線粒體肌病的臨床診治現(xiàn)狀和研究進展*

宋騰騰， 李 倩

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科/急診內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

1962年，Luft等首先報道了一位衰弱、極度易疲勞和易出汗的成年女性，其生化檢查顯示線粒體出現(xiàn)明顯的氧化-磷酸化脫耦聯(lián)反應(yīng)，從而提出了線粒體肌病(mitochondrial myopathy，MM)的概念。近年來，隨著對MM認識的不斷深入，該病也從廣義的概括逐漸被精分為更具體的病變綜合征。根據(jù)其臨床表現(xiàn)主要分為線粒體心肌病(mitochondrial cardiomyopathy,MCM)和線粒體腦肌病(mitochondrial encephalomyopathies,ME)，大部分患者往往因心臟和腦部不適首先就診于心內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科，也有部分患者因眼部及胃腸不適就診于眼科和消化內(nèi)科。為了加強臨床醫(yī)生對MM的認識，避免對其漏診及誤診，并給予患者準(zhǔn)確的診斷及有效的治療，本篇將從MCM和ME常見表型的分子遺傳學(xué)致病角度，對其臨床診斷和治療作一綜述。

1 MM的分子遺傳學(xué)發(fā)病機制

1.1MCM的相關(guān)發(fā)病機制MCM是MM中的一種常見表型，其臨床表現(xiàn)具有多樣性和異質(zhì)性，其中最常見的癥狀是肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)、擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)、左室心肌致密化不全心肌病(left ventricular noncompaction cardiomopaction，LVNC)以及心律失常等。MCM的致病機制主要與mtDNA突變有關(guān)。其中mtDNA中的tRNA基因、rRNA基因以及某些結(jié)構(gòu)基因突變均可引起細胞氧化磷酸化功能障礙，繼而引發(fā)MCM。2017年諸葛瑞琪等針對MCM發(fā)病機制進行概述[1]，指出tRNA突變是MCM最主要、最常見的致病因素。另有研究證實，tRNA點突變約占MCM所有致病機制的50%[2]。現(xiàn)已明確可直接導(dǎo)致MCM的tRNA突變有：tRNAleu、tRNAIle、tRNALys和tRNAGly。另外，MCM還與nDNA突變有關(guān)。一方面，nDNA負責(zé)編碼大部分的呼吸鏈復(fù)合體亞基以及mtDNA復(fù)制和表達所需要的酶；另一方面，nDNA編碼的產(chǎn)物可直接參與線粒體氧化呼吸鏈的構(gòu)成。最后，MCM還可與過氧化物酶體增殖激活受體家族(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)及其共激活劑過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)有關(guān)[3]。其中，PPARs作為配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三種表型，參與協(xié)調(diào)機體的脂質(zhì)及糖代謝過程。PGC-1α作為PPARs的重要協(xié)同因子，不僅參與協(xié)調(diào)脂質(zhì)及糖代謝過程，而且在線粒體生物發(fā)生過程中，發(fā)揮主導(dǎo)因子的作用，參與協(xié)調(diào)nDNA和mtDNA編碼的蛋白質(zhì)表達[4]。見表1。

表1 MCM的分子遺傳學(xué)發(fā)病機制

1.1.1HCMHCM是mtDNA突變損傷心肌的一種常見表型，與其相關(guān)的tRNA突變位點有tRNAIleAG4300[5]、tRNAleuAG3243[6]和tRNAGlyTC9997[7]等。2015年，李雨濃等[8]選取中國西南地區(qū)185例原發(fā)性心肌病患者(其中HCM 65例，家族性HCM 2例)與200例健康者進行病例對照研究。該試驗篩選了7個最易發(fā)生突變的tRNA基因序列作為目的基因進行擴增，然后將擴增結(jié)果與正常線粒體基因庫進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCM家系患者中存在tRNAGlnAG4395點突變，而其余非家系HCM患者及健康者均未發(fā)現(xiàn)該位點突變，于是推測tRNAGlnAG4395點突變可能是家族性HCM的致病因素。另外，2016年國外還發(fā)現(xiàn)了ND1結(jié)構(gòu)基因上的TC3398點突變[9]。以上這些突變均可導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈的復(fù)合體亞基失活及呼吸鏈蛋白和心肌收縮蛋白合成障礙，最終引發(fā)心室肌肥厚。

1.1.2DCMDCM的病因比較復(fù)雜，但主要與遺傳因素有關(guān)(25%～35%)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與DCM相關(guān)的tRNA點突變有：tRNAleuCT3303[11]、tRNAIleAG4269[12]、tRNALysAG834[13]等。同時多項研究指出，mtDNA的結(jié)構(gòu)基因突變也可導(dǎo)致DCM。比如結(jié)構(gòu)基因Cytb上的AG14927、AG15236、CA15452；COⅠ上的CG6521；COⅡ上的AG7673以及ND6上的TC14180等[14]。另外，mtDNA的缺失突變也與DCM具有相關(guān)性。以上這些突變均可引起ATP合成障礙，同時激發(fā)活性氧自由基產(chǎn)生，繼而導(dǎo)致呼吸鏈相關(guān)酶失活及心肌細胞受損。2013年Cardena等報道了一例mtDNA新重復(fù)突變的DCM患者[15]，在16018和16032之間檢測出15bp的tRNA新重復(fù)序列，該重復(fù)序列位于tRNA脯氨酸基因(tRNAPro)上。報道還指出，該重復(fù)突變可破壞tRNAPro的穩(wěn)定性，進而破壞心肌細胞的氧化應(yīng)激平衡。

1.1.3LVNCLVNC表現(xiàn)為X-連鎖遺傳、母系遺傳及常染色體顯性遺傳，其具體致病機制尚不十分清楚。對于LVNC的mtDNA突變，多項研究結(jié)果顯示不同程度的差異。2013年，柳勝華等在LVNC患者的mtDNA全長序列中檢測出227個異常變異[16]，后經(jīng)家系分析，這些異常突變并不是LVNC的致病因素。而Zhang Y等[17]對20例LVNC患者的線粒體基因組進行了Illumina平行測序，并進行MitoMaster分析，結(jié)果顯示某些稀有線粒體單核苷酸多態(tài)性(rare mitochondrial single nucleotide polymorphisms ，mtSNP)(SNP是基因組中單個核苷酸的變異，可用于對某些復(fù)雜性狀及疾病的遺傳分析)比如mtSNP AG3397和mtSNP TC3398可導(dǎo)致線粒體功能受損而引發(fā)LVNC。其中，mtSNP TC3398不僅可引起結(jié)構(gòu)基因ND1突變，也可導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ出現(xiàn)異常，該現(xiàn)象在一般群體中極少見，故懷疑mtSNP TC3398與LVNC的發(fā)病有關(guān)。另外，LVNC與常染色體基因突變也有關(guān)。Klaassen S等曾利用基因測序技術(shù)和變性高效液相色譜分析對LVNC的常染色體基因進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACTC、TNNT2、MYH7等多處基因均有不同程度變異[18]。結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)，關(guān)于LVNC的具體致病機制尚需進一步探究。

1.2ME的相關(guān)發(fā)病機制ME是由于mtDNA或nDNA缺陷而引起的一種遺傳代謝性疾病，不僅可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還可引起眼部、皮膚等多處異常。例如，累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)可表現(xiàn)為線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes,MELAS)、線粒體神經(jīng)胃腸型腦肌病 (mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy,MNGIE)；累及眼部可表現(xiàn)為kears-sayre綜合征(kears-sayre syndrome，KSS)、慢性進行性眼外肌癱瘓(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO)等；以上這些疾病的致病基因均可表達為錯義突變、缺失-插入突變等，其突變的結(jié)果是線粒體中tRNA或rRNA數(shù)量不足，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成異常。見表2。

表2 ME的分子遺傳學(xué)發(fā)病機制

1.2.1MELASMELAS的致病因素主要與mtDNA AG3243點突變有關(guān)，大約占所有致病基因的80%[19]，另有10%的mtDNA TC3271突變以及5%的mtDNA AG3252突變等[20]多個突變位點。2013年郭章寶等搜集了6例MELAS患者，其中有2例因發(fā)現(xiàn)mtDNA AG3243點突變而得到確診[21]。mtDNA AG3243突變引起線粒體翻譯障礙和蛋白質(zhì)合成受損，致使電子傳遞鏈的復(fù)合體亞基及線粒體相關(guān)酶合成異常。這些異常可造成細胞能量缺失，繼而刺激血管平滑肌及內(nèi)皮細胞增殖，最終因組織器官的血液灌注受損而致病。另外，這些異常也造成線粒體功能失調(diào)，各組織器官因不能得到代謝所需求的能量而衰竭。

1.2.2MNGIEMNGIE主要表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，其致病因素與常染色體 22q13.32上的胸腺嘧啶核苷酸磷酸化酶基因(thymidine phosphorylase,TYMP)突變有關(guān)。TYMP突變使胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)合成異常，導(dǎo)致胸苷和脫氧尿苷在血漿和組織中積聚過多而引發(fā)多系統(tǒng)病變。隨著對MNGIE認識的不斷深入，還發(fā)現(xiàn)了TYMP的新重復(fù)突變。2015年范劍劍等在MNGIE先證者的TYMP 9號外顯子上發(fā)現(xiàn)c.1193-1216 dup純合重復(fù)突變[22]，該突變被認為是MNGIE的致病突變，為國內(nèi)外首次報道。另外，MNGIE通常表現(xiàn)為周圍神經(jīng)病變及胃腸道不適，而該患者主要表現(xiàn)為眼外肌受累及視力下降，考慮其特殊表現(xiàn)與該純合重復(fù)突變有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，c.1193-1216 dup純合重復(fù)突變并不影響TYMP的基因轉(zhuǎn)錄，而是通過破壞TP酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性而致病。

1.2.3CPEO、KSSCPEO和KSS具有明顯的相關(guān)性，即CPEO如果同時合并視網(wǎng)膜色素變性和心肌傳導(dǎo)阻滯即為KSS，二者均與mtDNA片段缺失有關(guān)，表型的差異主要取決于mtDNA缺失的部位和比例不同。另外，mtDNA突變的時間對其臨床表現(xiàn)也有影響。隨著年齡增加，mtDNA的缺失突變逐漸積累，故年老患者往往比年輕患者病情重。Lópezgallardo E等曾對313例CPEO和KSS患者的mtDNA突變進行薈萃分析[23]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mtDNA突變時間不僅可影響缺失突變的數(shù)量及部位，還可影響其組織表型。同時指出，大部分患者的mtDNA缺失突變范圍在1.3～7.6 kb之間[24]，其突變結(jié)果是丟失部分線粒體基因比如tRNA,進而導(dǎo)致mtDNA蛋白質(zhì)合成異常。

目前發(fā)現(xiàn)的ME表型還有很多，但由于基因檢測技術(shù)有限及臨床可見病例較少，對其表型研究仍不夠深入，關(guān)于其致病機制也缺乏有效證據(jù)。因此，研究人員應(yīng)在既往探測MM致病技術(shù)的基礎(chǔ)上，探究更加精細的檢測技術(shù)，以利于未來充分認識ME。

2 MM的診斷

2.1基因檢測目前基因檢測技術(shù)尚不成熟，但已成為臨床診斷MM的新趨勢。2016年張哲等搜集190例MELAS患者，報道顯示190例中有175例經(jīng)基因檢測而得到確診[25]。多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex probe amplification，MLPA)可用于篩查MM，MLPA法是Schouten等首次研發(fā)且靈敏度極高的基因測序技術(shù)[26]。2013年北京協(xié)和醫(yī)院曾利用MLPA法對281例線粒體異常的病例進行檢測[27]，結(jié)果顯示有38例出現(xiàn)mtDNA突變，其中包括mtDNA AG3243、AG8344、TG8993等點突變以及mtDNA的缺失突變，最終證實MLPA法可用于篩查MM。另外，聚合酶鏈反應(yīng)擴增技術(shù)、直接核苷酸測序技術(shù)以及下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)等均可用于診斷MM。其中，NGS是許多實驗室用于測試遺傳性疾病和腫瘤突變的方法，該技術(shù)以相對較低的成本對外顯子組、轉(zhuǎn)錄組和基因組進行快速測序[28]，可幫助臨床醫(yī)生充分認識MM。

2.2病理及影像檢查選擇中度受累的肌肉組織進行改良Gomori三色染色(mitochondria gomori tricolor，MGT)、細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,COX)染色以及琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)染色等，以明確MM的線粒體功能狀態(tài)。其中，COX及SDH是細胞有氧代謝的重要酶，屬于線粒體的標(biāo)志酶。COX可反應(yīng)呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ的狀態(tài)(由mtDNA編碼)，用于評價線粒體電子傳導(dǎo)酶異常。SDH可代表呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ的狀態(tài)(由nDNA編碼)，用于評估細胞內(nèi)的呼吸功能情況[29-30]。2015年高美欽等使用改良Seligman的二氨基聯(lián)苯胺法和Nachlas的硝基鹽四唑法對MM的COX及SDH進行檢測[31]，結(jié)果顯示：肌纖維大小不一，COX未見棕黃色(陰性)，SDH可見藍色顆粒增加(陽性)。該結(jié)果表明mtDNA突變可對COX產(chǎn)生影響，而對SDH無影響。該試驗采用雙重染色技術(shù)，有助于對線粒體功能障礙的細胞進行定位，并對診斷傾向于MM的病例提供參考價值。另外，影像學(xué)作為臨床常規(guī)檢查，對明確MM也發(fā)揮良好的診斷作用。2016年王柳仙等[32]收集了16例MELAS患者，指出急性期的MRI表現(xiàn)為腦組織輕度腫脹，慢性期表現(xiàn)為腦萎縮，顳葉、枕葉、頂葉等多處腦葉可見楔形或斑片狀腦梗死樣病灶。最新報道指出[33]，ME患者磁共振波譜成像 (1H-magnetic resonance spectronscopy,1H-MRS)的乳酸峰在腦脊液區(qū)成像價值顯著高于腦內(nèi)病灶區(qū)。1H-MRS在一般情況下主要對腦內(nèi)病灶區(qū)進行勘察，但當(dāng)腦組織出現(xiàn)代謝異常時，乳酸等代謝廢物會在腦脊液區(qū)堆積，進而使腦脊液區(qū)乳酸峰成像呈現(xiàn)出比病變區(qū)更具特異性的信號。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)對這兩種情況進行鑒別，以避免發(fā)生誤診。

3 線粒體肌病的治療

絕大多數(shù)的MM缺乏確切有效的治療，主要集中于對癥治療。(1)藥物治療：可采用“線粒體雞尾酒療法”即給予多種能量合劑如三磷酸腺苷、多種輔酶合劑如輔酶Q10以及補充多種維生素如維生素C、E等。其中，輔酶Q10可清除自由基對細胞的損傷，還可參與線粒體氧化磷酸化反應(yīng)，為細胞提供能量。有研究指出，“改良線粒體雞尾酒療法”即在傳統(tǒng)雞尾酒療法基礎(chǔ)上添加丁苯酞可明顯緩解MM的腦部癥狀[34]。另外，新型抗癲癇藥如左乙拉西坦等可控制肌肉陣攣而減緩MM進展。?；撬峥梢欢ǔ潭壬蠝p少MM患者的氧耗量以預(yù)防卒中發(fā)作[35]。(2)飲食治療：應(yīng)避免空腹，提倡高脂低糖飲食即生酮飲食。通過脂肪酸代謝產(chǎn)生ATP，為MM患者提供能量。(3)手術(shù)治療：比如kears-sayre綜合征，針對其心臟傳導(dǎo)阻滯，通過植入心臟起搏器來緩解癥狀。(4)中醫(yī)治療：從肝論治法、補肝強筋法、活血祛風(fēng)法、針?biāo)幝?lián)合法等均可減緩MM短期進展?？傊瑢M的對癥治療應(yīng)遵循三個原則：改善線粒體能量障礙、清除體內(nèi)代謝廢物以及避免服用損害線粒體功能的物質(zhì)。

藥物治療僅在一定程度上緩解癥狀，結(jié)合MM的致病機制特點，我們應(yīng)試圖從病因上尋找減輕患者病痛的新思路。由于MM的臨床病例較少，又不易做出明確診斷，往往給探究此病的臨床醫(yī)生及科研人員帶來許多困難。為攻克本病，業(yè)內(nèi)人士可嘗試利用基因療法來減少致病基因的突變比例。比如植入異源性基因[36]、同種異體骨髓移植以及造血干細胞基因療法[37]等。另外，建立合適的體外MM模型，可輔助探究病因并為其治療尋找新突破點。2015年國外學(xué)者首次對該思路進行實踐，Kodaira M等試圖利用原代MELAS成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸ELAS特異性誘導(dǎo)多能干細胞(specific induced pluripotent stem cells iPSCs)，并嘗試建立體外MELAS-iPSCs模型。該試驗通過對體內(nèi)外mtDNA AG3243突變異質(zhì)性對比分析得出，MELAS-iPSC可以作為MELAS的模型，并為未來治療MM提供有效的藥物篩選方法[38]。之后，Yang Y等利用線粒體靶向轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(mitochondriatargeted transcriptional activatorlike effector nuclease,mitoTALENs)成功消除了MELAS-iPSCs模型中的mtDNA AG3243突變[39]。該研究表明，線粒體靶向核酸內(nèi)切酶可靶向破壞mtDNA的突變位點及誘導(dǎo)異質(zhì)性移位，為今后治療MM提供新的研究方向。

4 結(jié)語及展望

對MM的診斷可采用多種方法，結(jié)合臨床癥狀及影像學(xué)改變，積極采用肌肉病理活檢及基因檢測等手段，對患者進行早期診斷、早期治療。目前對MM的治療仍處于探索階段，除了對癥治療外，應(yīng)積極探究病因治療，并充分利用最新技術(shù)對MM實施診治。醫(yī)學(xué)界人士可借鑒建立體外MELAS-iPSCs模型的新思路，充分利用靶向治療對mtDNA的突變位點進行攻擊，或許可為未來治療MM提供新的方式。另外，種系間植入、促進肌肉再生以及選擇性針對呼吸鏈治療等理論方法，也可為治療MM創(chuàng)建新思路。

盡管對MM的研究還不夠深入，但隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的診斷和治療方法被發(fā)掘。臨床醫(yī)生可結(jié)合最新指南對MM進行診斷，并采取確切有效的治療方法對其進行干預(yù)。學(xué)者們應(yīng)結(jié)合前人經(jīng)驗進行回顧性總結(jié)，并積極進行前瞻性研究，進而全方位的認識MM。