不同產(chǎn)地蟾酥藥材HPLC指紋圖譜及模式識別研究△

成小蘭，龐中化，王志剛，胡春萍，呂章明，曹鵬

江蘇省中醫(yī)藥研究院/南京中醫(yī)藥大學 附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

蟾酥為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物，主產(chǎn)于河北、山東、四川等地。蟾酥味甘、辛，性溫，有毒，具有開竅醒神、解毒、止痛等功效，主治惡瘡、瘰疬、癌腫、咽喉腫痛、牙痛等局部結腫及其引發(fā)的疼痛[1]。近年被用于治療急性心力衰竭、慢性支氣管炎、坐骨神經(jīng)痛等[1-2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，蟾酥具有抗腫瘤、強心、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種作用[3]。最新研究顯示，蟾酥可增強去甲腎上腺素所引起的大鼠輸精管的收縮，并呈劑量依賴性收縮反應。此外，蟾酥還具有鎮(zhèn)咳、利尿、興奮腸道平滑肌以及促進糖元抑制乳酸生成的胰島素樣作用[4]。蟾酥含有大量蟾蜍毒素類物質，尚含有酯蟾毒配基-3-單辛二酸脂、蟾毒靈-3-單辛二酸酯、華蟾毒精-3-單辛二酸酯、膽固醇、吲哚系堿類等成分，其中蟾蜍毒素類成分是蟾酥的主要有效成分[5-7]。蟾酥是臨床常用的名貴動物藥之一，應用廣泛，療效確切。眾多成方制劑如六神丸、麝香保心丸、蟾酥注射液等均含有該藥材。由于蟾蜍基原動物的多樣化，加之中藥大品種的技術升級以及蟾酥資源需求量的增加，蟾酥價格不斷高漲，不法商販在蟾酥中摻假以謀取暴利，導致市場商品蟾酥品種混雜、摻雜、摻假現(xiàn)象嚴重，常見摻偽品主要包括：淀粉、泥沙、蛋白、松香粉、牙膏、肥皂、豬油等雜質[8]。混偽品導致蟾酥質量差異較大，不能保證用藥的有效性和安全性。因此建立有效可靠的蟾酥藥材鑒定方法，用于嚴格控制蟾酥藥材及飲片的質量顯得尤為重要。

蟾酥常用的傳統(tǒng)真?zhèn)舞b別方法包括外觀形狀鑒別和理化鑒別。但由于蟾酥經(jīng)過初加工后，缺乏基原動物的外觀形態(tài)，傳統(tǒng)鑒別法存在一定的局限性。近年來，隨著DNA分子鑒定技術的發(fā)展，基于COI基因條形碼技術的藥材分子鑒定為動物藥材的鑒別提供了全新而有效的輔助手段[9]。但由于蟾蜍是兩棲類動物，且該兩棲類物種基因組受環(huán)境影響較大，基因組存在較大的變異性，單純依靠COI測序難以對蟾蜍進行鑒定。此外，在蟾酥加工過程中，DNA受到較大破壞，因此難以從蟾酥中提取線粒體DNA，更增加了通過條形碼鑒定混偽品的難度。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、整體的鑒定手段，可較全面地反映藥材/飲片的化學成分以及特征峰面積的相對比例。在對藥材/飲片指紋圖譜分析的基礎上，采用不同的統(tǒng)計處理方法進行化學模式識別，可在藥材/飲片質量、產(chǎn)地、種屬、真?zhèn)蔚呐袆e中克服人工鑒定的主觀因素，從而更加準確地對藥材進行真?zhèn)舞b別和質量評價，應用廣泛[10-11]。本研究采用HPLC梯度洗脫法構建不同產(chǎn)地蟾酥藥材指紋圖譜，并對10批樣品進行相似度評價、聚類分析和主成分分析，旨在為蟾酥的質量控制和鑒別研究提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，Waters2996型二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站(美國Waters公司)，METTLER AB204-S萬分之一電子天平，METTLER AG285十萬分之一電子天平，Milli-Q純水器(美國Millipore公司)

1.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純(美國TEDIA公司)；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.3 對照品

蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對照品由江蘇省中醫(yī)藥研究院化學研究室提供，純度>98%。

1.4 實驗樣品采集及鑒定

本研究所用蟾酥樣品詳見表1。所有樣品均由江蘇省中藥研究院中藥資源實驗室錢士輝研究員鑒定。

表1 蟾酥樣品信息

2 實驗方法

2.1 色譜條件

利用高效液相色譜法，采用Waters MS C18色譜柱(250 mm×4.6mm，5 μm)；流動相：純水和0.1% TFA乙腈溶液(梯度洗脫)；檢測波長：296 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，進樣體積30 μL。

表2 純水(A)-0.1% TFA乙腈(B)梯度洗脫

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對照品適量，分別用甲醇溶解得對照品溶液。精密吸取各對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取蟾酥細粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇稱質量，加熱回流提取1 h，放冷，加甲醇補足損失質量，搖勻，靜置，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 實驗結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 精密度試驗 取蟾酥供試品溶液(S1)，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，采用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》分析，以蟾毒靈為參照物，各共有峰相對保留時間RSD為0.096 0%～0.156 9%，相對峰面積RSD為0.840 6%～3.349 3%，均小于5%，符合指紋圖譜檢測要求。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗 取蟾酥供試品溶液(S1)分別在0、2、4、12、24 h進行HPLC檢測，以蟾毒靈為參照物，各共有峰的相對保留時間RSD值為0.263 6%～0.521 2%，相對峰面積RSD為2.414 0%～3.666 3%，表明供試液24 h內穩(wěn)定。

3.1.3 重復性試驗 取同一份蟾酥樣品(S1)6份，按2.3項下方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，采用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》分析，以蟾毒靈為參照物，各共有峰相對保留時間RSD為0.063 9%～0.439 0%，相對峰面積RSD為0.659 2%～4.952 0%，表明重復性良好。

3.2 不同產(chǎn)地蟾酥指紋圖譜的建立與分析

3.2.1 HPLC指紋圖譜測定 取不同產(chǎn)地10批蟾酥樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果見圖1。

圖1 蟾酥HPLC特征圖(S1～S10)

3.2.2 對照指紋圖譜的建立和共有峰的標定 將3.2.1條件下測定的色譜圖數(shù)據(jù)導入相似度評價系統(tǒng)軟件，以S1樣品為參考圖譜，時間窗寬度設為0.1 s，中位數(shù)法生成對照指紋圖譜(圖2)。蟾酥色譜指紋圖譜以保留時間為44.079 6 min的9號峰作為參照峰S，對不同蟾酥藥材的指紋圖譜進行考察，共確定了10個共有峰，各共有峰面積見表3。

圖2 蟾酥對照指紋圖譜

表3 不同產(chǎn)地10批蟾酥藥材共有峰面積

3.2.3 指紋圖譜分析 由圖1可知，蟾酥化學成分復雜，不同產(chǎn)地蟾酥化學組成基本相似，但含量差別較大，其共有峰面積RSD為4.22%～17.31%，在10 批次樣品圖中9號色譜峰(蟾毒靈)的分離度良好，所有樣品共有且為蟾酥主要成分之一，因此將其確定為參照峰S。

3.2.4 相似度評價 使用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012版)》對10批蟾酥藥材色譜數(shù)據(jù)進行分析，以S1樣品色譜圖譜作為參照圖譜，采用“中位數(shù)”法生成對照圖譜，得到10批蟾酥藥材特征圖譜及相似度。結果10批不同產(chǎn)地蟾酥藥材各色譜圖相似度在0.920～0.967，表明10批藥材相似度較好。

表4 不同產(chǎn)地蟾酥HPLC指紋圖譜相似度計算結果

3.3 主成分分析

以蟾酥指紋圖譜中標定的共有峰相對峰面積為變量，用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件的因子分析進行主成分分析，以主成分的特征根及貢獻率作為選擇主成分的依據(jù)。主成分個數(shù)提取原則是取主成分對應的特征值大于1的前2個主成分，其累計貢獻可以達到87.558%，即包括了大部分信息。其中第一主成分特征值為5.977，方差貢獻率為59.769%；第二個主成分特征值為2.779，方差貢獻率為27.789%。分別以第一、第二主成分來建立坐標系，得到所有樣本PCA二維投影圖(圖4)，圖中每一個點對應一個產(chǎn)地，10個產(chǎn)地可分為3類。

圖3不同產(chǎn)地蟾酥藥材PCA圖

3.4 共有蜂的確認

本研究對10批蟾酥供試品溶液進行指紋圖譜檢測，確定了10個共有峰，并通過與對照品溶液比對，指認了其中3個色譜峰，分別為7號(蟾毒它靈)、9號(蟾毒靈)、10號(華蟾毒精)。結果見圖4。

注：A.對照品；B.蟾酥樣品；7.蟾毒它靈；9.蟾毒靈；10.華蟾毒精。圖4 對照品和蟾酥樣品HPLC圖

4 結論

蟾酥為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物。我國分布的蟾蜍科蟾蜍屬動物品種眾多，達十余種之多。分布最廣的是中華大蟾蜍、花背蟾蜍BuforaddeiStrauch、黑眶蟾蜍和華西蟾蜍BufobufoAndrewsi。有研究表明，不同基原動物蟾酥成分差異顯著。不同品種蟾蜍地理上交叉分布，加上捕捉者缺乏動物品種的準確辨識，易導致蟾酥品種混雜現(xiàn)象以及蟾酥藥材質量的參差不齊，從而嚴重影響藥材療效及安全性，增加臨床用藥的安全風險。

本研究收集了10批不同產(chǎn)地的蟾酥藥材，優(yōu)化色譜條件，建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜。在10個共有峰中，有3個色譜峰經(jīng)與對照品溶液比對，分別指認為蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾毒精。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)分析不同批次蟾酥樣品的相似度為0.920～0.967，表明10批藥材相似度較高。利用PCA方法對蟾酥藥材的HPLC指紋圖譜進行分析。聚類分析結果表明，10批樣品可分成3類，樣品S1、S2、S6、S7、S8、S10聚為一類，樣品S3、S9聚為一類，樣品S4、S5聚為一類，與相似度結果一致。

本研究建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜，共確定了10個共有蜂。中藥指紋圖譜可以全面反映蟾酥藥材的化學成分以及各特征性有效成分間峰面積的相對比例，進而反映蟾酥藥材的內在質量，為蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評價優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。本實驗采用指紋圖譜結合PCA對不同產(chǎn)地蟾酥進行質量評價，所建立的測定方法快速準確，靈敏度高，可為蟾酥藥材的質量控制和質量鑒別提供有效手段。