PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)肺泡上皮鈉通道α亞基表達(dá)的影響*

鄧 旺，李長(zhǎng)毅，王導(dǎo)新

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400010)

肺泡上皮鈉通道(epithelial sodium channel，ENaC)表達(dá)于Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，由α、β和γ 3個(gè)亞基組成。目前研究認(rèn)為清除肺泡腔內(nèi)水腫液的主要機(jī)制是通過ENaC完成鈉離子從頂膜到基底膜側(cè)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程[1]。有效清除肺泡腔內(nèi)過多的水腫液，維持肺泡腔相對(duì)干燥，是治療急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和決定其預(yù)后的關(guān)鍵[2]。研究顯示，α-ENaC基因敲除的小鼠因不能有效清除肺水腫液于出生后40 h死亡，因此α-ENaC可能是影響肺水腫液清除的主要亞基[3]。磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一條能減輕ARDS肺水腫的保護(hù)性通路[4]。但PI3K/Akt 信號(hào)通路參與肺水腫液清除的機(jī)制是否通過調(diào)控α-ENaC的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)目前尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)A549細(xì)胞(肺上皮細(xì)胞)，探討PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控α-ENaC表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1材料 肺上皮細(xì)胞A549及培養(yǎng)基RPMI1640購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院。重組人胰島素購(gòu)自美國(guó)禮來公司。LY294002購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？俁NA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。α-ENaC及β-actin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。Akt及磷酸化Akt(p-Akt)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 A549細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中(含10%小牛血清)，然后放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞貼壁100%開始干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組細(xì)胞在不含10%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；胰島素組細(xì)胞在不含10%小牛血清的培養(yǎng)基中分別給予胰島素2、20、200 mU/L培養(yǎng)120 min，另加入胰島素200 mU/L培養(yǎng)30、60、120 min；LY294002組細(xì)胞在不含10%小牛血清的培養(yǎng)基中加入胰島素200 mU/L和LY294002 10 μmol/L(抑制PI3K/Akt通路[5])培養(yǎng)2 h。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)α-ENaC mRNA表達(dá) 用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按說明書進(jìn)行。PCR引物序列：α-ENaC(509 bp)上游引物5′- TAC CCT TCC AAG TAT ACA CAG C-3′，下游引物5′-CAG AAG GAG ACT CCG AAT TAG T-3′；β-actin(871 bp)上游引物：5′-GTA CAA CCT TCT TGC AGC TCC T-3′，下游引物：5′-ACA GGA TTC CAT ACC CAG GAA G-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 1 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃(α-ENaC)和55 ℃(β-actin)30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物8 μL與上樣緩沖液混勻，1.2%瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)成像，Quantity One軟件分析目的條帶灰度，以目的條帶與β-actin比值作為結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)α-ENaC蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，取35 μg總蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別與α-ENaC(1∶300)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗體4 ℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析目的條帶吸光度值，以目的條帶與β-actin比值作為結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度胰島素對(duì)α-ENaC mRNA表達(dá)的影響 2、20、200 mU/L胰島素作用A549細(xì)胞2 h后，α-ENaC mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.331±0.032)、(0.588±0.014)、(0.739±0.029)，隨胰島素濃度增加而增加，與對(duì)照組α-ENaC mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(0.131±0.021)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Marker：標(biāo)記物；1：對(duì)照組；2：胰島素2 mU/L組；3：胰島素20 mU/L組；4：胰島素200 mU/L組

圖1不同濃度胰島素對(duì)α-ENaC mRNA表達(dá)的影響

2.2不同濃度胰島素對(duì)α-ENaC蛋白及p-Akt表達(dá)的影響 2、20、200 mU/L胰島素作用A549細(xì)胞2 h后，α-ENaC蛋白表達(dá)水平分別為(1.043±0.079)、(1.239±0.092)、(1.924±0.056)，隨胰島素濃度增加而增加，與對(duì)照組α-ENaC蛋白表達(dá)水平(0.820±0.037)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。p-Akt水平隨胰島素濃度增加而增加，2、20、200 mU/L胰島素作用后p-Akt水平分別為(0.054±0.006)、(0.069±0.005)、(0.125±0.008)，與對(duì)照組p-Akt水平(0.021±0.002)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2B。

A：α-ENaC蛋白表達(dá)水平；B：p-Akt表達(dá)水平；1：對(duì)照組；2：胰島素2 mU/L組；3：胰島素20 mU/L組；4：胰島素200 mU/L組

圖2不同濃度胰島素對(duì)α-ENaC蛋白及p-Akt表達(dá)水平的影響

2.3胰島素作用不同時(shí)間對(duì)α-ENaC mRNA表達(dá)的影響 200 mU/L胰島素作用30、60、120 min后，α-ENaC mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.437±0.035)、(0.534±0.048)、(0.916±0.069)，隨胰島素作用時(shí)間增加而增加，與對(duì)照組α-ENaC mRNA表達(dá)水平(0.818±0.008)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4胰島素作用不同時(shí)間對(duì)α-ENaC蛋白及p-Akt表達(dá)的影響 200 mU/L胰島素作用30、60、120 min后，α-ENaC蛋白表達(dá)水平分別為(0.544±0.036)、(0.678±0.028)、(0.879±0.069)，隨胰島素作用時(shí)間增加而增加，與對(duì)照組α-ENaC蛋白表達(dá)水平(0.424±0.042)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4A。p-Akt水平隨胰島素作用時(shí)間增加而增加，200 mU/L胰島素作用30、60、120 min后，p-Akt水平分別為(0.045±0.006)、(0.089±0.007)、(0.176±0.027)，與對(duì)照組p-Akt水平(0.019±0.005)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4B。

Marker：標(biāo)記物；1：0 min；2：30 min；3：60 min；4：120 min

圖3胰島素作用不同時(shí)間對(duì)α-ENaC mRNA表達(dá)的影響

A：α-ENaC蛋白表達(dá)水平；B：p-Akt表達(dá)水平；1：0 min 2：30min 3：60min 4：120min

圖4胰島素作用不同時(shí)間對(duì)α-ENaC蛋白及p-Ak表達(dá)水平的影響

2.5LY294002干預(yù)后對(duì)α-ENaC mRNA表達(dá)的影響 200 mU/L胰島素作用A549細(xì)胞2 h后，α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組[(0.689±0.033)vs. (0.472±0.048)，P<0.05]。10 μmol/L LY294002 作用后，明顯抑制了α-ENaC mRNA的表達(dá)[(0.176±0.035)vs. (0.689±0.033)，P<0.05]，見圖5。

Marker：標(biāo)記物；1：對(duì)照組；2：胰島素200 mU/L組；3：LY294002組

圖5 LY294002干預(yù)后對(duì)α-ENaC mRNA表達(dá)的影響

2.6LY294002干預(yù)后對(duì)α-ENaC蛋白及p-Akt表達(dá)的影響 胰島素(200 mU/L)作用A549細(xì)胞2 h后，α-ENaC蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組[(1.271±0.064)vs. (0.773±0.052)，P<0.05]；10 μmol/L LY294002作用后，明顯抑制了α-ENaC蛋白表達(dá)[(0.354±0.034)vs. (1.271±0.064)，P<0.05]，見圖6A。與對(duì)照組相比，胰島素作用后p-Akt水平明顯升高[(0.144±0.008)vs. (0.030±0.005)，P<0.05]；LY294002 作用后，明顯抑制了胰島素引起的Akt磷酸化，p-Akt水平降低[(0.017±0.004)vs. (0.144±0.008)，P<0.05]，見圖6B。

A：α-ENaC蛋白表達(dá)水平；B：p-Akt表達(dá)水平；1：對(duì)照組；2：胰島素200 mU/L組；3：LY294002組

圖6 LY294002干預(yù)后對(duì)α-ENaC蛋白及p-Akt表達(dá)水平的影響

3 討 論

肺毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致肺泡腔內(nèi)大量水腫液形成是ARDS發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理過程。學(xué)界對(duì)ARDS進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)與臨床研究，但因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍然缺乏有效的治療措施。研究顯示，上調(diào)ENaC的表達(dá)能有效清除肺泡腔內(nèi)聚集的水腫液，維持氣體交換，改善頑固性低氧血癥，對(duì)治療ARDS具有重要意義[7]。其中，α-ENaC在肺泡上皮細(xì)胞中含量最高，是維持鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)及肺水腫液清除的關(guān)鍵亞基。

PI3K參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及代謝調(diào)節(jié)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。Akt是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游中心環(huán)節(jié)，同時(shí)也是胰島素發(fā)揮效應(yīng)的主要通路[8-9]。研究顯示，PI3K參與調(diào)控胰島素作用下的腎臟上皮細(xì)胞ENaC的表達(dá)，但其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制并沒有闡明[10]。PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)控ARDS的炎性反應(yīng)，減輕肺水腫及肺損傷[11]。但此通路是否調(diào)控γ-ENaC的mRNA和蛋白表達(dá)還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究顯示，不同濃度的胰島素(2、20、200 mU/L)分別干預(yù)A549細(xì)胞后，α-ENaC mRNA和蛋白表達(dá)同步上調(diào)，其變化趨勢(shì)呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，同時(shí)Akt磷酸化水平也同步增加。說明胰島素激活PI3K/Akt信號(hào)通路后，α-ENaC的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平增加。同樣，經(jīng)過胰島素作用不同時(shí)間后，α-ENaC mRNA和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)依賴性增加，Akt磷酸化水平與α-ENaC表達(dá)變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證明了激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)α-ENaC表達(dá)的作用。本實(shí)驗(yàn)中，阻斷PI3K/Akt通路后，α-ENaC mRNA和蛋白表達(dá)下降，Akt磷酸化水平也同步下降，表明胰島素通過激活PI3K/Akt通路上調(diào)α-ENaC的表達(dá)。研究結(jié)果從體外實(shí)驗(yàn)證明了PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控α-ENaC表達(dá)的作用，與前期體內(nèi)研究結(jié)果一致[12]。

綜上所述，PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞α-ENaC的表達(dá)，對(duì)ARDS肺水腫液的清除起作用，同時(shí)也為疾病治療提供靶點(diǎn)。