎo)致帕金森病發(fā)生的重要特征[22]。缺氧缺血可以導(dǎo)致異常折疊蛋白的聚集從而產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,在灌注后使受損組織發(fā)生氧化應(yīng)激,NO 和其他活性氧生成增加,鈣離子通道受損,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[23]。胰島B 細(xì)胞具有成熟發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成系統(tǒng),其可分泌大量的胰島素及其他糖蛋白,嬰兒型糖尿病相關(guān)基因PERK 缺失,其可影響胰島B 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu),增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促使JNK 信號(hào)通路的異常活化,導(dǎo)致胰島素合成障礙[24]。

    自噬是是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要反應(yīng),過度自噬可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞死亡[25]。研究顯示LPS誘導(dǎo)的膿毒癥細(xì)胞模型自噬水平增加,細(xì)胞凋亡增多,其主要可以通過IL-lα、IL-1β、IL-6 以及TNF-α等促炎癥因子發(fā)揮功能,也可誘導(dǎo)線粒體自噬,細(xì)胞能量代謝異常導(dǎo)致[26-27]。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),LPS 處理中,F(xiàn)AM134B 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分布發(fā)生異常,成聚集點(diǎn)狀分布,其可能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬而聚集無(wú)法降解相關(guān),進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變,且在過表達(dá)FAM134B 后此現(xiàn)象得到改善,說(shuō)明FAM134B能減少LPS 對(duì)細(xì)胞的損害,進(jìn)一步證實(shí)FAM134B 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬影響膿毒癥的發(fā)生,為深入了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

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