兩步液液萃取-固相萃取凈化結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中11種磺胺類獸藥殘留

劉培勇, 張 惠, 米之金, 張良成, 張光仁

(達(dá)州市食品藥品檢驗(yàn)所, 四川 達(dá)州 635000)

磺胺類(sulfonamides, SAs)藥物是一類用于治療細(xì)菌性感染疾病的廣譜抗菌藥,母核為對氨基苯磺酰胺,由此衍生出的化合物種類多達(dá)數(shù)千種,常用的有幾十種,因具有抗菌譜廣、高效、低毒、價(jià)格低廉等[1-3]特點(diǎn),在臨床及獸藥領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[3-5],從而存在藥物濫用、誤用及不遵守休藥期規(guī)定等現(xiàn)象,造成很多動物源食品(水產(chǎn)品)中殘存磺胺類藥物及代謝產(chǎn)物;當(dāng)這些代謝物在人體內(nèi)積累到一定濃度時(shí)就會對人體的機(jī)能產(chǎn)生損害,破壞人體的造血系統(tǒng),造成溶血性貧血,磺胺二甲基嘧啶等還存在潛在的致癌性[2]。據(jù)Baran等[6]報(bào)道丹麥在2009年每kg豬肉中磺胺類藥物的平均使用量為4.82 mg,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,磺胺類獸藥的使用量在所有肉類食品中處于中等偏上的水平,中國是豬肉消費(fèi)大國,因此,加大豬肉中磺胺類獸藥殘留的日常監(jiān)測十分必要。

隨著國內(nèi)外檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,目前磺胺類藥物的前處理和檢測手段越來越多,前處理手段除了傳統(tǒng)的液液萃取外,近年來出現(xiàn)了許多新的前處理方法,如固相萃取(SPE)法、超聲輔助分散液液微萃取法[7]、磁性多壁碳納米管法[8,9]、硅膠固載離子液體-基質(zhì)固相分散法[10]、可視化蛋白質(zhì)芯片法[11]、QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法[12],宋偉等[9]利用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化劑(EMR)結(jié)合石墨化磁性多壁碳納米管作為QuEChERS法吸附劑對克氏鰲蝦進(jìn)行前處理,測定了39種磺胺及喹諾酮類獸藥殘留,該方法為高脂肪含量的樣品基質(zhì)提供了一種新的方法,并且取得了較好的凈化效果。液液萃取-固相萃取法是目前應(yīng)用最廣的前處理方法,通過不同類型的SPE小柱基本能夠達(dá)到富集、凈化的目的,Economou等[13]、劉鐵錚等[14]、Wang等[15]采用不同SPE小柱分別對蜂蜜、雞蛋和雞肉基質(zhì)中的磺胺做了加標(biāo)回收試驗(yàn),平均回收率都在70%～106%?；前返臋z測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[17,18]、毛細(xì)管電泳法[19]、酶聯(lián)免疫法[20]。LC-MS/MS由于其靈敏度和選擇性都高于其他檢測器,目前被認(rèn)為是效果最好的檢測方法,其他方法都因其特異性強(qiáng)、適用范圍窄且不適用于多類獸藥殘留的同時(shí)檢測[21]而受到很大限制。

但是目前采用LC-MS/MS測定磺胺類獸藥殘留最主要的缺點(diǎn)仍然是提取物脂肪、蛋白質(zhì)含量高,基質(zhì)效應(yīng)明顯,尤其是一些新的方法,如QuEChERS法,在實(shí)現(xiàn)快速,高通量檢測的同時(shí),固然節(jié)約了不少時(shí)間,但對于蛋白質(zhì)含量高和基質(zhì)更為復(fù)雜的樣品如肉類、動物肝臟等的應(yīng)用還十分有限,共萃取物仍然具有脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量高的缺點(diǎn),會嚴(yán)重污染儀器,大大降低設(shè)備的靈敏度和使用壽命。液液萃取是一種最經(jīng)典也是最成熟有效的提取方法,但是目前大多數(shù)都是采用單一溶劑多次提取或者極性相近的混合溶劑一步提取,采用極性相差較大的兩種有機(jī)溶劑分兩步提取在國內(nèi)外仍然鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了采用極性較強(qiáng)的乙酸乙酯、乙腈作為第一步提取溶劑,極性較弱的丙酮、二氯甲烷作為第二步提取溶劑,分兩步液液萃取磺胺的提取條件,并結(jié)合SPE凈化豬肉樣品,減少了基質(zhì)效應(yīng),為采用HPLC-MS/MS測定動物源性食品中磺胺類藥物提供更加成熟有效的檢測手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6410A高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源(ESI)(美國安捷倫科技有限公司); Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司); TGL20M湘立高速冷凍離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司); QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x(天津旗美科技有限公司); GX-274 ASPEC全自動固相萃取儀(美國吉爾森公司); DMT-2500多管旋渦混合儀(北京中興偉業(yè)儀器有限公司); BUCHI GL45 Multivapor P-6濃縮蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司); Oasis MCX固相萃取小柱, 60 mg, 3 mL(上海安譜有限公司)。

磺胺醋酰(sulfacetamide, SA)、磺胺嘧啶(sulfadiazine, SD)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SM1)、磺胺二甲嘧啶(sulfamerazine, SM2)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole, SMT2)、磺胺氯噠嗪(sulfachloropyridazine, SCP)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine, SMM)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)、磺胺異惡唑(sulfisoxazole, SIZ)、磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline, SQX),均購于美國Sigma公司,純度≥99.6%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮,均為色譜純(德國Merck公司);無水硫酸鈉(用前需550 ℃灼燒6 h)、正己烷、正丙醇,均為分析純(成都市科隆化學(xué)有限公司); C18粉末(50 μm, 6 nm)(上海安譜有限公司);超純水(實(shí)驗(yàn)用一級水);實(shí)驗(yàn)用豬肉樣品來源于監(jiān)督抽樣樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取11種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品各0.002 5 g,用乙腈溶解并定容至25 mL,配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(磺胺喹惡啉需要加入0.1%(v/v,下同)甲酸助溶),置于4 ℃冰箱中避光保存。再精密吸取各儲備液于同一容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配成質(zhì)量濃度為1 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。

稱取5份空白豬肉樣品,按照既定的提取方法制備空白基質(zhì)溶液,用混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液加不同體積的空白基質(zhì)溶液配成20、50、100、200、400 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

準(zhǔn)確稱取5.00 g(精確到0.01 g)均質(zhì)樣品置于50 mL離心管中,加入5 g經(jīng)灼燒的無水硫酸鈉和6 g C18粉末,混合均勻,加入20 mL含2%甲酸的乙酸乙酯,渦旋振蕩1 min,超聲提取10 min, 8 000 r/min離心5 min,將有機(jī)層移入濃縮瓶中,殘?jiān)性偌尤?0 mL丙酮重復(fù)提取一次,合并轉(zhuǎn)入濃縮瓶中,加入10 mL正丙醇,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴45 ℃減壓濃縮至近干,氮?dú)饬鞔蹈?準(zhǔn)確加入4 mL乙腈-水(1∶1, v/v)分兩次洗滌濃縮瓶,將洗滌液轉(zhuǎn)入氮吹管中,加入2 mL乙腈飽和過的正己烷溶液,渦旋振蕩1 min,靜置分層,棄去上層正己烷溶液,下層溶液待凈化。

1.3.2凈化

將MCX固相萃取小柱安裝于全自動固相萃取儀中,先用3 mL甲醇和3 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液活化小柱,將提取液倒入小柱中,然后分別用2 mL 0.1 mol/L鹽酸和2 mL水-甲醇-乙腈(55∶25∶20, v/v/v)洗滌小柱,用2 mL水-甲醇-乙腈-氨水(75∶10∶10∶5, v/v/v/v)洗脫藥物,收集洗脫液于45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?用乙腈-水(1∶1, v/v)定容至1 mL,過0.22 μm微孔濾膜后,供LC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Thermo Accucore C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。流動相:A為0.1%(v/v,下同)甲酸水溶液,B為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件:0～3 min,B由10%升至20%; 3～8 min,B由20%升至35%; 8～11 min,B由35%升至95%; 11～13 min, B由95%降至10%,保持2 min;分析時(shí)間:23 min。

1.4.2質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;離子源溫度:100 ℃;檢測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細(xì)管電壓:4 000 V;脫溶劑溫度:350 ℃;脫溶劑氣流量:10 L/min;其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 11種化合物的保留時(shí)間、監(jiān)測離子對、毛細(xì)管出口電壓及碰撞能量

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 兩步液液萃取條件的優(yōu)化

磺胺類屬于酸堿兩性化合物,不溶于非極性溶劑,但由于磺胺母體磺酰氨基的氮原子上含有兩個(gè)H,堿性較強(qiáng),在酸性水溶液中,磺胺類呈電離狀態(tài),溶解度也隨之增大,因此在前處理過程中向提取液中加入適量甲酸以增加磺胺類化合物的溶解性,從而提高萃取效率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甲酸含量過低和過高都會導(dǎo)致磺胺的提取效率下降,一般添加量在1%～2%時(shí)回收率普遍較高,故本實(shí)驗(yàn)選擇添加2%的甲酸。大部分研究僅采用單一溶劑或者混合溶劑一次提取,最常用的溶劑就是極性較強(qiáng)的乙腈、乙酸乙酯、水等。本實(shí)驗(yàn)研究了采用極性較強(qiáng)的乙酸乙酯、乙腈作為第一步萃取溶劑,極性較弱的二氯甲烷、丙酮作為第二步萃取溶劑,同時(shí)比較了單純采用乙腈和乙酸乙酯作為萃取溶劑的提取效率,發(fā)現(xiàn)在第一步萃取劑選擇上,乙酸乙酯比乙腈對磺胺類化合物的選擇性要好,提取效率更高,同時(shí),在第二步萃取溶劑選擇上,發(fā)現(xiàn)丙酮能顯著提高萃取效率,因此在乙酸乙酯提取后,再用等體積的丙酮提取,萃取效率提高了11.1%～66%,如圖1所示。這可能是因?yàn)楸苡行茐腟As中氨基與基質(zhì)蛋白質(zhì)的氫鍵作用。故選擇先用乙酸乙酯溶液(含2%甲酸)萃取,再用丙酮溶液萃取。萃取溶劑的體積也會對提取效率產(chǎn)生不同程度的影響,本實(shí)驗(yàn)在萃取總體積40 mL不變的條件下,對乙酸乙酯和丙酮的添加體積(1∶1、1∶2、2∶1)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,乙酸乙酯和丙酮的添加體積為1∶1(即分別添加20 mL)時(shí),11種磺胺類藥物的回收率均在80%～120%之間(見圖1),回收率高,提取效果好。說明丙酮的量顯著影響磺胺與基質(zhì)蛋白質(zhì)相結(jié)合的氫鍵作用力。體積不足,導(dǎo)致不能完全破壞磺胺分子與基質(zhì)蛋白質(zhì)的結(jié)合氫鍵,體積過大,有可能會使更多基質(zhì)蛋白質(zhì)變性折疊,導(dǎo)致部分磺胺分子被蛋白質(zhì)包埋。故本實(shí)驗(yàn)最終選擇先用20 mL含2%甲酸的乙酸乙酯進(jìn)行萃取,再用20 mL丙酮進(jìn)行第二次萃取作為兩步液液萃取的條件。

圖 1 不同提取試劑、提取體積對磺胺類化合物回收率的影響Fig. 1 Effect of different extraction solvents and volumes on the recoveries of sulfonamides

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

由于SAs在酸性條件下溶解性及穩(wěn)定性較高,因此在流動相中加入甲酸;同時(shí),甲酸有助于目標(biāo)化合物在正離子模式條件下電離,提高目標(biāo)物的響應(yīng)值。試驗(yàn)以0.1%甲酸水溶液作為流動相的A相,考察了B相分別為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇時(shí),采用梯度洗脫程序?qū)前奉愃幬锏姆蛛x情況。結(jié)果表明:采用與定容溶液一致的甲酸乙腈溶液作為流動相的B相時(shí),可以獲得尖銳對稱的峰形,同時(shí)響應(yīng)值也更高。圖2為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇作為B相時(shí)50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖(TIC)。采用乙腈時(shí)靈敏度比甲醇要高，峰形更好,故選擇0.1%甲酸乙腈為流動相的B相。圖3為50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM提取色譜圖。

2.2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用正離子模式對11種磺胺類化合物進(jìn)行分析,分子離子峰均為[M-H]+形式。為提高目標(biāo)化合物的離子化效率及靈敏度,對質(zhì)譜各參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。采用不接色譜柱直接進(jìn)樣,分別進(jìn)行一級母離子掃描和二級子離子掃描,通過一級母離子掃描進(jìn)一步確定各個(gè)化合物的母離子及去簇電壓(fragmentor)值,通過二級子離子掃描進(jìn)一步確定各個(gè)化合物至少兩種響應(yīng)值最高的子離子及每種子離子所需最佳的碰撞能(CE)。最后選定響應(yīng)值最強(qiáng)、干擾最小的2個(gè)子離子作為定性離子和定量離子。通過對11種磺胺類化合物的二級子離子掃描發(fā)現(xiàn),磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶的兩個(gè)特征離子都一樣,分別為m/z156、m/z108,可能因?yàn)樗谢前奉惢衔锬负司鶠閷Π被交酋０?由于氨基的吸電子作用,使得苯環(huán)本身對磺酸基的吸電子能力減弱,導(dǎo)致磺酸基鍵在質(zhì)譜碰撞能作用下容易斷裂,得到兩種比較固定的特征離子,這樣只需對一兩種磺胺類化合物的子離子CE進(jìn)行優(yōu)化,其他跟這些子離子一樣的磺胺類化合物無需再進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行微調(diào)即可,這樣就大大縮短了子離子CE的優(yōu)化時(shí)間。子離子的優(yōu)化結(jié)果參數(shù)見表1。

圖 2 兩種B流動相條件下磺胺類藥物的總離子流色譜圖 (50 μg/L)Fig. 2 Total ion current chromatograms of sulfonamides with two B mobile phases (50 μg/L)

圖 3 11種磺胺類藥物的MRM提取離子色譜圖(50 μg/L)Fig. 3 MRM extracted ion chromatograms of the 11 sulfonamide drugs (50 μg/L)

圖 4 SPE凈化對各目標(biāo)化合物的基質(zhì)抑制率的影響Fig. 4 Effect of SPE purification on matrix inhibition rate for the target compounds

2.2.3基質(zhì)效應(yīng)(ME)

磺胺類藥物在質(zhì)譜上的離子抑制效應(yīng)很強(qiáng),且基質(zhì)對峰形干擾很大。本實(shí)驗(yàn)通過測定基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)中各目標(biāo)化合物的峰面積,采用兩者峰面積差值的絕對值與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液各目標(biāo)化合物峰面積的比值來計(jì)算基質(zhì)抑制率,從而評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[22]。比較了采用SPE小柱凈化與不凈化的基質(zhì)抑制率,可以發(fā)現(xiàn),經(jīng)過SPE小柱凈化后的樣品基質(zhì)抑制率要明顯低于未經(jīng)凈化的(見圖4)。SA在未經(jīng)固相萃取小柱凈化的情況下基質(zhì)抑制率甚至高達(dá)60%,凈化后降至30%左右,而SQX卻基本不受基質(zhì)效應(yīng)的影響。目前降低基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線、改進(jìn)前處理技術(shù)、優(yōu)化色譜條件以及控制流速等。所以,本實(shí)驗(yàn)通過改進(jìn)前處理?xiàng)l件,以兩步液液萃取結(jié)合固相萃取凈化方式降低基質(zhì)干擾,同時(shí)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以盡量消除基質(zhì)干擾帶來的誤差。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1線性范圍、線性方程、檢出限和定量限

精密吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白基質(zhì)溶液分別配制成質(zhì)量濃度為20、50、100、200、400 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作系列,按本方法確定的條件分別進(jìn)樣分析,以目標(biāo)化合物的峰面積對其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,在20～400 μg/L范圍內(nèi),11種磺胺類藥物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.99)。在陰性樣品中加標(biāo)測定,以S/N≥3對應(yīng)的最低加標(biāo)水平作為方法檢出限,S/N≥10對應(yīng)的最低加標(biāo)水平作為定量限,結(jié)果見表2。

表 2 11種磺胺類藥物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.3.2加標(biāo)回收率和精密度

本文對11種磺胺類獸藥進(jìn)行了3個(gè)添加水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)添加水平做6次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算11種磺胺類藥物的3個(gè)不同水平的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。由表3可以看出,11種磺胺類獸藥的平均加標(biāo)回收率為79.3%～105.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～11.6%,滿足獸藥殘留定性定量分析的要求。

2.4 實(shí)際樣品分析

采用本方法對2018年度抽樣的50批次鮮豬肉進(jìn)行檢測,其中2批次檢出磺胺二甲基嘧啶,1批次檢出磺胺間甲氧嘧啶,含量分別為28 μg/kg、55 μg/kg和78 μg/kg。陽性檢出率為6%,雖然滿足了農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定所有動物肌肉所含磺胺總量不得超過100 μg/kg的規(guī)定,但是也說明我國獸藥濫用情況還是比較嚴(yán)重,人類長期食用還是會對身體健康造成一定的影響。

表 3 11種磺胺類藥物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率及RSD (n=6)

3 結(jié)論

本文利用丙酮能有效破壞磺胺分子中氨基與基質(zhì)蛋白質(zhì)的氫鍵作用,建立了一種通過采用兩種提取劑分兩步液液萃取對豬肉基質(zhì)中11種磺胺類藥物的HPLC-MS/MS分析方法,克服了采用單一提取劑提取效率低的特點(diǎn),同時(shí)結(jié)合固相萃取方法凈化,進(jìn)一步減少了目標(biāo)物質(zhì)中的雜質(zhì)干擾,降低了基質(zhì)效應(yīng)和對儀器的影響,提高了檢測的靈敏度,對改進(jìn)豬肉中磺胺類獸藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法的前處理技術(shù)有較高的參考價(jià)值。