OX40參與RSV氣道炎癥反應(yīng)中CD4+T細(xì)胞的增殖活化

崔玉琳， 白 松， 趙 娜， 范 越， 劉北星*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室,遼寧 沈陽 110122;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110032;3.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒急性下呼吸道感染的重要病原體[1-3], 大多數(shù)感染者表現(xiàn)為輕微的上呼吸道疾病，但仍有2%～5%的兒童發(fā)生嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎并且需要住院治療[4-6]。RSV感染導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而激發(fā)宿主免疫應(yīng)答發(fā)揮抗感染、清除病毒作用。研究表明，T細(xì)胞尤其是CD4+T細(xì)胞的活化及其氣道內(nèi)浸潤數(shù)量直接影響RSV誘導(dǎo)的氣道炎癥的嚴(yán)重程度[7-8]。T 細(xì)胞活化需要雙重信號的刺激：識別信號和刺激信號。OX40/OX40L是除 B7/CD28 和CD40/CD40L之外的另一對重要的協(xié)同刺激分子，在促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞的增殖、活化、記憶性 T 細(xì)胞的形成等方面具有重要作用[14]。 OX40(ACT35、CD134、TNFRSF4)屬TNFR超家族成員，是相對分子質(zhì)量約為47～51 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白。OX40主要表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞[15],另外CD8+T細(xì)胞[16]、活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[17]、自然殺傷細(xì)胞[18]、中性粒細(xì)胞[19]等也可少量表達(dá)。利用OX40基因敲除鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，缺少OX40導(dǎo)致小鼠體內(nèi)抗原特異性CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著減少，并降低其細(xì)胞因子分泌水平[20]。而在給予OX40激動型抗體的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CD4+T細(xì)胞的效應(yīng)顯著增強(qiáng)，而且記憶性CD4+T細(xì)胞也發(fā)生明顯的增殖[21],進(jìn)一步顯示了OX40在CD4+T細(xì)胞增殖與活化中的重要作用。但其是否參與RSV感染誘發(fā)的氣道炎癥中CD4+T細(xì)胞的增殖與活化，目前尚不清楚。本研究利用感染RSV的BALB/c鼠模型，通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠分選、Real-time RT-PCR、Elisa、Western Blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討在RSV感染導(dǎo)致BALB/c鼠氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，OX40在感染鼠CD4+T細(xì)胞增殖與活化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物、細(xì)胞株及病毒 動物：6～8周齡雌性BALB/c鼠，購自遼寧本溪長生生物技術(shù)有限公司，在中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物飼養(yǎng)室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)研究；細(xì)胞株：人喉癌上皮細(xì)胞系HEp-2為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株，用含10%FCS的RPMI-1640常規(guī)傳代培養(yǎng)；病毒：人類呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2)，HEp-2 細(xì)胞增殖病毒，30%蔗糖超速離心法分離病毒粒子，-80 ℃冰箱保存。病毒滴度用組織細(xì)胞半數(shù)感染量50% (50% tissue culture infections dose，TCID50) 表示。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自TaKaRa生物工程有限公司；IL-2、IFN-γ和IL-13 ELISA 試劑盒購自R&D Systems 公司；FITC anti-mouse CD4、Percp anti-mouse CD3購自Biolegend公司；APC anti-mouse CD134(OX40)購自eBioscience公司；CD4+T Cell Isolation Kit mouse 購自美天旎公司；polyclonal anti-OX40 Ab購自R&D Systems 公司；Rabbit anti-Goat IgG-HRP購自愛必信生物科技有限公司；GAPDH Rb pAb、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自萬類生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 CO2恒溫培養(yǎng)箱(316108-5121，Thermo)，臺式高速冷凍離心機(jī)(H2050R，湘儀離心機(jī)有限公司)，酶標(biāo)檢測儀(MoH 99-15，LM)，原位PCR儀(PTC-150TM，MJR),磁珠分選器(MiniMACS，Miltenyi)，流式細(xì)胞儀(FACSCelesta，BD)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500)，自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200)，高壓蒸汽滅菌器(MLS-3751L，Panasonic)，超低溫冰箱(SANYO)。

1.2 方法

1.2.1 感染模型 小鼠腹腔注射7.2%水合氯醛深度麻醉后，經(jīng)鼻黏膜感染20 μL含2×106TCID50RSV的病毒懸液，感染后第3、7天收集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.2 小鼠脾組織單細(xì)胞懸液制備 取脾組織，用兩端彎曲的針頭慢慢刮出脾細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，利用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞膜表面染色 將脾組織淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/mL。分別加入單克隆抗體(FITC-anti-mouse-CD4、PerCP-anti-mouse-CD3、AP-C-anti-mouse OX40)，避光冰浴30 min，流式細(xì)胞儀檢測分析OX40+CD4+T cells 細(xì)胞的百分比及數(shù)量。

1.2.4 CD4+T 細(xì)胞的分選和體外培養(yǎng) CD4+T Cell Isolation Kit mouse磁珠分選試劑盒無菌分選感染后3 d鼠脾CD4+T細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ 200 μL， 接種于96孔板中并加入OX40激動型抗體(1 μg/mL)，24 h后收取細(xì)胞及上清。

1.2.5 Real-time RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞因子 用RNAisoplus試劑盒提取CD4+T細(xì)胞的總RNA，PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明，采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞表面的OX40膜分子及細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13的mRNA表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)：OX40-F,5′-GGCCCTGCATTTGCTGTTCT-3′；OX40-R,5′-AGGATATGGGTTGTCCGTGC-3′；IFN-γ-F,5′-TATCTGGAGGAACTGGCAAA-3′；IFN-γ-R,5′-GGTGTGATTCAATGACGCTT-3′；IL-2-F,5′-CTGCGGCATGTTCTGGATTT-3′；IL-2-R,5′-GAAAGTCCACCACAGTTGCT-3′；IL-13-F,5′-AGCATGGTATGGAGTGTGGA-3′；IL-13-R,5′-TTGCAATTGGAGATGTTGGT-3′；β-actin-F,5′-GGTCATCACTATTGGCAACG-3′；β-actin-R,5′-TCCATACCCAAGAAGGAAGG-3′在ABI 7500系統(tǒng)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果表示為2-ΔΔCT(fold change)。

1.2.6 ELISA測定培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平 ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ和IL-13的含量。以 IL-13 細(xì)胞因子為例，大致實(shí)驗(yàn)流程：根據(jù)試劑盒說明書配制 IL-33 捕獲抗體，每孔 100 μL，4 ℃孵育過夜；配制洗液(即 0.05%Tween-20 的 1×PBS)，每孔 250 μL 洗液，洗板 3 次；配制封閉液，每孔 250 μL，室溫孵育 1h；洗板 3 次；按照試劑盒說明書配制 IL-13 標(biāo)準(zhǔn)品，每孔 100 μL，在余下的 ELISA 反應(yīng)孔內(nèi)加入 100 μL 待檢測培養(yǎng)上清原液，4 ℃孵育2 h；洗板 3 次；配制生物素標(biāo)記的抗 IL-13 的單克隆抗體(即檢測抗體)，每孔 100 μL，室溫孵育 2 h；洗板 3 次；配制親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)，每孔 100 μL，室溫孵育 20 mins；洗板 6 次；加入 TMB底物，每孔 100 μL，室溫避光反應(yīng) 20 mins；加反應(yīng)終止液，每孔 50 μL；酶標(biāo)儀讀板，將波長設(shè)定為 450 nm，記錄OD值；使用 SoftMax Pro7 軟件繪制各細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞因子濃度。

1.2.7 Western Blot 技術(shù)檢測蛋白分子 磁珠分選脾組織CD4+T細(xì)胞，預(yù)冷的無菌PBS溶液洗滌細(xì)胞2遍，加入200 μL含有PMSF的RIPA蛋白裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100),置于冰上裂解30 min。5×蛋白上樣緩沖液處理樣品，100 ℃加熱5 min以充分變性蛋白，SDS-聚丙烯酰胺(10%)凝膠電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，加入OX40 Ab(R&D Systems)，GAPDH Ab(Wanleibio)4 ℃孵育過夜，第2天與相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(Rabbit anti-Goat或Goat anti-Rabbit)結(jié)合室溫孵育1 h。最后，用自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200)檢測蛋白條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 RSV感染增加BALB/c鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞及OX40+CD4+T細(xì)胞數(shù)量

RSV經(jīng)鼻感染BALB/c鼠后不同時(shí)間點(diǎn)，收集標(biāo)本。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，RSV感染鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞及OX40+CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多。感染第3天其CD4+T細(xì)胞和OX40+CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)均達(dá)到峰值，之后雖有下降，但感染后第7天其數(shù)量仍然明顯高于對照組(圖1)。

2.2 RSV感染鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞的OX40 mRNA及蛋白表達(dá)水平

利用免疫磁珠分選BALB/c鼠脾CD4+T細(xì)胞，Real-time RT-PCR檢測其OX40 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSV感染導(dǎo)致脾CD4+T細(xì)胞OX40 mRNA水平顯著上升，感染后第3天最為顯著，之后雖有下降，但感染后第7天仍處于較高水平(圖2)。同時(shí)利用Western Blot 技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了RSV感染對脾CD4+T細(xì)胞OX40表達(dá)的影響。結(jié)果顯示感染后第3天其CD4+T細(xì)胞OX40蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，感染后第7天略有下降，但仍高于正常對照組(圖3A、B)，提示OX40可能參與CD4+T細(xì)胞的增殖與活化。

圖1 RSV感染鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞及OX40+CD4+T細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.1 The absolute number of CD4+T cells as well as OX40+CD4+T cells in the spleens of mice during RSV infectionA：脾組織CD4+T細(xì)胞總數(shù)；B：脾組織OX40+CD4+T細(xì)胞數(shù)量；C：脾組織OX40+CD4+T細(xì)胞流式散點(diǎn)圖；* 與正常對照組組相比,P<0.05；圖2、3同A: CD4+T cells in the spleen; B: OX40+CD4+T cells in the spleen; C: representative flow cytometry plots for OX40+CD4+T cells；* Significant difference (P<0.05, by ANOVA), compared with the normal control group，圖2、3同

圖2 RSV感染影響B(tài)ALB/c鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞OX40 mRNAs的表達(dá)Fig.2 The expression of OX40 mRNAs in splenic CD4+T cells during RSV infection

2.3 OX40介導(dǎo)RSV感染鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)

為明確OX40是否參與RSV感染鼠脾CD4+T細(xì)胞的活化，從感染第3天的BALB/c鼠脾組織中分選CD4+T細(xì)胞，接種于96孔板中并加入OX40激動型抗體anti-mouse OX40(1 μg/ mL)。體外培養(yǎng)24 h后收集CD4+T細(xì)胞并提取總RNA, 檢測其細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13 mRNA的表達(dá)水平。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，與CD4+T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比，加入OX40激動型抗體的CD4+T細(xì)胞組，其細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13mRNA表達(dá)水平均顯著增高(圖4A)，同時(shí)，檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示IL-13表達(dá)水平顯著增高(圖4B),證實(shí)OX40參與CD4+T細(xì)胞的活化及其細(xì)胞因子分泌。

圖3 RSV感染鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞OX40 蛋白表達(dá)水平的變化Fig.3 The expression of OX40 proteins in splenic CD4+T cells during RSV infection

圖4 OX40激動型抗體促進(jìn)RSV感染鼠脾CD4+T細(xì)胞IL-2、IFN-γ及IL-13 細(xì)胞因子表達(dá)Fig.4 Agonist anti-OX40 can enhance the cytokines expression of IL-2、IFN-γ and IL-13 in splenic CD4+T cells during RSV infectionA：脾組織CD4+T細(xì)胞IL-2、IFN-γ 和 IL-13 mRNAs表達(dá)量；B：脾組織CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ 和 IL-13表達(dá)量;* 與CD4+T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比,P<0.05A: IL-2，IFN-γ and IL-13 mRNAs expression in splenic CD4+T cells; B: IL-2，IFN-γ and IL-13 cytokines expression in splenic CD4+T cells culture supernatant；* Significant difference (P<0.05, by t tests), compared with the CD4+T cells cultured alone group

3 討 論

呼吸道合胞病毒是秋冬季節(jié)引起嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原體，幾乎所有兒童在2歲之前均感染過RSV[1-6]。Graham等[9]發(fā)現(xiàn)阻斷CD4+T細(xì)胞可明顯減輕呼吸道合胞病毒感染誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng)，另外Sealy等[10]發(fā)現(xiàn)：同回輸CD4+T細(xì)胞的RSV感染小鼠相比，缺少CD4+T細(xì)胞的RSV感染小鼠其體內(nèi)病毒清除時(shí)間明顯延長，并且血清特異性抗體IgA及IgG含量顯著減少，這表明CD4+T細(xì)胞在清除RSV病毒及誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體中發(fā)揮著重要作用。CD4+T細(xì)胞主要通過活化之后產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)RSV誘導(dǎo)的氣道炎癥，如IL-2、IFN-γ、IL-13等[7-10]。IL-2又稱T細(xì)胞生長因子,具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)NK細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和增殖的作用[11]。IFN-γ不僅具有調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的活化、分化和募集的作用，在一定程度上也能夠抑制IgE生成，促進(jìn)IgG的合成[12]。IL-13在促進(jìn)黏液分泌，誘導(dǎo)氣道纖維化等方面具有重要作用[13]。

TNFR/TNF超家族成員在調(diào)節(jié)免疫功能中扮演著重要角色，以往的研究表明OX40/OX40L作為這個(gè)家族中最重要的成員之一，能夠使激活的初始T細(xì)胞增殖和分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞， 在調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的增殖與活化中占重要地位[14-15，20-21]。OX40可以通過其胞內(nèi)段與TNFR重要的相關(guān)因子(TRAF 2、3、5)相互作用，而TRAF 2和3被認(rèn)為是可以激活NF-κB1經(jīng)典途徑以及NF-κB2非經(jīng)典途徑的關(guān)鍵信號分子[22-23]。OX40通過激活NF-κB1途徑，影響CD4+T細(xì)胞對抗原的應(yīng)答及其分化與增殖[24]。缺少OX40基因的CD4+T細(xì)胞其NF-κB1活性明顯減弱，導(dǎo)致Bcl-2家族相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Bfl-1)表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而影響CD4+T細(xì)胞的增殖與存活[25]。OX40還可以激活NIK以及誘導(dǎo)IKKα磷酸化，從而激活NF-κB2非經(jīng)典途徑。

研究表明OX40主要表達(dá)在炎癥浸潤部位的T細(xì)胞上, 而在非炎癥部位幾乎不表達(dá)，其生物學(xué)功能主要限于效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞。它可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其產(chǎn)生細(xì)胞因子，增強(qiáng)其效應(yīng)功能，促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的形成，延長T細(xì)胞的存活時(shí)間，在機(jī)體的免疫及自身免疫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[21，26]。在探討OX40通過CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)壓力過負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥厚和重塑的研究中發(fā)現(xiàn)：與野生鼠相比，OX40基因敲除鼠心肌肥厚癥狀明顯緩解，并且其CD4+T細(xì)胞的TNF-α、IFN-γ、IL-2因子分泌水平顯著下降[26]；在OVA致敏引起的哮喘實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)：相比于對照組，給予OX40激動型抗體的實(shí)驗(yàn)組其CD4+T細(xì)胞IFN-γ、IL-4因子分泌水平顯著增高[21]，表明OX40在促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖與活化中具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)RSV感染鼠脾組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量以及表達(dá)OX40的CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并且CD4+T細(xì)胞的OX40 mRNA及蛋白分子表達(dá)量也顯著增高，提示OX40在呼吸道合胞病毒感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)中對CD4+T細(xì)胞增殖與活化具有一定作用。另外在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，給予OX40激動型抗體的CD4+T細(xì)胞其細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13的表達(dá)水平均顯著增高，提示在RSV感染過程中OX40能夠促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖與活化。近年來，除了許多其他T細(xì)胞調(diào)節(jié)受體，OX40已成為單克隆免疫治療的靶點(diǎn)抗體[27-29]。隨著對其免疫學(xué)生物特性及功能的了解, 有望為炎癥性等疾病帶來新的前景。

本研究利用感染RSV的BALB/c鼠模型，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)在RSV感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)中OX40能夠促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖與活化。