高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽

周曉晴, 呂小麗, 萬建春, 郭 平*, 郭 丹, 席慧婷

(1. 江西省食品檢驗檢測研究院, 江西 南昌 330001;2. 南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室, 江西 南昌 330047)

氯酸鹽和高氯酸鹽是一類生活中普遍存在的有害污染物。氯酸鹽是二氧化氯消毒產(chǎn)生的無機副產(chǎn)物,也可由自然界中含氯化合物分解產(chǎn)生。氯酸鹽具有強氧化性,會影響人體的血液系統(tǒng),引起高鐵性血紅蛋白血癥[1]和貧血癥,也可能導致神經(jīng)和呼吸道中毒,降低精子活力和數(shù)量[2-4]。高氯酸鹽常用作化肥原料,大氣中也能夠產(chǎn)生高氯酸根[5]。人工合成的高氯酸鹽作為氧化劑被廣泛用于煙花生產(chǎn)、橡膠制造、皮革加工、火箭固體推進劑等化工領域[6],生產(chǎn)中不合理的處理易導致其遷移至地表水中,污染土壤、飲用水和食品。毒理學研究[7,8]表明,高氯酸鹽對人體健康的影響主要集中在甲狀腺功能方面,它可抑制碘的吸收,引起甲狀腺功能失調(diào),影響人體正常生長發(fā)育?？紤]健康風險,歐洲食品安全局(EFSA)設定氯酸鹽和高氯酸鹽的每日可耐受攝入量分別為3和0.3 μg/kg BW/day[9]。在奶粉生產(chǎn)過程中,氯酸鹽和高氯酸鹽可能作為中間生產(chǎn)的污染物,殘留在奶粉中,而我國目前暫未制定氯酸鹽和高氯酸鹽的限量標準,因此對奶粉中的殘留量進行監(jiān)控十分必要。

近年來,應用于檢測氯酸鹽和高氯酸鹽的方法有分光光度法[10]、離子色譜法[11,12]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[13-15]、高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法等[16-18]。分光光度法的檢測設備條件要求不高,早期用于高氯酸鹽含量的粗篩,由于設備靈敏度的問題,只適用于較高含量的測定。離子色譜雖能對飲用水、水果和蔬菜等各種食品進行較為準確地定量,但電導檢測器缺乏選擇性,離子色譜法存在干擾嚴重、檢測易假陽性和不能進行痕量定量的缺點。離子色譜-質(zhì)譜雖較離子色譜有很大優(yōu)勢,但IC-MS/MS在實際應用中存在普及率低、離子色譜柱不耐受有機溶劑、大體積進樣易造成柱子過載等問題。隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,這種技術(shù)靈敏度高、定性準確,正越來越廣泛地應用在了高氯酸鹽的檢測分析中。但應用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時測定奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的文獻報道相對較少。

奶粉基質(zhì)復雜,為提高氯酸鹽和高氯酸鹽檢測的準確性,本實驗在已有研究基礎上,利用LC-MS/MS結(jié)合同位素內(nèi)標法定量檢測手段,建立了奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定方法。與現(xiàn)有的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-18]相比,通過優(yōu)化樣品提取劑和固相萃取凈化過程,選擇0.1%(v/v)甲酸-乙腈對樣品進行提取,提取液經(jīng)PRiME HLB固相萃取柱凈化后直接上機分析,無需濃縮,操作簡單,準確度高,改善了譜峰寬的不足。本方法可適用于奶粉等乳制品中氯酸鹽和高氯酸鹽的快速檢測和監(jiān)控。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC TQS高效液相色譜-質(zhì)譜儀(配備電噴霧離子(ESI)源)(美國Waters公司); G-16離心機(德國Sartorius公司); Vortex Wizard渦旋儀(意大利VELP公司); VAC ELUT-20固相萃取裝置(美國Agilent公司); Synergy純水系統(tǒng)(德國Merck Millipore公司)。Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1復合離子交換柱(50 mm×2.1 mm, 3 μm)(美國賽默飛公司)。MCE混合纖維素酯膜(0.22 μm,島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司); PES聚醚砜膜(0.22 μm,津騰);尼龍膜(0.22 μm,島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司)。PRiME HLB、C18和PSA(N-丙基乙二胺)固相萃取柱(美國Waters公司);石墨化炭黑Carb和OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱(博納艾杰爾科技有限公司)。氯酸鹽標準品溶液(1 000 mg/L,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所),18O3氯酸鹽同位素內(nèi)標(200 mg/L,美國EURL-SRM公司),高氯酸鈉標準品溶液、18O4高氯酸鹽同位素內(nèi)標(均為100 mg/L,美國CIL公司);甲醇、乙腈均為色譜純(西班牙Scharlau公司),甲酸、乙酸銨為色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);實驗用奶粉樣品均購自超市。

1.2 標準溶液的配制

氯酸鹽標準中間溶液:準確吸取0.1 mL氯酸鹽標準品溶液(1 000 mg/L)于10 mL容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的氯酸鹽標準中間溶液,置于4 ℃冰箱保存。

混合標準中間液:分別準確吸取2 mL氯酸鹽標準中間溶液(10 mg/L)、0.1 mL高氯酸鈉標準品溶液(100 mg/L),置于同一10 mL容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,制成氯酸鹽、高氯酸鹽質(zhì)量濃度分別為2.0、1.0 mg/L的混合標準中間液,置于4 ℃冰箱保存。

混合同位素內(nèi)標液:分別準確吸取0.05 mL氯酸鹽同位素內(nèi)標(200 mg/L)、0.1 mL高氯酸鹽同位素內(nèi)標(100 mg/L),置于同一10.0 mL容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,制成氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽-18O4質(zhì)量濃度分別為4.0、1.0 mg/L的混合同位素內(nèi)標液,置于4 ℃冰箱保存。

混合標準曲線的配制:分別準確吸取混合標準中間液及混合同位素內(nèi)標液適量,用20 mmol/L乙酸銨-甲醇溶液(1∶2, v/v)稀釋,制成系列質(zhì)量濃度的氯酸鹽溶液:2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/L,和高氯酸鹽溶液:1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L?；旌蠘藴使ぷ饕褐?氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽-18O4的質(zhì)量濃度分別為20.0、5.0 μg/L。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

準確稱取試樣2 g(精確至0.001 g),置于50 mL具塞離心管中,加入75 μL混合同位素內(nèi)標液,再加入5 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液,迅速混勻,置于45 ℃水浴超聲20 min,渦旋振蕩5 min,再準確加入10.0 mL乙腈,混勻,于10 000 r/min下常溫離心10 min,取上清液待凈化。

1.3.2樣品凈化

取3 mL上清液過PRiME HLB固相萃取柱,并接上0.22 μm MCE混合纖維素酯膜,收集續(xù)濾液,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1復合離子交換柱(50 mm×2.1 mm, 3 μm)(美國賽默飛公司);柱溫:35 ℃;流動相:A為乙腈,B為20 mmol/L乙酸銨溶液;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 35%A; 0.5～4.0 min, 35%A～65%A; 4.0～5.0 min, 65%A～90%A; 5.0～7.0 min, 90%A; 7.0～8.0 min, 90%A～35%A; 8～10 min, 35%A。進樣量:3 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源,負離子模式;多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓:3 kV;錐孔電壓:60 V;脫溶劑溫度:600 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L/h;錐孔氣流量:150 L/h。4種化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

以氯酸鹽標準溶液為對象,在負離子模式下,用全掃方式進行掃描,確定目標物的分子離子,考慮子離子豐度很弱,為滿足低分辨質(zhì)譜四分法原則,選取兩對母離子m/z82.9和m/z84.9,在一定碰撞氣和碰撞能條件下通過二級質(zhì)譜碎裂,分別獲取了子離子m/z66.9和m/z68.9,選取m/z66.9為定量離子。按同樣的方法得到高氯酸鹽的母離子為m/z98.9和m/z100.9,子離子m/z83.0和m/z85.0,選取m/z83.0為定量離子。根據(jù)氯酸鹽和高氯酸鹽的響應手動調(diào)節(jié)確定錐孔電壓為60 V,優(yōu)化后的碰撞能量參數(shù)見表1。

表 1 氯酸鹽和高氯酸鹽的母離子、子離子、碰撞能量及內(nèi)標物

* Quantitative ion.

2.2 色譜柱的選擇

氯酸鹽和高氯酸鹽均為具有極性的離子化合物,在反相色譜柱C18柱上難以保留,易出現(xiàn)峰形寬、拖尾或分叉的現(xiàn)象。SN/T 4089-2015[19]中使用IC-PakTMAnion HR的一款陰離子交換型色譜柱,高氯酸鹽峰形寬,時間跨度為1 min。Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1柱屬于離子交換型色譜柱,其填料的鍵合相可提供陰陽離子交換和反相的功能。本方法選取Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1柱進行測定?？紤]色譜柱洗脫需用鹽類,故選擇液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中較常用且較易揮發(fā)的乙酸銨。Thermo Scientific Acclaim TRINITY P1柱兼具反相功能,洗脫需用有機溶劑,乙腈洗脫能力大于甲醇,綜合考慮選擇20 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈為流動相,流速0.5 mL/min。在此條件下,氯酸鹽出峰時間為1.58min,高氯酸鹽出峰時間為3.84min。氯酸鹽和高氯酸鹽標準品的MRM色譜圖見圖1。

圖 1 氯酸鹽、高氯酸鹽及其內(nèi)標的MRM色譜圖Fig. 1 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of chlorate, perchlorate and their internal standards

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1濾膜的選擇

在色譜分析中,為避免堵塞管路,通常選用濾膜對待測樣液進行過濾。本文比較了MCE混合纖維素酯膜、PES聚醚砜膜和尼龍膜對氯酸鹽和高氯酸鹽測定的影響。用0.1%(v/v)甲酸水-乙腈(1∶2, v/v)配制10 μg/L的混合標準溶液,分別過MCE混合纖維素酯膜、PES聚醚砜膜和尼龍膜后,與未過膜的10 μg/L混合標準溶液一同上機檢測,同時做濾膜空白試驗。

3種濾膜的不加標準溶液的空白試驗均未檢出目標組分。從表2實驗結(jié)果可以看出,過膜對4種化合物的回收率有影響。其中尼龍膜的影響最大,使高氯酸鹽和高氯酸鹽內(nèi)標的回收率下降近約90%,說明濾膜會對目標物有吸附,所以導致回收率下降。結(jié)果表明,尼龍膜的吸附作用最強,PES聚醚砜膜次之,尼龍膜和PES聚醚砜膜的吸附情況與吳映璇等[20]的研究結(jié)果一致。因此最終確定采用MCE混合纖維素酯膜,然后上機檢測。

表 2 不同濾膜對氯酸鹽和高氯酸鹽的吸附情況

2.3.2凈化柱的選擇

固相萃取柱是凈化的主要方式,本文比較了PRiME HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱、石墨化炭黑Carb固相萃取柱、PSA固相萃取柱和OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱對氯酸鹽和高氯酸鹽及其內(nèi)標的凈化效果。

使用前,C18固相萃取柱分別用5 mL色譜純甲醇和5 mL超純水進行活化,石墨化炭黑Carb固相萃取柱、PSA固相萃取柱和OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱分別用5 mL色譜純甲醇進行活化。分別在準備好的5種固相萃取柱上上樣5 mL 10 μg/L的氯酸鹽和高氯酸鹽混合標準溶液,收集全部流出液與未過柱的10 μg/L混合標準溶液一同上機檢測,實驗結(jié)果如表3所示。

表 3 經(jīng)5種固相萃取柱凈化后4種化合物的回收率

實驗結(jié)果顯示,PRiME HLB固相萃取柱和C18固相萃取柱的回收率相近,優(yōu)于OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱和石墨化炭黑Carb固相萃取柱,PSA固相萃取柱的回收率最差。由于PRiME HLB固相萃取柱不用活化,具有操作時間短、節(jié)省試劑的優(yōu)點,本方法最終選取PRiME HLB固相萃取柱為凈化柱。

2.3.3提取溶劑的選擇

稱取2 g奶粉樣品。氯酸鹽和高氯酸鹽的添加量分別為60和30 μg/kg。分別選用超純水-甲醇(1∶2, v/v)、超純水-乙腈(1∶2, v/v)、0.1%甲酸水溶液-甲醇(1∶2, v/v)、0.1%甲酸水溶液-乙腈(1∶2, v/v)、0.05%氨水溶液-甲醇(1∶2, v/v)、0.05%氨水溶液-乙腈(1∶2, v/v)進行提取,采用PRiME HLB固相萃取柱凈化,計算氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率(見圖2)。實驗結(jié)果表明,使用0.1%甲酸水溶液-乙腈的提取凈化效果最優(yōu),對氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率穩(wěn)定(98.06%～100.69%和103.69%～105.86%)。0.1%甲酸水溶液-甲醇、超純水-乙腈、0.05%氨水溶液-乙腈、超純水-甲醇進行提取時,存在一定雜質(zhì)干擾,提取液會出現(xiàn)混濁現(xiàn)象,0.05%氨水溶液-甲醇的提取液無法過柱凈化。

奶粉中含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等有機成分。乙腈去除蛋白質(zhì)的能力優(yōu)于甲醇。相比其他試劑,乙腈-水體系提取出來的脂肪相對較少,而酸性條件有利于蛋白質(zhì)的沉淀。因此,本方法選擇用5 mL 0.1%甲酸水溶液提取20 min后,加10 mL乙腈測定蛋白質(zhì)。

圖 2 不同提取溶液對氯酸鹽和高氯酸鹽回收率的影響Fig. 2 Effect of the different extraction solutions on the recoveries of chlorate and perchlorateFA: formic acid.

2.4 基質(zhì)效應

采用標準曲線比較法[7],對奶粉前處理方法的基質(zhì)效應進行評估。標準曲線A:用20 mmol/L乙酸銨-甲醇溶液(1∶2, v/v)稀釋,制成含氯酸鹽依次為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/L,高氯酸鹽依次為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的混合標準工作液。標準曲線B:用不含氯酸鹽和高氯酸鹽的奶粉樣品,按照1.3節(jié)樣品前處理方法進行提取凈化,用凈化液配制同樣質(zhì)量濃度的系列標準曲線。由基質(zhì)效應(ME,%)=斜率B曲線/斜率A曲線×100%計算,得到氯酸鹽的ME為63%,高氯酸鹽的ME為83%。結(jié)果顯示,奶粉樣品的基質(zhì)效應為基質(zhì)抑制,因此采用外標法定量存在誤差。采用同位素內(nèi)標法,同位素內(nèi)標與待測目標物的色譜和質(zhì)譜行為相近,可以補償氯酸鹽和高氯酸鹽因基質(zhì)效應影響引起的響應變化,以解決因基質(zhì)效應造成定量不準的問題[3,9,21]。

2.5 方法學驗證

2.5.1線性范圍和定量限

將不同質(zhì)量濃度的氯酸鹽和高氯酸鹽標準溶液按本方法確定的條件進行測定,以氯酸鹽和高氯酸鹽及其對應同位素內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標,以質(zhì)量濃度比值為橫坐標,繪制標準曲線。結(jié)果表明,氯酸鹽和高氯酸鹽在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關系,線性相關系數(shù)(r2)均大于0.999(見表4)。以10倍信噪比(S/N)確定氯酸鹽的定量限,為15.0 μg/kg,高氯酸鹽的定量限為7.5 μg/kg。

表 4 氯酸鹽和高氯酸鹽的回歸方程、相關系數(shù)和定量限

ND: not detected.

2.5.2回收率和精密度

選取氯酸鹽和高氯酸鹽污染水平較低的奶粉樣品,參照GB/T 27404-2008[22]在2倍、4倍、8倍方法定量限水平,做加標回收試驗和精密度試驗。其中氯酸鹽的添加水平為30.0、60.0、120.0 μg/kg,高氯酸鹽的添加水平為15.0、30.0、60.0 μg/kg,每個水平重復測定6次,測得的回收率和精密度見表5。結(jié)果顯示,方法的回收率為89.24%～107.85%,相對標準偏差為3.15%～10.42%,符合GB/T 27404-2008標準的要求。實驗空白、樣品和加標樣品的MRM色譜圖見圖3。

表 5 氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率及精密度(n=6)

2.6 實際樣品的測定

用本文建立的方法對實際奶粉樣品進行檢測。10批奶粉樣品的檢測結(jié)果如表6所示。氯酸鹽檢出5批,含量范圍在19.62～85.25 μg/kg之間。大多數(shù)樣品中,高氯酸鹽均有不同程度的檢出,其中6批樣品的高氯酸鹽含量超出方法定量限7.5 μg/kg,含量范圍為10.34～28.79 μg/kg。

圖 3 實驗空白、樣品和加標樣品的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of the blank, a sample, and a spiked sampleSpiked levels: chlorate, 60.0 μg/kg; perchlorate, 30.0 μg/kg.

表 6 奶粉樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定結(jié)果

ND: not detected.

3 結(jié)論

本研究建立了奶粉樣品經(jīng)提取、固相萃取柱凈化,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析的檢測方法。該方法操作簡單、快速,重現(xiàn)性好,定量準確,能滿足奶粉樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽同時檢測的要求,能為我國奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留情況的監(jiān)控提供技術(shù)支撐。