抗腫瘤工程菌Escherichia coli Nissle 1917發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及微膠囊制備

吳柳娟， 李 躺， 莫相濤， 胡益波， 丁學(xué)知， 夏立秋

(湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081)

大腸埃希菌EscherichiacoliNissle 1917(EcN)是革蘭陰性菌，從一次志賀菌痢病蔓延時一名沒有出現(xiàn)腹瀉的士兵糞便中分離得到，基本上沒有致病性，是目前廣泛應(yīng)用的一種基因載體益生菌[1]。Stritzker等[2]研究了幾種腸道細(xì)菌對腫瘤的靶向性，發(fā)現(xiàn)EcN能夠在免疫正常和免疫缺失的小鼠移植瘤部位聚集，而在其他組織、器官的EcN不會長期停留，說明EcN是一種具有較高抗腫瘤靶向性的細(xì)菌，為EcN應(yīng)用于抗腫瘤靶向治療奠定了基礎(chǔ)。已有文獻(xiàn)報道對EcN進(jìn)行遺傳改造，使其分泌表達(dá)能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的天青蛋白(Azurin)。通過靜脈注射的方式治療乳腺癌、黑色素瘤和人結(jié)腸癌的荷瘤小鼠，取得了很好的治療效果[3-4]。隨著研究的不斷深入和廣泛的應(yīng)用開發(fā)，抗腫瘤靶向工程菌將為人類健康發(fā)揮越來越重要的作用[5]。但是，目前在應(yīng)用層面上提高抗腫瘤靶向工程菌的治療效果有待進(jìn)行兩個方面的研究：一是如何通過有效的方法快速優(yōu)化工程菌發(fā)酵條件，提高菌體發(fā)酵產(chǎn)量，促進(jìn)合成抗腫瘤蛋白；二是在制劑方面如何保藏大量活性菌體，延長有效抗腫瘤時間。目前，在培養(yǎng)基優(yōu)化中除了普遍使用的正交設(shè)計和響應(yīng)曲面設(shè)計外，利用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP Artificial neural networks, ANN)結(jié)合遺傳算法(Genetic algorithm, GA)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是目前熱門的研究方法之一[6-7]。BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是以自變量為輸入，目標(biāo)值為輸出，構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。在模型的模擬過程中，取培養(yǎng)基優(yōu)化中幾組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練和驗證數(shù)據(jù)，BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的誤差函數(shù)作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，對BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值和閾值進(jìn)行優(yōu)化，再以優(yōu)化的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為循環(huán)算法的函數(shù)進(jìn)行循環(huán)尋優(yōu)。本研究采用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分，期望提高靶向工程菌EcNA的菌體生物量。大量的研究表明該優(yōu)化方法取得了很好的結(jié)果。如Nagata等[8]利用中心組合設(shè)計的30組試驗數(shù)據(jù)為訓(xùn)練數(shù)據(jù)和驗證數(shù)據(jù)，建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，然后利用遺傳算法全局尋優(yōu)。結(jié)果顯示，該組合優(yōu)化比響應(yīng)面的二次多項式模型擬合和預(yù)測能力要好。近年來已有研究表明將活菌制備成微膠囊的可行性。如羅佳琦[9]用阿拉伯膠與麥芽糊精作為壁材包埋嗜酸乳桿菌，通過噴霧干燥的方法固化微膠囊，經(jīng)參數(shù)優(yōu)化后益生菌存活率最高可達(dá) 63%。本研究采用海藻酸鈉和殼聚糖復(fù)合包埋EcNA制成活菌微膠囊，期望提高菌體穩(wěn)定性。益生菌從加工、儲藏、運輸乃至進(jìn)入人體后經(jīng)過胃部到達(dá)腸道的過程中，需經(jīng)受一系列低酸、高膽鹽環(huán)境的影響，導(dǎo)致到達(dá)腸道的活菌數(shù)大量減少，從而限制了益生菌功能的發(fā)揮。研究表明微膠囊包埋技術(shù)不但可以增強(qiáng)益生菌對溫度、pH、光線、氧氣等外界不良環(huán)境的抵抗能力，還能顯著提高益生菌在胃腸道低酸和高膽鹽環(huán)境中的存活率[10-11]，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 大腸埃希菌Nissle 1917工程菌株(CCTCM2010313)，為本實驗室構(gòu)建表達(dá)抗腫瘤蛋白Azurin的工程菌[12]，由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH調(diào)為7.0；LB固體培養(yǎng)基：每升LB培養(yǎng)基中添加瓊脂15 g；發(fā)酵初始培養(yǎng)基：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO416.43，KH2PO42.3[13]。

1.1.3 試劑與儀器 NaCl、K2HPO4、KH2PO4、CaCl2、甘油：分析純；殼聚糖：化學(xué)試劑；海藻酸鈉：化學(xué)純，上海國藥化學(xué)試劑有限公司；玉米漿：分析純，上海源葉生物有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、蛋白胨：分析純，英國OXOID公司。冷場電子掃描顯微鏡(Hitachi Su801000，日本日立公司)；分光光度計(SmartspecTM3000，美國BIO-RAD 公司)；培養(yǎng)振蕩器(INNOVATM4900，美國NBS公司)。

1.2 方法

1.2.1 種子復(fù)壯 從-80 ℃超低溫冰箱中取出菌種保藏液10 μL，涂布到含有氯霉素和卡那霉素的LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.2 種子培養(yǎng) 從LB平板上挑取單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵 將種子液以3%接種量接入20 mL發(fā)酵初始培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)18 h。

1.2.4 活菌微膠囊的制備 將EcNA新鮮菌體用0.9% NaCl洗滌3次，加入適量的0.035 g/mL海藻酸鈉溶液，200 r/min磁力攪拌40 min，加入適量的0.012 g/mL殼聚糖溶液(用1%冰醋酸溶解)，用1 mL無菌注射器將海藻酸鈉-殼聚糖混合液勻速滴加到0.1 g/mL CaCl2溶液中，靜置固化，放入4 ℃冰箱備用[14]。

1.2.5 微膠囊形態(tài)觀察 ①微膠囊的基本形態(tài)觀察：固化后的濕微膠囊放在干凈透明的平板內(nèi)，然后拍照。②冷場電子顯微鏡觀察微膠囊的超微結(jié)構(gòu)：在樣品臺上貼上黑色的雙面膠，將洗滌后微膠囊滴加到雙面膠上并自然風(fēng)干，在樣品上鍍金進(jìn)行SEM觀察。

1.2.6 耐胃酸試驗 模擬胃液：取0.1 mol/L稀HCl溶液16.4 mL，加無菌水約800 mL及胃蛋白酶10 g，攪拌均勻后加無菌水定容至1 000 mL，0.22 μm濾膜過濾除菌備用[15-16]。稱取1 g微膠囊加入到9 mL模擬胃液中，37 ℃恒溫震蕩2 h，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0 h取出，7 000 r/min離心8 min，棄上清，收集沉淀物，放入pH為7.4的PBS緩沖溶液中，37 ℃下振蕩至完全溶解，進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.2.7 腸溶性試驗 模擬腸液：稱取KH2PO46.8 g，加無菌水500 mL攪拌溶解，稱取胰蛋白酶10 g，加適量無菌水溶解，兩液混合后攪拌均勻，加無菌水定容至1 000 mL，0.22 μm濾膜過濾除菌備用[15，17]。稱取1 g微膠囊加入到9 mL模擬腸液中，37 ℃恒溫震蕩2 h，分別在1、2、3、4 h取出，以7 000 r/min離心8 min，棄上清，收集沉淀物，放入pH為7.4的PBS緩沖溶液中，37 ℃下振蕩至完全崩解，進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.2.8 微膠囊存活率的測定 包埋率(%)=(A1/A2)×100%，式中：A1為微膠囊中活菌數(shù)(cfu/mL)；A2為微膠囊化前總活菌數(shù)(cfu/mL)。

1.2.9 實驗設(shè)計 ①培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗：以發(fā)酵初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，改變甘油的濃度(2.0、3.5、5.0、6.5、8.0 g/L)，篩選出甘油的最適添加量；改變蛋白胨、酵母粉兩種氮源的配比(4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)和總添加量(40、60、80、100、120、140、160 g/L)，篩選復(fù)配氮源的最適配比和最適生長總濃度；玉米漿是玉米制備淀粉過程中的副產(chǎn)物，含有豐富的可溶性蛋白和無機(jī)鹽等，可作為微生物發(fā)酵的生物素來源，廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)中[18-19]。為了考察補(bǔ)充玉米漿對EcNA菌體濃度的影響，本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的玉米漿(0.5、2.5、4.5、6.5、8.5、10.5、12.5 g/L)，篩選出最適添加量。②Box-Behnken 試驗設(shè)計：發(fā)酵過程中培養(yǎng)基組分存在一定的交互影響，通過簡單的單因素試驗很難獲得最佳優(yōu)化配方，由于該初始培養(yǎng)基成分不復(fù)雜，考慮到碳源和氮源基質(zhì)是影響發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素，而玉米漿的添加能顯著影響發(fā)酵產(chǎn)量，選取甘油、復(fù)配氮源、玉米漿濃度3個因素進(jìn)行Box-Behnken 試驗，綜合考察3個因素對EcNA菌體濃度的影響，獲得更可靠的試驗結(jié)論[20]。每個因素選取3個水平，試驗設(shè)計如表1所示。③BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型的構(gòu)建：以發(fā)酵培養(yǎng)基組分(X1為甘油質(zhì)量濃度，X2為復(fù)配氮源質(zhì)量濃度，X3為玉米漿質(zhì)量濃度)作為BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入，取EcNA菌體濃度Y為輸出，構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)的模擬過程中，取Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)為訓(xùn)練和驗證數(shù)據(jù)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的誤差函數(shù)作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)進(jìn)行尋優(yōu)。建模過程在Matlab2015b中進(jìn)行[21-22]。

表1 Box-Behnken 設(shè)計因素水平表

1.2.10 微膠囊制劑正交試驗 根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]，選擇海藻酸鈉、殼聚糖、壁芯比和氯化鈣4個因素，設(shè)計4因素3水平正交試驗(表2)，以微膠囊包埋率為指標(biāo)，確定最佳優(yōu)化條件。

表2 正交試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源及氮源篩選結(jié)果

如圖1所示，當(dāng)甘油添加量大于5 g/L時，菌體生長受到抑制，而小于5 g/L時能促進(jìn)生長，因此選擇5 g/L作為甘油的最適添加量。如圖2所示，當(dāng)V蛋白胨∶V酵母提取物=1∶3時，菌體濃度顯著提高，OD600達(dá)到8.89。在氮源復(fù)配比為1∶3條件下，控制其他條件一致，將氮源總濃度設(shè)置濃度梯度，考察氮源總濃度的最適添加量。如圖3所示，復(fù)配氮源濃度對菌體生長影響較大，當(dāng)?shù)纯倽舛葹?20 g/L時(蛋白胨30 g/L，酵母提取物90 g/L)，菌體濃度顯著提高，且在一定范圍內(nèi)呈濃度梯度依賴性。

2.2 玉米漿補(bǔ)加優(yōu)化

如圖4所示，添加玉米漿能促進(jìn)菌體生長，在玉米漿質(zhì)量濃度為8.5 g/L時菌體濃度達(dá)到最高，OD600達(dá)到10.12。當(dāng)加入過高濃度的玉米漿，培養(yǎng)基的黏度增大，不利于工程菌的發(fā)酵。

圖1 甘油對EcNA菌體濃度的影響Fig.1 Effects of glycerol on concentration of EcNA

圖2 氮源復(fù)配比對EcNA菌體濃度的影響Fig.2 Effects of source of nitrogen compound ratio on concentration of EcNA

圖3 復(fù)配氮源對EcNA菌體濃度的影響 Fig.3 Effects of compound source nitrogen on concentration of EcNA

圖4 玉米漿對EcNA菌體濃度的影響Fig.4 Effects of corn starch on concentration of EcNA

2.3 Box-Behnken 設(shè)計結(jié)果及回歸分析

根據(jù)回歸分析，響應(yīng)面顯著地表示了Y與X1、X2、X3的關(guān)系，通過該模型繪制等高線圖(圖5)和響應(yīng)面分析圖(圖6)。圖5中兩因素作用構(gòu)成的圖形越橢圓，交互作用越強(qiáng)，表明甘油與復(fù)配氮源在發(fā)酵過程中存在交互作用。如圖6所示，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度在5 g/L不變，復(fù)配氮源質(zhì)量濃度在70～170 g/L時，菌體濃度呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，說明過高或過低的氮源濃度都不利于菌體生長。

表3 Box-Behnken 設(shè)計及結(jié)果

表4 Box-Behnken 試驗各因素的回歸分析

注：**P<0.01，差異極顯著；*P<0.05，差異顯著

2.4 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立及遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

為了驗證算法的有效性，針對相同Box-Behnken樣本數(shù)據(jù)集，分別用響應(yīng)面模型(RSM)和BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對該樣本進(jìn)行預(yù)測，由圖7可知，相比響應(yīng)面模型，經(jīng)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的值與實際測定值擬合得更好，表明BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對該菌株發(fā)酵條件優(yōu)化將具有更優(yōu)的預(yù)測能力。

圖5 甘油與復(fù)配氮源濃度對工程菌EcNA菌體濃度影響的等高線和響應(yīng)面分析Fig.5 The contour analyze of effects of glycerol and compound source nitrogen on concentration of EcNA

圖6 甘油和復(fù)配氮源對工程菌EcNA菌體濃度影響的響應(yīng)面分析Fig.6 Response surface analyze of effects of glycerol and compound source nitrogen on concentration of EcNA

2.5 兩種模型的對比

如表5所示，采用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法預(yù)測優(yōu)化后，預(yù)測最大值對應(yīng)的培養(yǎng)基組分為甘油7 g/L，復(fù)配氮源115 g/L，玉米漿10 g/L，經(jīng)發(fā)酵3次驗證，工程菌EcNA菌體濃度OD600達(dá)到12.92，相比于響應(yīng)面模型實際驗證的最佳生物量高4.95%，說明BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法在培養(yǎng)基優(yōu)化中效果更好。

圖7 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)面預(yù)測值和實際觀測值分析Fig.7 Predicted by the ANN model and by the RSM model vs. Actual biomass

模型EcNA菌體生物量/OD600甘油/(g·L-1)復(fù)配氮源/(g·L-1)玉米漿/(g·L-1)ANN12.92±0.137.00115.0010.00RSM12.31±0.244.55115.7212.44

2.6 工程菌EcNA活菌微膠囊的制備結(jié)果分析

2.6.1 EcNA微膠囊正交試驗及方差分析 由表6可知，通過對試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，各因素影響微膠囊包埋產(chǎn)量的主次順序為海藻酸鈉>殼聚糖>壁芯比>氯化鈣，最佳試驗組合為A2B1C2D3，即海藻酸鈉質(zhì)量濃度為0.035 g/mL，殼聚糖質(zhì)量濃度為0.004 g/mL，壁芯比為2∶2，氯化鈣為0.05 g/mL，包埋率為94.5%。由表7方差分析結(jié)果可知，海藻酸鈉、殼聚糖、壁芯比對活菌微膠囊的包埋率有顯著影響，各因素的F值反映其對試驗指標(biāo)的影響大小，各因素對包埋效果的影響大小順序為海藻酸鈉>殼聚糖>壁芯比>氯化鈣，與正交試驗的極差分析結(jié)果一致。

表6 L9 (34)正交試驗結(jié)果與極差分析Table 6 Experimental results and range analysis for L9 (34) orthogonal array Design

表7 正交設(shè)計方差分析Table 7 Analysis of variance for orthogonal array design

注：**P<0.01，差異極顯著；*P<0.05，差異顯著；F0.01(2,8)=99，F(xiàn)0.05(2,8)=19

2.6.2 微膠囊形態(tài)觀察 如圖8A所示，通過擠壓法制得的微膠囊形狀均一，呈圓球狀，粒徑在1 mm左右，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，顆粒外面一層是凝膠膜，是鈣離子與海藻酸鈉-殼聚糖液滴發(fā)生交聯(lián)形成的凝膠層。圖8B、C是微膠囊的掃描電鏡圖，形成的微膠囊排列比較緊密，有時也會隨機(jī)出現(xiàn)較完整的圓球形。從圖B中可以看出，微膠囊化后表面沒有出現(xiàn)縫隙，囊壁結(jié)構(gòu)較完整，說明能很好地將EcNA包埋其中，起到很好的保護(hù)作用。

2.6.3 胃耐受性試驗 人體胃部消化食物的過程為1～2 h，所制備的微膠囊應(yīng)該在這段時間內(nèi)保護(hù)工程菌EcNA抵御胃部的酸性環(huán)境，使其順利進(jìn)入腸道發(fā)揮作用，由于食物的成分不同，人體胃液通常會發(fā)生波動，試驗選擇2.5和4.5兩個pH值人工胃液模擬胃部環(huán)境，考察微膠囊對工程菌EcNA的保護(hù)作用。如圖9所示，在兩種pH人工胃液中處理2 h后，未微膠囊化的菌體數(shù)量迅速下降，而經(jīng)包埋后的微膠囊仍保持較高的水平，均在80%以上，說明微膠囊化能很好地保護(hù)工程菌EcNA抵御胃部的酸性環(huán)境。

圖8 EcNA活菌微膠囊形態(tài)表征Fig.8 The microcapsule morphology characterization of EcNAA：EcNA微膠囊的基本形態(tài)觀察；B、C：冷場電子顯微鏡觀察EcNA微膠囊的超微結(jié)構(gòu)A：asic morphological observation of microcapsule EcNA;B，C：ltrastructure of microcapsules ice electronic microscope EcNA

2.6.4 腸溶性試驗 微膠囊化的EcNA經(jīng)人工腸液處理4 h，如圖10所示，在人工腸液中微膠囊開始發(fā)生溶解，隨著處理時間的延長，微膠囊的腸溶出率也不斷增加，1 h后可觀察溶液幾乎不含固體顆粒，基本完全溶解，腸溶性較好。

圖9 EcNA微膠囊活菌在人工胃液中的存活率Fig.9 The survival rate of living bacterium microcapsules in artificial gastric juice

圖10 EcNA微膠囊活菌在人工腸液中的釋放率Fig.10 Living bacterium microcapsules release rate in artificial intestinal juice

3 討 論

大腸埃希菌的基因工程菌在發(fā)酵時應(yīng)盡量控制其代謝產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生，這樣更有利于菌體生長和目的蛋白的表達(dá)。但過低的甘油濃度不利于基因的轉(zhuǎn)移形式，過高的甘油濃度會增加3-磷酸甘油的積累而抑制菌體生長,所以在EcNA發(fā)酵過程中應(yīng)添加適量甘油有利于菌體生長。本研究通過單因素試驗篩選出甘油的最適添加量為5 g/L，此時EcNA生長狀況最好。在發(fā)酵過程中添加氮源是菌體生長所必需的，酵母提取物營養(yǎng)物質(zhì)較豐富，但只含有少量的氨和碳水化合物，如果將其作為單一氮源，則要加入大量的酵母提取物才能滿足菌體對氮源組分的需求，但酵母提取物黏度較大，過量加入不利于菌體生長。蛋白胨雖然營養(yǎng)物質(zhì)不夠豐富，但本身含有較多的氨基酸，主要作用就是用來提供氮源。當(dāng)兩種組分復(fù)合添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，既滿足了菌體對氮源和營養(yǎng)物質(zhì)的需求，也克服了單一氮源的不利因素對菌體生長造成的影響。本研究以EcNA為對象，考察了酵母提取物和蛋白胨復(fù)配添加對EcNA菌體濃度的影響，結(jié)果顯示與添加單一組分相比，其菌體濃度顯著增高。

本研究已經(jīng)在培養(yǎng)基中添加了足夠的蛋白胨和酵母提取物，玉米漿因含有大量的溶磷和氨可能會抑制菌體的生長，所以玉米漿的添加量需要控制在合適的范圍內(nèi)。在補(bǔ)加適量玉米漿組分后，實現(xiàn)了EcNA高密度發(fā)酵，且玉米漿的添加在增產(chǎn)的同時并沒有額外補(bǔ)加無機(jī)鹽，說明玉米漿的添加不僅可以增加工程菌的菌體濃度還可以減少無機(jī)鹽的添加，實現(xiàn)了降低生產(chǎn)成本的目的[25-26]。

由于培養(yǎng)基組分之間關(guān)系復(fù)雜，需做大量的實驗才能考慮所有的情況對微生物生長的影響，這對實際應(yīng)用來說是不合理的。但培養(yǎng)基組分與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量之間必定存在聯(lián)系，即不同的培養(yǎng)基組分組合對應(yīng)不同的輸出產(chǎn)量值。本研究以Box-Behnken設(shè)計試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模，與傳統(tǒng)的響應(yīng)面模型對比，有更好的擬合能力和泛化能力，能夠很好地反映出3個重要的培養(yǎng)基組分與EcNA菌體濃度的映射關(guān)系，再通過遺傳算法尋找最佳培養(yǎng)基配比，其最高菌體濃度比響應(yīng)面模型預(yù)測值提高了4.95%。因此，該優(yōu)化方法有可能更好地應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。

殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中有氨基，當(dāng)pH低于6.5時帶正電，可與帶負(fù)電的海藻酸鈉在結(jié)合過程中產(chǎn)生靜電作用，在海藻酸鈉微膠囊表面形成一層解電解質(zhì)膜，酸性液體進(jìn)入微膠囊內(nèi)部的難度就加大，從而減少了這些酸性液體對菌體的直接傷害，菌體存活率會越高[27]。在此基礎(chǔ)上，本研究成功地將海藻酸鈉和殼聚糖作為復(fù)合壁材，制備得到耐酸性良好的EcNA微膠囊。顯示出海藻酸鈉和殼聚糖復(fù)配包埋廣泛用于微膠囊制備過程中，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)制備益生菌微膠囊提供參考。