基于生物信息學和質(zhì)譜技術(shù)的阿膠特異性肽段篩選與鑒定△

王芳，范雨，葉茂，曹秀君，童芯鋅，彭成，國錦琳

成都中醫(yī)藥大學 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室 中藥材標準化重點實驗室，四川 成都 611137

阿膠(Asini Corii Colla)為馬科動物驢EquusasinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮和濃縮制成的固體膠，具有優(yōu)良的滋補作用?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)明確規(guī)定生產(chǎn)阿膠的原料是驢皮[1]。由于阿膠在市場上經(jīng)常供不應求，以其他動物皮加工成偽阿膠的現(xiàn)象層出不窮，主要以廉價的豬皮、牛皮作為皮源，甚至用重金屬超標的廢舊皮革制成的明膠摻假，服用后有明顯不良反應，因此亟需建立阿膠質(zhì)量控制方法。

不同皮源膠原蛋白同源性高，氨基酸組成及含量極為相近，具有相似的化學性質(zhì)，常用方法如：氨基酸組分含量分析、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)法及色譜法等均缺乏專屬性、針對性，難以對不同皮源膠原蛋白進行有效鑒別[2]。阿膠在加工過程中脫氧核糖核酸(DNA)降解破壞嚴重，因此DNA分子鑒定方法難以有效鑒別阿膠[3]。近年來，雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)識別特征多肽逐漸成為膠類中藥材鑒定的主流方法[2]。Aina等[4]采用2-DE技術(shù)初步檢測出10個豬皮膠特異蛋白斑點，2-DE技術(shù)對蛋白制備要求高，條件考察繁瑣。而LC-MS技術(shù)由于其快速、精準及全面分離分析的特點，已廣泛用于蛋白組學研究，成為對多肽組分、結(jié)構(gòu)及殘基修飾進行分析的主流技術(shù)[5]。2009年，Zhang等[6]利用胰酶酶解豬和牛明膠，通過LC-MS檢測出可區(qū)分豬和牛明膠的特征肽并給出氨基酸序列，建立了LC-MS技術(shù)識別特征肽鑒別豬牛明膠的新方法。2012年，Cheng等[7]通過超高壓液相色譜-串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-QTOF)首次系統(tǒng)性檢測5種皮膠原(驢皮膠、豬皮膠、牛皮膠、龜殼膠及鹿角膠)特征肽對5類皮膠原進行專屬性鑒別，但比對特征肽序列發(fā)現(xiàn)牛皮膠特征肽序列與驢皮膠并無差異，可能是樣品前處理導致結(jié)果不太理想。《中國藥典》中采用LC-MS法，以質(zhì)荷比(m/z)539.8離子對阿膠進行鑒定，但未給特征肽序列[1]，特異性不能最終確定，但仍能表明LC-MS技術(shù)已用于建立膠類藥材質(zhì)量控制規(guī)范。2015年，Chen等[8]采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法建立了特異快速檢測中成藥鹿角膠中摻偽驢皮和牛皮成分專屬性特征離子峰方法，但未確定特征肽序列。綜上所述，當前鑒定方法存在一些共有的局限：1)皮膠原成分復雜，除了主要成分膠原蛋白外，還含有血清蛋白、毛發(fā)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會干擾以膠原蛋白為對象的鑒定方法，另外，膠原蛋白分子量大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及難溶等特點也會影響實驗穩(wěn)定性、準確性，但此環(huán)節(jié)常被忽略；2)基于酶解后基質(zhì)的復雜性，直接從總離子流圖(TIC)中尋找特征性肽段，針對性不強，效率不高；3)找出了特征離子，還需進一步的鑒定特征肽序列以驗證實驗結(jié)果準確性，繁瑣耗時。

因此，本研究首次通過生物信息技術(shù)模擬酶解過程以全面準確地預測驢皮、豬皮及牛皮的特征肽并獲得相應的序列及分子量信息，對樣品前處理和酶解條件進行全面考察優(yōu)化，獲得穩(wěn)定、大量、連續(xù)的小分子肽段，采用UPLC/Q-TOF-MS進行高效分離分析，驗證理論篩選出的特征肽段，從而建立穩(wěn)定、靈敏、可量化及專屬性高的阿膠鑒定和質(zhì)量控制方法。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 隨機收集不同企業(yè)不同批號的阿膠以及不同市場銷售的驢皮、牛皮和豬皮樣品，樣品信息見表1，均經(jīng)過成都中醫(yī)藥大學國錦琳教授鑒定，留樣保存于成都中醫(yī)藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室。

表1 樣品信息

1.1.2 試劑 牛血清蛋白(BSA)、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris堿、N，N′-甲叉丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購自Bio-Rad公司；考馬斯亮藍R-250與G-250、過硫酸銨(APS)、β-巰基乙醇和溴酚藍指示劑均購自鵬程生物科技有限公司；極低分子量標準蛋白質(zhì)Marker、低分子量標準蛋白質(zhì)Marker購自北京Solarbio；胰蛋白酶Trypsin 1：250(CAS：9002-07-7，Amersco)。

乙腈、甲醇為色譜純，均購自Thermofisher公司；碳酸氫銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸、三氯甲烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙醇、丙酮、冰乙酸、甲酸、丙三醇和三氯乙酸均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.1.3 儀器 肽柱-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent)；L-8900型全自動氨基酸分析儀(日立高新技術(shù)公司)；UMAX PowerLook 2100XL凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；MINI-PROTEAN 165-8000小型垂直電泳儀(Bio-Rad)；DHG-9035A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海島韓實業(yè)公司)；BP211D 型十萬分之一分析天平(德國Sartorius)；UV-1800 PC型紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；Agilent 1200SL-6210A高效液相串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(Agilent)；DP-D501普通型冷凍干燥機(無錫德普儀器制造有限公司)。KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FE-20K型pH計(上海美譜達儀器有限公司)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；Allegra TM X-22R型低溫高速離心機(美國Beckman Coulter)。

1.2 生物信息技術(shù)模擬酶解

通過查詢National Center for Biotechnology Information蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(NCBI)，采用生物信息學軟件ExPaSy PeptideCutter模擬酶解尋找酶切位點，比對驢皮、牛皮和豬皮的I型膠原蛋白α1鏈氨基酸序列，找出其差異。再利用軟件ExPASy PeptideMass模擬胰酶酶解結(jié)果，篩查驢皮特異性肽段[9]。

1.3 樣品處理

所有皮部樣品均按照《中國藥典》方法進行處理，具體做法是：先取一定量的樣品，浸泡于水中并除毛切塊，再次洗凈后水煮過濾，將過濾液濃縮至濃稠糊狀，最后冷卻使其凝固，切成片并干燥，制成堅固的膠狀，打粉過六號藥典篩后4 ℃保存。

本研究摸索超聲法、加熱法及碾磨法對樣品進行溶解處理。稱取1 g樣品粉末，加入40 mL 1% NH4HCO3溶液置于50 mL錐形瓶中，密封后用超聲處理20 min；密封后放入水浴鍋中以60 ℃加熱30 min溶解后取出樣品溶液；稱取1 g阿膠樣品粉末于研缽中碾磨，加入40 mL1% NH4HCO3溶液研磨至溶解；將3種方法處理后的溶解樣品分別按8000 r·min-1離心20 min，Bradford法[10]測定蛋白含量。采用環(huán)己烷-三氯甲烷和環(huán)己烷-二氯甲烷萃取系統(tǒng)對樣品進行處理[11-12]。再通過三氯乙酸-丙酮法、過濾法和超濾法進行純化[13]。在參考方法上稍有改動：過濾法，將溶解后的樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，置4 ℃保存待用；超濾法，將萃取后的樣品置于10 kDa的超濾管中3000 r·min-1離心30 min后將小分子雜質(zhì)除去。通過SDS-PAGE電泳法對樣品處理效果進行評定，分離膠質(zhì)量分數(shù)為6%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為4%，上樣量為20 μL，其余蛋白樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生物酶解

將上述蛋白樣品進行胰酶酶解(1% NH4HCO3配制成1 mg·mL-1胰酶溶液，酶活250 U·mg-1)。為保證樣品中膠原蛋白被完全酶解為小肽，本研究從酶解的時間、溫度、酶量、pH值4個方面進行考察條件[9]，設置如表2所示。

將酶解液放入超濾管中3000 r·min-1離心50 min，收集濾液，三羥甲基甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)進行分析[9]。

表2 酶解條件

1.5 UPLC/Q-TOF-MS分析

色譜柱為Agilent肽柱-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；選用0.1%甲酸水溶液作為流動相A，選用乙腈作為流動相B。梯度0～5 min，5%B；5～8 min，5%～10%B；8～32 min，10%～20%B；32～38 min，20%～95%B；38～38.1 min，95%～5%B；流速0.30 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量1.0 μL。

氮氣流量為10 L·min-1，毛細管電壓為4.0 kV，噴霧壓力為40 Psi，碎裂電壓設為150 V，霧化氣溫度350 ℃，在正離子模式下檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 I型膠原蛋白模擬酶切的生物信息分析

I型膠原蛋白α1鏈氨基酸序列在NCBI、Swiss-prot上查得，其序列號為：豬皮Ovisaries(XP_013836466)、驢皮Equusasinus(GI：221665286)、牛皮Bostaurus(GI：77404252)。通過DNAMAN 6.0軟件進行同源比對，上述序列相似性95.56%。可以看出，不同種類的動物皮，盡管I型膠原蛋白α1鏈序列非常相似，但是所查到的3種皮類的氨基酸序列存在差異，這為后續(xù)試驗提供了理論基礎(chǔ)。除此之外，序列的比對結(jié)果表明，4種膠原蛋白特異氨基酸(羥脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸)的組成與含量沒有顯著差別，這提示了傳統(tǒng)區(qū)分阿膠的真?zhèn)蔚姆椒ㄊ蔷哂胁蛔阒幍摹?/p>

據(jù)Peptide Cutter生物信息學軟件模擬酶解過程，顯示出膠原蛋白能被胰酶酶解為相對較多的小分子片段，因此選擇胰酶酶切。然后經(jīng)過軟件系統(tǒng)ExPASy PeptideMass模擬酶切得到的肽段序列，與后續(xù)特異性肽片段互相印證。表3顯示的是通過3種皮類I型膠原蛋白α1鏈模擬酶切結(jié)果，酶解肽段分子量在0.6～2.5 kDa范圍內(nèi)，對比篩選出13個牛皮、12個驢皮及12個豬皮源特異肽段，酶解肽段具有較高的連續(xù)性和匹配度，為質(zhì)譜識別特征多肽提供基礎(chǔ)，也為后期實驗奠定理論依據(jù)。

表3 生物信息分析篩選的牛皮、驢皮、豬皮I型膠原蛋白α1鏈特征肽段信息

2.2 驢皮及其他皮類總離子流圖的建立

2.2.1 樣品前處理條件優(yōu)化 阿膠含雜質(zhì)多，主要成分為膠原蛋白，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難溶。本實驗比較了超聲法、加熱法及研磨法溶解樣品，結(jié)果表明：加熱法比超聲法溫和，提取的蛋白量大，蛋白損傷量小。二氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)和超濾法純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳(見圖1)?？梢钥闯?，蛋白分子量在180～300 kDa，符合膠原蛋白分子量分布范圍。基于以上數(shù)據(jù)，本研究采用加熱法溶解、二氯甲烷-環(huán)己烷萃取和超濾法對樣品進行前處理。

注：A.萃取系統(tǒng)考察；B.純化條件考察；1.三氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)；M.蛋白Marker；2.二氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)；3.過濾法；4.超濾法；5.三氯乙酸-丙酮法。圖1 不同前處理條件阿膠的SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.2 酶解條件優(yōu)化 通過Tricine-SDS-PAGE檢測酶解結(jié)果，優(yōu)化后的酶解條件為：酶解溫度38 ℃，消化時間12 h以上，pH 8.0，加酶比為4∶1～1∶1，底物質(zhì)量濃度為0.017～0.025 g·mL-1。以上條件下，膠原蛋白被較為充分酶解，酶解肽段多集中在1.2～3.3 kDa，與生物信息預測結(jié)果基本相符，圖2為底物濃度考察結(jié)果。

注：1.加酶比為1∶1；2.加酶比為2∶1；M.蛋白Marker；3.加酶比為3∶1；4.加酶比為4∶1。圖2 底物濃度考察Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.3 3種皮類UPLC-TOF/MS分析結(jié)果 由圖3可見，3種皮類的多肽總離子流圖較為相似，主要是由于特征性肽段的數(shù)量在膠原蛋白序列中所占比例小。根據(jù)《中國藥典》方法提供的阿膠特征性多肽離子m/z 539.8，對3種皮類的圖譜進行提取離子分析。

注：Sample 1.牛皮樣品多肽總離子流圖；Sample 2.豬皮樣品多肽總離子流圖；Sample 3.驢皮樣品多肽總離子流圖。圖3 3種皮類所得多肽的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

經(jīng)驗證，m/z539.8對樣品進行提取離子分析，能找出3種皮類的差異，酶解驢皮在16.87 min提取離子掃描中有明顯響應值。而其他皮類是空白，由此可根據(jù)m/z539.8來鑒定阿膠真?zhèn)?，?jīng)換算，藥典用于鑒定阿膠的特征肽段不包含在生物信息技術(shù)預測的驢皮特征肽段內(nèi)，推測可能由于樣品前處理及酶解條件差異產(chǎn)生不完全酶解或與肽段上某些氨基酸殘基后期修飾有關(guān)。

將理論計算出的特異性肽段分子量換算為m/z，實驗驗證結(jié)果顯示，m/z766.4能找出3種皮類的差異，酶解驢皮在27.76 min提取離子掃描中有明顯響應值，表明m/z為766.4，分子量為1 530.802 2可作為鑒別阿膠的特異峰，對應的多肽為GEAGPAGPAGPIGPVGAR。

2.3 實際樣品的鑒定結(jié)果

對于10組收集到的樣品用上述的特異性阿膠鑒別方法能進行有效的鑒別。數(shù)據(jù)結(jié)果表明(圖4)，10組阿膠樣品中，僅3、4、10號阿膠樣品檢測出特征峰，以驢皮膠為對照，測定特征峰相對豐度，結(jié)果顯示這3種阿膠樣品相對豐度分別為67%、38%、72%，因此，這3種阿膠產(chǎn)品基本符合標準，通過特征峰豐度分析可進一步量化阿膠產(chǎn)品中驢皮膠含量。第7、9號樣品也出現(xiàn)特征峰，但相對豐度比例甚小，其余5種阿膠樣品完全檢測不出特征峰，可由此結(jié)果推測阿膠質(zhì)量問題之嚴重。

注：A.3號阿膠樣品的提取離子流圖；B.4號阿膠樣品的提取離子流圖；C.10號阿膠樣品的提取離子流圖。圖4 酶解阿膠樣品m/z 766.4時提取離子流圖

3 結(jié)論與展望

驢、牛及豬的膠原蛋白氨基酸序列在NCBI上查得后經(jīng)ExPASy PeptideMass進行酶切模擬，得到12段驢皮存在的特異性肽段，可能為特異性鑒別肽段。經(jīng)實驗驗證，m/z766.4，分子量為1 530.802 2，對應的多肽為GEAGPAGPAGPIGPVGAR能有效鑒別驢皮與其他皮類。在10組阿膠樣品中，據(jù)此肽段進行鑒定的結(jié)果表明該方法與《中國藥典》方法的鑒定能力一致。本實驗首次運用生物信息技術(shù)模擬、對比和篩選3種皮類胰酶酶解的差異性肽段，并提供肽段的氨基酸序列、位置及分子量。與已報道的特征肽段檢測方法相比，本研究采用生物信息技術(shù)結(jié)合HPLC-MS方法，通過理論實驗相互印證使結(jié)果更加全面、穩(wěn)定、高效。另外，本研究首次對樣品前處理方法進行系統(tǒng)考察，為后續(xù)實驗穩(wěn)定、高效奠定基礎(chǔ)。本研究基于生物信息技術(shù)結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，檢測到1條與預測結(jié)果匹配的驢皮膠特異肽，下一步將建立阿膠特異肽數(shù)據(jù)庫，促進膠類藥材質(zhì)量控制方法的系統(tǒng)化和標準化。