蘿卜纓有效成分含量及抗氧化活性研究

段樹成，管桂林，曲珊珊，彭新顏，柳全文，金成武*

(1.魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109)

蘿卜屬于十字花科蘿卜屬，是我國重要的蔬菜作物之一[1]。目前我國蘿卜的主要食用部位是蘿卜根部，通常，蘿卜纓在收獲蘿卜時(shí)被丟棄在田間地頭，只有很少一部分被用作調(diào)味品來腌制泡菜、咸菜等[2]。蘿卜纓性味甘苦平，富含精油、多種維生素和抗病毒成分，其蛋白質(zhì)、維生素及微量元素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蘿卜根部，具有保肝、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、保護(hù)心血管活性等功能[3,4]。在韓國，蘿卜纓資源作為調(diào)味品得到了廣泛的研究與發(fā)展，將蘿卜纓粉末添加到面粉中對(duì)于松糕或者其他傳統(tǒng)糕點(diǎn)，可使其具有良好風(fēng)味，并且明顯提高糕點(diǎn)的品質(zhì)[5,6]。

本研究結(jié)合蘿卜纓葉柄粗大、咀嚼困難、不易消化的現(xiàn)實(shí)問題，對(duì)蘿卜纓葉柄和葉片有效成分含量及抗氧化活性差異進(jìn)行研究，旨在改善蘿卜纓浪費(fèi)嚴(yán)重，利用率低的現(xiàn)狀，為蘿卜纓資源在調(diào)味品中的合理發(fā)展提供了理論參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)使用的樣品為青蘿卜纓，品種為小纓蘿卜(RaphanussativusL.)，購于煙臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

無水乙醇、95%乙醇、甲醇、氯化亞鐵、乙酸鉀、過硫酸鉀、三氯化鋁、鐵氰化鉀、無水碳酸鈉、三氯化鐵、福林酚、沒食子酸、槲皮素：均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

主要設(shè)備的名稱與生產(chǎn)廠家見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與生產(chǎn)廠家Table 1 Experimental equipments and manufacturers

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理和提取物制備

2.1.1 樣品前處理2.1.1.1 蘿卜纓清洗后干燥

將蘿卜纓清洗干凈，放入65 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥直至重量不變。

2.1.1.2 樣品分離、粉碎

將干燥后的蘿卜纓的葉柄和葉片分離，分別粉碎，裝入密封容器中備用。

2.1.2 樣品提取物制備2.1.2.1 樣品提取

分別取一定量的葉柄和葉片粉末，加入80%的乙醇溶液，用超聲波清洗機(jī)輔助多次提取至濾液變澄清為止。

2.1.2.2 樣品濃縮與干燥

用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，直到濃縮成濃稠狀半固體物。將濃縮后的葉柄和葉片樣品放入-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍12 h，取出后放入真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，干燥品低溫保藏備用。

2.2 有效成分含量測定

2.2.1 總酚含量測定

采用福林酚法進(jìn)行樣品總多酚含量測定[7]。配制不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和葉柄、葉片樣品反應(yīng)液，依次加入反應(yīng)試劑。為減小誤差，實(shí)驗(yàn)時(shí)做3組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。以沒食子酸的濃度為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(y=0.0121x-0.0047，R2=0.9998)。

2.2.2 總黃酮含量測定

吸取蒸餾水2.8 mL、95%的乙醇1.5 mL，再加入各槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品反應(yīng)液0.5 mL、10% AlCl3溶液0.1 mL和1 mol/L的乙酸鉀溶液0.1 mL，混合均勻后在黑暗環(huán)境下反應(yīng)40 min。在415 nm波長下測量其吸光度。為減小誤差，實(shí)驗(yàn)時(shí)做3組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。以槲皮素的濃度為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0068x+0.0036，R2=0.9996)。

2.2.3 HPLC分析2.2.3.1 Shimadzu 20A 型HPLC

由在線脫氣機(jī)(DGU-20A5)、四元輸液泵(LC-20AT)、進(jìn)樣器(SIL-20A)、紫外檢測器(SPD-20A)、柱恒溫控制箱(CBM-20A)組成。

2.2.3.2 HPLC分析條件

流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜柱：Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A：0.1%三氯乙酸的水溶液；B：乙腈；梯度洗脫程序：0～15 min，10%～15% B；15～40 min，15%～30% B；40～55 min，30%～50% B；55～65 min，50%～75% B；65～70 min，75%～90% B；液相色譜使用濃度為10000 mg/L的樣品溶液，使用之前樣品用孔徑為0.22 μm針筒式濾膜過濾器過濾。

2.3 抗氧化活性測定

在抗氧化活性測定的實(shí)驗(yàn)中，均使用濃度為1000 mg/L的樣品溶液。為減小誤差，實(shí)驗(yàn)時(shí)均做3組平行實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

分別取1 mL的葉柄提取液和葉片提取液于試管中，取1 mL 80%的甲醇溶液代替樣品提取物作為對(duì)照。然后向所有試管中加入3 mL濃度為0.15 mmol/L的DPPH溶液。暗反應(yīng)30 min測定各溶液在517 nm波長下的吸光度。對(duì)于樣品的DPPH自由基清除能力用清除率表示：

DPPH自由基清除率(%)=(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照×100%。

式中：A對(duì)照為80%的甲醇溶液與DPPH混合溶液的吸光度；A樣品為各樣品提取液與DPPH混合溶液的吸光度。

2.3.2 ABTS自由基清除能力測定[8]

分別吸取葉柄和葉片溶液0.5 mL于不同的試管中，加入5 mL經(jīng)稀釋后A734 nm=0.70±0.02的ABTS溶液混合均勻，對(duì)照組用80%的甲醇溶液代替樣品，其他條件不變。室溫環(huán)境下靜置反應(yīng)10 min，在732 nm波長下測各樣品的吸光度。對(duì)于樣品的ABTS自由基清除能力用清除率表示：

ABTS自由基清除率(%)=(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照×100%。

式中：A對(duì)照為80%的甲醇溶液與ABTS混合溶液的吸光度；A樣品為各樣品提取液與ABTS混合溶液的吸光度。

2.3.3 鐵離子螯合能力測定

分別吸取2 mL葉柄和葉片樣品提取液于試管中，以蒸餾水作為空白組。依次加0.1 mL濃度為2 mmol/L的氯化亞鐵、0.4 mL濃度為5 mmol/L的Ferrozine溶液、0.4 mL蒸餾水，用漩渦混合儀混勻。在黑暗環(huán)境下反應(yīng)10 min后用分光光度計(jì)進(jìn)行測定，波長設(shè)定為562 nm。吸光度值越小，表示鐵離子螯合能力越強(qiáng)。樣品對(duì)鐵離子的螯合能力用螯合率表示：

螯合率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

式中：A0為水與其他試劑混合溶液的吸光度；A1為各樣品提取液和其他試劑混合溶液的吸光度。

2.3.4 還原能力測定

采用普魯士藍(lán)法測定蘿卜纓不同部位的還原能力[9]。

3 結(jié)果

3.1 蘿卜纓不同部位總酚含量的差異

在干燥的蘿卜葉片樣品中，含有6.54 mg/g總酚類物質(zhì)；蘿卜葉柄樣品中，含有3.40 mg/g總酚類物質(zhì)，見圖1。蘿卜葉片多酚類物質(zhì)含量約為葉柄的1.9倍。

圖1 蘿卜纓不同部位干物質(zhì)中總多酚含量Fig.1 The content of total polyphenols in different parts of radish leaves

3.2 蘿卜纓不同部位總黃酮含量的差異

圖2 蘿卜纓不同部位干物質(zhì)中總黃酮含量Fig.2 The content of total flavonoids in different parts of radish leaves

由圖2可知，蘿卜纓不同部位的總黃酮含量有較大的差異。每克蘿卜葉片干物質(zhì)中，總黃酮的含量約為5.13 mg；蘿卜葉柄干物質(zhì)中總酮物質(zhì)的含量為0.52 mg/g。蘿卜纓中的總黃酮主要集中在葉片部位,含量為葉柄的10倍之多。

3.3 蘿卜纓不同部位HPLC 分析對(duì)比

圖3 蘿卜纓不同部位HPLC分析 Fig.3 HPLC analysis of different parts of radish leaves

在圖3高效液相色譜圖中，出峰時(shí)間與物質(zhì)的種類有關(guān)，峰面積與物質(zhì)的含量成正比，通過高效液相色譜分析結(jié)果可以看出，蘿卜纓葉片和葉柄的較大峰的出峰時(shí)間基本相同，為14.5，19.2，23.5，25.5，27.5，29.5 min等。換言之，在280 nm波長處蘿卜葉片和葉柄中的化合物種類總體相同，但含量差別較大，同種物質(zhì)在蘿卜葉片中的含量比在蘿卜葉柄中的含量高。猜測這可能會(huì)導(dǎo)致葉柄和葉片的抗氧化活性的差異，且葉片的抗氧化能力要高于葉柄。

3.4 抗氧化活性分析

3.4.1 蘿卜纓不同部位DPPH自由基清除能力的差異

圖4 蘿卜纓不同部位DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging rate in different parts of radish leaves

由圖4可知，蘿卜葉柄和葉片的DPPH自由基清除能力相差非常大，蘿卜葉片的DPPH自由基清除率為62.34%，蘿卜葉柄的DPPH自由基清除率僅為1.34%，其結(jié)果低于蘿卜葉片近47倍。所以，蘿卜纓中具有DPPH自由基清除能力的有效物質(zhì)主要集中在葉片部位，且清除能力較高。

3.4.2 蘿卜纓不同部位ABTS自由基清除能力的差異

由圖5可知，蘿卜葉片的ABTS自由基清除率超過50%，而蘿卜葉柄的ABTS自由基清除率不到4%，不及蘿卜葉片的1/10，可見蘿卜葉片部分具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

圖5 蘿卜纓不同部位ABTS自由基清除率Fig.5 ABTS radical scavenging rate in different parts of radish leaves

3.4.3 蘿卜纓不同部位鐵離子螯合能力的差異

圖6 蘿卜纓不同部位鐵離子螯合能力Fig.6 The chelating ability of iron ions in different parts of radish leaves

由圖6可知，蘿卜葉柄的鐵離子螯合率為44.41%，葉片的鐵離子螯合率為89.54%。蘿卜葉片的鐵離子螯合能力比較高，其鐵離子螯合率是葉柄的2倍多，而蘿卜葉柄的鐵離子螯合能力不突出。

3.4.4 蘿卜纓不同部位還原能力的差異

圖7 蘿卜纓不同部位還原能力Fig.7 The reducmg ability in different parts of radish leaves

由圖7可知，蘿卜葉柄和葉片都有一定的還原能力。葉柄在700 nm條件下的吸光度為0.101，葉片為0.244。蘿卜葉柄和葉片相比較，葉片的還原能力高于葉柄的還原能力，是葉柄的2倍多。

4 討論與結(jié)論

蘿卜作為家喻戶曉的蔬菜，已得到廣泛種植與培育，而蘿卜纓資源常常被丟棄。通過本研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜葉片、葉柄中總酚含量分別為6.54，3.4 mg/g，與Park等[10]研究中蘿卜根的總酚含量0.24～0.27 mg/g、青蘿卜的總酚含量0.40 mg/g相比可知，蘿卜葉片和葉柄均比蘿卜根、青蘿卜的總酚含量高出數(shù)十倍，尤其是葉片中含量高達(dá)蘿卜根的27倍，且蘿卜葉片多酚含量約為蘿卜葉柄的1.9倍之多。同時(shí)，與張皓月[11]研究發(fā)現(xiàn)的青蘿卜根皮中黃酮含量0.85 mg/g、根肉中0.28 mg/g相比，蘿卜葉片中黃酮含量約是根肉中的18倍，而蘿卜葉柄中總黃酮含量為0.52 mg/g，介于根皮、根肉二者之間。因此，蘿卜纓比蘿卜根含有更多的有效成分，尤其是軟而嫩的葉片部位含量最高，對(duì)蘿卜葉片、葉柄的分離利用能獲取更多的營養(yǎng)成分。通過進(jìn)一步對(duì)蘿卜葉片和葉柄的抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)葉片具有更高的抗氧化活性，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、鐵離子螯合能力以及還原能力等均顯著優(yōu)于葉柄。葉片的DPPH自由基清除率約為葉柄的46倍；ABTS自由基清除能力為葉柄的15倍之多。蘿卜纓的抗氧化活性遠(yuǎn)高于蘿卜根，與黑胡椒、山楂等物質(zhì)接近[12-14]?？梢姡}卜葉片抗氧化活性較高，具有極高的食用價(jià)值。多酚、黃酮類物質(zhì)對(duì)氧化損傷有重要保護(hù)作用，同時(shí)大多數(shù)與抗氧化生理活性相關(guān)的化合物在280 nm波長處有較強(qiáng)的吸收[15-17]。通過該波長下進(jìn)行的高效液相色譜分析結(jié)果可以看出，蘿卜葉片與葉柄化合物種類相近，但同種物質(zhì)在蘿卜葉片中的含量遠(yuǎn)高于葉柄?？偟膩砜?，蘿卜葉片總多酚、總黃酮含量遠(yuǎn)高于葉柄，抗氧化活性也呈現(xiàn)同種表現(xiàn)，這與Ziani等、Rafaela等[18]的研究中總黃酮、總多酚含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)的結(jié)果一致，從而證實(shí)了葉片多酚、黃酮類物質(zhì)含量高，使其抗氧化活性明顯優(yōu)于葉柄。

本研究為開發(fā)蘿卜纓資源的合理利用提供了理論基礎(chǔ)，為調(diào)味品產(chǎn)業(yè)發(fā)展注入了新的血液。因葉片的風(fēng)味優(yōu)于葉柄且具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，我們可以分而取之，為我們食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供更有價(jià)值的食用方法，在鮮食的同時(shí)，還可以將原料腌制成咸菜、泡菜等，更可以以風(fēng)味改善品質(zhì)的方式加入到面粉、飲料等產(chǎn)品中，給日常生活帶來新的體驗(yàn)。