殺松材線蟲細(xì)菌的分離、鑒定及其培養(yǎng)條件研究

王 方， 王林松， 馬 怡， 關(guān)騰騰， 張廷婷, 李榮貴

(青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)是一種常見的松樹寄生蟲，通過松墨天牛等媒介昆蟲傳播，進而引發(fā)松材線蟲病，也稱松樹萎蔫病(Pine wilt disease, PDA)[1]。寄主主要包括黑松、赤松、馬尾松等松屬植物。被松材線蟲感染的松樹，針葉呈黃褐色或紅褐色，整株干枯死亡[2]。松材線蟲病在墨西哥、美國、加拿大、日本、韓國等國均有發(fā)生[3-4]。1982年在我國南京市中山陵首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在山東、安徽、廣東、浙江等地形成幾個疾病中心，并向四周擴散，使這些省的局部地區(qū)發(fā)生并流行成災(zāi)，導(dǎo)致大批松樹枯死，給安徽、浙江兩省帶來的經(jīng)濟損失高達5億～7億元[5]。由于松材線蟲的毀滅性危害，該蟲已被列為對內(nèi)、對外的重要檢疫對象。松萎蔫病的發(fā)生與松材線蟲及其媒介昆蟲都有十分緊密的聯(lián)系。因此，防治松材線蟲對控制松萎蔫病起著非常重要的作用[6]。目前，對松萎蔫病的防治主要采用化學(xué)防治法，即采用高效的化學(xué)殺蟲劑，主要有氨基甲酸酯類(如殺線威、涕天威、克百威等)、有機磷酸酯類(如噻唑磷、滅線磷、克線威等)，線蟲容易對這些廣譜性合成藥物產(chǎn)生抗藥性，并且這些殺蟲劑多為高毒、劇毒或是高殘留的農(nóng)藥，給人類、環(huán)境、微生物、水資源等造成嚴(yán)重污染，所以化學(xué)殺蟲劑的應(yīng)用受到了很大的限制[7-8]。隨著人們環(huán)保意識的提高， 從自然界中尋找安全、高效、低毒、環(huán)境友好的新型生物殺蟲劑已經(jīng)成為研究熱點。微生物是生物資源的重要組成部分，是很多活性物質(zhì)的天然寶庫。關(guān)于殺線蟲微生物活性產(chǎn)物方面的研究，前人已經(jīng)做了很多工作。Yu等[9]從青島近海海域中發(fā)現(xiàn)了兩株殺線蟲活性很強的海洋細(xì)菌H-42和S-16，經(jīng)過測定，24 h內(nèi)的殺線活性高達100%。這些殺線蟲活性揮發(fā)物包括dimethyl trisulfide、benzaldehyde、dimethyl disulfide、tert-butylamine；李子等[10]從35株真菌分離到1株具有較高殺線活性的青霉屬真菌ML-5，經(jīng)測定，其殺線活性可以達到86%；陳聰聰?shù)萚11]從牡蠣中分離出1株放線菌HT-11，其對線蟲的校正死亡率為92%。本研究從青島大學(xué)校園內(nèi)采集的樣品中分離出1株殺線蟲活性較高的細(xì)菌G8-1，研究了G8-1的最佳培養(yǎng)條件及殺線蟲活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 從青島大學(xué)校內(nèi)池塘里采集池塘水、淤泥、蘆葦根、地衣、青苔、草坪根部土壤、松樹根部土壤、洗澡堂墻壁等樣品，分別置于無菌容器內(nèi)，做好標(biāo)記備用。

1.1.2 線蟲來源 供試松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)，分離自青島大學(xué)校內(nèi)樹木中感染松萎蔫病的黑松(Pinusthunbergii)，經(jīng)無菌化處理后得到無菌線蟲。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基1 L：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊后加蒸餾水煮沸30 min左右，冷卻后用4層紗布過濾取上清，再加葡萄糖20 g，瓊脂17 g，定容；②NA培養(yǎng)基1 L(液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉)：蛋白胨5.0 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 L，高溫高壓滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 SW-CJ-2G 型雙人標(biāo)準(zhǔn)超凈工作臺(蘇州凈化)，高壓蒸汽滅菌鍋(日本SANYO)，體視顯微鏡(麥克奧迪)，2720型PCR儀(Applied Biosystems)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流DNA電泳儀(北京市六一儀器廠)，ZHWY-1 11C恒溫培養(yǎng)箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 松材線蟲的培養(yǎng) 將灰葡萄孢(Botrytiscinerea)接種在PDA培養(yǎng)基上， 25 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)5～7 d，培養(yǎng)基表面長滿白色灰葡萄孢后，接入線蟲懸液，25 ℃避光培養(yǎng)1周，待培養(yǎng)瓶壁上爬滿線蟲后用于實驗[12]。

1.2.2 菌株的分離 采用稀釋涂布平板法進行菌株的分離。取黃豆粒大小的固體樣品加入5 mL無菌水中，25 ℃震蕩30 min，制成混懸液，與采集的水樣分別稀釋10-2、10-3、10-4倍，將不同樣品的不同稀釋度分別涂布到NA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)樣品及菌落形態(tài)的不同選擇有代表性的菌株，經(jīng)過數(shù)次平板劃線純化后，將分離出的菌株分別以NA斜面培養(yǎng)基(4 ℃)和甘油菌液形式(-80 ℃)保存。

式中，CM為線蟲校正死亡率(%)；d為處理組線蟲死亡率(%)；c為對照組線蟲死亡率(%)。

1.2.4 16S rRNA序列分析及建立系統(tǒng)發(fā)育樹 以待測細(xì)菌基因組DNA為模板，采用通用引物，進行PCR擴增反應(yīng)，將擴增得到的16S rRNA 片段與pMD18T 載體連接。連接產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定后，根據(jù)NCBI網(wǎng)站的GenBank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，選擇同源性較高的序列為參照，利用Clustal X 1.83 軟件和MEGA 7進行多序列比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15-16]。

1.2.5 具有殺線蟲活性菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化 將12 h菌齡的菌株轉(zhuǎn)接于5 mL NA液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d為起始培養(yǎng)條件。采用單因素分析法，分別測定以下條件：培養(yǎng)基的起始pH (5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、培養(yǎng)溫度 (15、20、25、30、35、40 ℃)、接種體菌齡 (9、15、21、27、33 h)和培養(yǎng)時間 (1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 d)對菌株培養(yǎng)液殺線蟲活性的影響。結(jié)合單因素實驗結(jié)果，以線蟲致死率為考察指標(biāo)，進行4因素3水平的正交實驗。

1.2.6 菌株殺線蟲活性物質(zhì)的穩(wěn)定性測定 ①熱穩(wěn)定性：將培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)入Eppendorf管，分別置于20、40、60、80、100 ℃的水浴中處理2 h后冷卻至20 ℃，測定處理后培養(yǎng)上清液的殺線蟲活性，以未接種的NA液體培養(yǎng)基為對照 ，每個處理重復(fù)3次。 ②pH穩(wěn)定性：將培養(yǎng)液上清的pH值用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HC1 分別調(diào)節(jié)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，常溫靜置12 h后再分別將pH值中和到pH 7.0，測定殺線蟲活性。以未接種的對應(yīng) pH 的NA液體培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和發(fā)酵上清液的殺線蟲活性測定

從采集的樣品中共分離出120株細(xì)菌，通過殺線蟲活性測定，獲得5株校正死亡率大于50%的細(xì)菌。其中菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性最高，處理線蟲48 h后的校正死亡率為90.81%(表 1)，因此選擇該菌株進行下一步實驗。

表1 5株細(xì)菌培養(yǎng)上清液對松材線蟲的殺線活性

注：線蟲的校正死亡率為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，P<0.05

2.2 16S rRNA序列及進化分析

以菌株 G8-1基因組為模板，采用通用引物擴增16S rRNA片段，得到大小為1 500 bp左右的序列片段。經(jīng)測序鑒定后進行BLAST分析，選擇同源性較高的菌株，利用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果表明，菌株G8-1與Flectobacillusrhizosphaerae的同源性為99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支上，因此將G8-1鑒定為FlectobacillusrhizosphaeraeG8-1。

2.3 不同培養(yǎng)條件對菌株G8-1發(fā)酵上清液殺線蟲活性的影響

2.3.1 不同培養(yǎng)溫度發(fā)酵上清液對殺線蟲活性的影響 由圖2可以看出，不同培養(yǎng)溫度對殺線蟲的活性影響較大，菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性(15～35 ℃范圍內(nèi))隨著溫度的升高而升高，高于35 ℃時活性就會降低。因此，菌株G8-1產(chǎn)生活性物質(zhì)的最適溫度為35 ℃，線蟲的校正死亡率為92.06%。

2.3.2 不同培養(yǎng)時間發(fā)酵上清液對殺線蟲活性的影響 由圖3可知，菌株G8-1培養(yǎng)時間為3 d時，隨著活性物質(zhì)的不斷積累，菌株發(fā)酵上清液的殺線蟲活性都不斷增強。當(dāng)培養(yǎng)時間超過3 d時，隨著培養(yǎng)時間的延長，殺線蟲活性逐漸降低。因此，菌株G8-1的最佳培養(yǎng)時間為3 d，線蟲的校正死亡率為90.78%。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株X30的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain G8-1 based on 16S rRNA gene sequence

圖2 不同培養(yǎng)溫度對殺線蟲的活性影響Fig.2 Effect of different culture temperatures on nematicidal activity

圖3 不同培養(yǎng)時間對殺線蟲活性的影響Fig.3 Effect of different culture time on nematicidal activityy

2.3.3 不同起始pH發(fā)酵上清液對殺線蟲活性的影響 由圖4可知，當(dāng)pH值小于7時，菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性隨著pH值的增大而提高。當(dāng)pH值大于7時，隨著pH值的升高菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性降低。因此，在pH值為7時，菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性最高，線蟲的校正死亡率為91.26%。

2.3.4 不同接種菌齡對殺線蟲活性的影響 不同接種菌齡對殺線蟲活性測定實驗結(jié)果表明，接種菌齡為15 h時，菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性最高，校正死亡率為90.33%(圖5)。當(dāng)種子液的培養(yǎng)時間超過15 h時，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株發(fā)酵上清液的殺線蟲活性反而降低。

圖4 不同起始pH對殺線蟲活性的影響Fig.4 Effect of different initial pH on nematicidal activity

圖5 不同接種菌齡對殺線蟲活性的影響Fig.5 Effect of different inoculation age on nematicidal activity

2.3.5 菌株 G8-1產(chǎn)殺線蟲活性物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗 根據(jù)正交試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素實驗結(jié)果，選取培養(yǎng)時間(A)、培養(yǎng)溫度(B)、起始pH值(C)和接種菌齡(D)4 個因素，進行4因素3水平正交試驗，試驗因素水平設(shè)計見表 2，正交試驗結(jié)果及分析見表3。

表2 正交試驗因素水平表

根據(jù)表3中R值的大小可知，各因素對產(chǎn)殺線蟲活性物質(zhì)影響的主次為 B>A>C>D。其中，培養(yǎng)溫度對菌株G8-1產(chǎn)殺線蟲活性物質(zhì)影響最大，其次是培養(yǎng)時間，初始pH和接種菌齡對其影響最小。綜合各因素的K值和直觀比較，得出最佳工藝條件為A2B2C3D1；根據(jù)方差分析結(jié)果表明培養(yǎng)溫度的影響統(tǒng)計學(xué)意義顯著，培養(yǎng)時間、起始pH、接種菌齡的統(tǒng)計學(xué)意義不顯著，因此考慮交互作用。最終確定菌株G8-1的最優(yōu)發(fā)酵條件：培養(yǎng)時間為3 d，培養(yǎng)溫度為35 ℃，起始pH 8，接種菌齡為9 h，此時菌株G8-1發(fā)酵上清液對線蟲的致死率為96.31%(表3)。

表3 正交試驗的結(jié)果及分析

2.4 殺線蟲活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.4.1 殺線蟲活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性 不同溫度對殺線蟲活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響見圖6，經(jīng)不同溫度處理后，菌珠G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性差異不顯著，表明該細(xì)菌培養(yǎng)液中殺線蟲活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.4.2 殺線蟲活性物質(zhì)pH穩(wěn)定性 菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性在pH 8.0時穩(wěn)定性最好。隨著酸性或堿性的增強，殺線蟲活性有所下降(圖7)。

圖6 活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of active substance

圖7 活性物質(zhì)pH穩(wěn)定性 Fig.7 pH stability of active substance

3 討 論

松材線蟲病是世界上最具危害的松林病害之一，具有適生范圍廣、寄主種類多、擴散速度快、松樹死亡率高、防治困難等特點，因此被稱為松樹的“癌癥”。目前，松材線蟲病的控制主要是利用合成殺蟲劑噴灑樹木、熏蒸受感染的樹木，或者將殺線蟲劑注射樹干控制線蟲來實現(xiàn)的[17]。但是，這些用于控制松材線蟲的合成殺蟲劑都是有毒的化學(xué)物質(zhì)，長期使用不僅會使線蟲產(chǎn)生耐藥性，而且會導(dǎo)致有毒物質(zhì)在土壤中積累，造成環(huán)境污染[8]。因此許多化學(xué)合成農(nóng)藥的應(yīng)用受到了很大限制。近年來，研究人員已經(jīng)開始尋找替代和有同等效果的生物防控。

松材線蟲的生物防控主要有植物防控和微生物防控兩個方面。植物防控是以植物為材料從中提取具有殺線蟲活性的成分，目前取得了較大成果，如Guo等[18-19]從無花果葉、無花果根、獨活、石榴皮中提取了6種具有明顯殺線蟲活性的物質(zhì)；Barbosa等[20]從葡萄中分離出27種植物精油，通過殺線蟲活性的測定從中篩選出5種具有較強殺線蟲活性的精油。自然界中的微生物種類很多、分布廣泛，是很多殺線蟲活性物質(zhì)的重要來源。迄今為止，發(fā)現(xiàn)很多具有殺線蟲活性的微生物，其中包括真菌、細(xì)菌和放線菌等[21-22]。牛秋紅等[23]從農(nóng)田土壤樣本中分離出198株細(xì)菌，并從中篩選出6株有殺線蟲活性的菌株，其中NS-3菌株的殺線蟲活性最高，并確定殺線蟲活性物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)；Huang等[24]從92株蘇云金芽胞桿菌分離出了蘇云金芽胞桿菌BRC-XQ12的殺蟲晶體蛋白對松材線蟲的毒性最強，并將殺蟲晶體蛋白在大腸埃希菌中進行了高效表達，用于松材線蟲病的治理。

本研究從青島大學(xué)校園內(nèi)池塘水、蘆葦根、淤泥、青苔、地衣、松樹根部土壤、草坪根部土壤、洗澡堂墻壁等樣品中分離出細(xì)菌120株，通過殺線蟲活性的測定，其中從池塘水中分離出的G8-1發(fā)酵上清液有很強的殺線蟲活性，處理線蟲48 h后的校正死亡率為90.81%。經(jīng)16S rRNA 序列分析，將G8-1鑒定為Flectobacillusrhizosphaerae，這是該菌有殺線蟲活性的首次報道。通過單因素分析和正交實驗證明了培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、接種菌齡和起始pH等條件對G8-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)有很大的影響，在培養(yǎng)溫度為35 ℃、培養(yǎng)時間為3 d、接種菌齡為9 h、起始pH為8時，菌株G8-1發(fā)酵上清液的殺線蟲活性可達96.31%。實驗結(jié)果表明，菌株G8-1易培養(yǎng)、繁殖速度快，并且具有較高的殺線蟲活性，在松萎蔫病的防治上有很好的應(yīng)用前景。在后續(xù)實驗中將對活性物質(zhì)的分離鑒定，以及其致病機理做進一步的研究，以期為松材線蟲病的生物防控提供參考。