基于模塊化優(yōu)化策略強(qiáng)化大腸桿菌合成血紅素

翁煥嬌 ， 丁雯雯 ， 石雅南 ， 李江華 *， 康 振

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

血紅素是一種存在于生物體內(nèi)的含鐵卟啉衍生物，由原卟啉與1個(gè)二價(jià)鐵原子構(gòu)成[1]。其核心是亞鐵離子，具有攜氧能力，是有氧呼吸及厭氧呼吸電子傳遞鏈蛋白質(zhì)的重要組分，參與生物細(xì)胞中的多種氧化代謝，包括氧氣運(yùn)輸、氧化應(yīng)激反應(yīng)和依賴(lài)于電子傳遞的氧化磷酸化等；除此之外，它還參與其他雙原子氣體的合成，例如一氧化碳和一氧化氮[2-3]。作為一個(gè)調(diào)節(jié)因子，血紅素通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、蛋白質(zhì)靶定、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和分化等方面介導(dǎo)基因的表達(dá)[4-12]。目前，血紅素不僅在食品行業(yè)常被用于著色劑，如腸類(lèi)制品；在醫(yī)學(xué)臨床上也廣泛的使用，如作為半合成膽紅素原料，生產(chǎn)抗肝功能亢進(jìn)、抗炎癥作用和抗腫瘤作用的重要藥物等。此外，血紅素也是良好的補(bǔ)血?jiǎng)?，亞鐵血紅素可直接被人體吸收，吸收率高達(dá)10%~20%[13-16]。

包括血紅素在內(nèi)的卟啉類(lèi)化合物的合成可以通過(guò)化學(xué)合成，但是由于它們結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成過(guò)程中反應(yīng)步驟繁瑣，得率比較低，使得卟啉類(lèi)化合物價(jià)格昂貴[17]。為此，微生物成為生產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的卟啉類(lèi)化合物的最佳選擇。隨著基因工程技術(shù)的成熟，選擇大腸桿菌作為宿主大量合成血紅素具有廣闊的前景[1，18]。

在生物體內(nèi)，血紅素的合成需要經(jīng)過(guò)多步酶促反應(yīng)，且途徑中涉及到的酶大部分都是高度保守的[2]。 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是合成血紅素的關(guān)鍵前體物質(zhì)[19]。如圖1（a）所示，兩分子ALA在依賴(lài)于Zn2+的ALA脫水酶（HemB，由基因hemB編碼）催化下縮合生成膽色素原，然后4分子膽色素原在羥甲基膽素合成酶（HemC，由基因hemC編碼）的作用下進(jìn)一步縮合生成不穩(wěn)定的羥甲基膽素，接著在尿卟啉原Ⅲ合成酶（HemD，由基因hemD編碼）的環(huán)化作用下生成含有四吡咯環(huán)的尿卟啉原Ⅲ，再經(jīng)過(guò)尿卟啉原Ⅲ脫羧酶（HemE，由基因hemE編碼）的作用，將尿卟啉原Ⅲ的4個(gè)側(cè)鏈脫羧化形成甲基，生成糞卟啉原Ⅲ；糞卟啉原Ⅲ在糞卟啉原Ⅲ氧化酶（HemF，由基因hemF編碼）的催化作用生成原卟啉原Ⅸ，同時(shí)釋放H2O2和CO2。在原卟啉原氧化酶（HemG，由基因hemG編碼）催化下去除原卟啉原Ⅸ的6個(gè)氫原子生成原卟啉Ⅸ。最后亞鐵螯合酶（HemH，由基因hemH編碼）通過(guò)在原卟啉Ⅸ的內(nèi)部螯合鐵離子形成血紅素，從而完成整個(gè)血紅素合成途徑。

圖1 大腸桿菌中血紅素合成途徑及途徑基因分模塊組合方式示意圖Fig.1 Heme biosynthesis pathway in E.coli and the modular assembling ways of genes

在大腸桿菌中，ALA的合成受血紅素的嚴(yán)格反饋調(diào)控[20]。張俊麗等發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)血紅素合成途徑基因hemD、hemF有利于ALA的積累[21]。Kwon等成功在大腸桿菌中表達(dá)來(lái)源于類(lèi)球紅細(xì)菌的hemA基因，合成血紅素[22]。此外，通過(guò)異源表達(dá)泛酸途徑的coaA基因和卟啉合成途徑的hemB、hemC、hemD、hemE基因，也可獲得高產(chǎn)血紅素的菌株，但是這個(gè)產(chǎn)量對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)來(lái)講，還是較低[23]。因此，進(jìn)一步對(duì)血紅素合成途徑進(jìn)行改造，提高血紅素產(chǎn)量是十分必要的。

微生物代謝網(wǎng)絡(luò)往往復(fù)雜且多變，通過(guò)引入模塊化組合策略能很好地解決代謝途徑中代謝流量的平衡問(wèn)題，提高產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率[24]。由于血紅素合成途徑調(diào)控機(jī)理復(fù)雜，受多方面因素影響[25-26]。為了進(jìn)一步促進(jìn)血紅素的積累，本研究將ALA C5合成途徑關(guān)鍵酶基因hemL和hemA劃分為第一模塊，用高拷貝質(zhì)粒pUC19過(guò)量表達(dá)，同時(shí)將來(lái)源于大腸桿菌血紅素生物合成途徑的基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH分為第二、第三模塊，其中基因hemB、hemC、hemD、hemE為第二模塊，基因hemF、hemG、hemH為第三模塊，利用拷貝數(shù)不同的質(zhì)粒改變第二、第三模塊中基因的表達(dá)強(qiáng)度，對(duì)這2個(gè)模塊的基因組合表達(dá)，得到的重組菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7，在 250 mL 的搖瓶發(fā)酵48 h 時(shí)，其血紅素產(chǎn)量分別為 0.08、0.09、0.25、0.35、0.44、0.56、 0.46 μmol/（L·OD）。 將搖瓶水平上血紅素產(chǎn)量最高的重組菌株E.coli-D6在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大培養(yǎng)，48 h 時(shí)產(chǎn)量達(dá)到 0.954 μmol/（L·OD）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 菌株E.coliJM109，用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建；E.coliDH5α，作為宿主細(xì)胞，用于重組質(zhì)粒的表達(dá)。相關(guān)質(zhì)粒和菌株見(jiàn)表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑和工具酶 質(zhì)粒小量提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、抗生素包括氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素和鏈霉素等、IPTG等，均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒和各種限制性?xún)?nèi)切酶等，購(gòu)自Thermo公司；Primer Star Max DNA聚合酶、DNA連接酶、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；5-氨基乙酰丙酸和膽色素原，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購(gòu)于Oxoid公司；其他化學(xué)試劑，均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)，純度為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉 5.0，pH 7.0；裝液量 8 mL/dL；

發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）：（NH4）2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0， 酵母提取物1.0，葡萄糖 20；pH 7.0，裝液量 30 mL/250 mL。

分批發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）：（NH4）2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0，酵母撮物1.0，葡萄糖 35；pH 7.0，裝液量 1.5 L/3 L。

固體培養(yǎng)基是在此基礎(chǔ)上添加2.0 g/L瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 血紅素合成途徑2個(gè)模塊的相關(guān)表達(dá)載體構(gòu)建 以E.coliDH5α基因組為模板分別擴(kuò)增hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH基因，然后以融合PCR將hemC和hemD片段融合為hemC-hemD，將hemG和hemH片段融合為hemG-hemH。引物表2所示。

表2 引物Table 2 Primers used in this study

利用酶切位點(diǎn)PstⅠ和HindⅢ將片段hemC-hemD分別與表達(dá)載體pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2連接，獲得重組載體pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD。通過(guò)BamHⅠ和SacⅠ將片段hemB分別與載體pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD連接，得到重組載體pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD。將擴(kuò)增得到的hemE片段通過(guò)酶切位點(diǎn)NdeⅠ和XhoⅠ分別連接到pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD中，得到重組質(zhì)粒pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE。

利用酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ將從大腸桿菌基因組擴(kuò)增得到的片段hemF分別與表達(dá)載體pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2 連接，獲得重組載體pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF。通過(guò)NdeⅠ和XhoⅠ將片段hemG-hemH分別與載體pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF連接，得到重組載體pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH。

1.2.2 大腸桿菌合成血紅素相關(guān)重組工程菌株的構(gòu)建 將本實(shí)驗(yàn)室保藏的質(zhì)粒pUC19-hemA-hemL轉(zhuǎn)化菌株E.coliDH5α，得到重組菌株E.coliDH5α：pUC19-hemA-hemL。將大腸桿菌血紅素合成途徑兩個(gè)模塊的相關(guān)重組質(zhì)粒兩兩組合，轉(zhuǎn)化菌株E.coliDH5α：：pUC19-hemA-hemL， 得到重組工程菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7：

E.coli-D1：pUC19-hemA-hemL；

E.coli-D2：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D3：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D4：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D5：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D6：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D7：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH。

1.2.3 菌株培養(yǎng)條件

1）搖瓶培養(yǎng)。挑取在斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)的重組菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7， 接種于LB培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)約12 h后，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，0 h時(shí)添加0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)以及對(duì)應(yīng)的抗生素，氨芐青霉素（100μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）、鏈霉素（50 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL），37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)，4 h 時(shí)添加 100 μmol/L 的 FeSO4，周期 48 h。

2）分批培養(yǎng)。挑選已在平板上活化的重組菌株E.coli-D6，接種于LB培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)約12 h后，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量轉(zhuǎn)接到裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，0 h時(shí)添加0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)以及對(duì)應(yīng)的抗生素，氨芐青 霉素 （100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL），37 ℃，400 r/min 培養(yǎng)，4 h 時(shí)添加100 μmol/L的FeSO4，通過(guò)流加 4 mol/L的 NaOH 將發(fā)酵液的pH控制在6.5左右，發(fā)酵周期48 h。

1.2.4 分析方法

1）OD600測(cè)定。取適量發(fā)酵液于 EP管中，12000 r/min離心3 min，棄上清液，用等體積去離子水重懸菌體；重懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以去離子水為空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)600 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定細(xì)胞濃度。

2）葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定。取適量發(fā)酵液于EP管中，12000 r/min離心3 min，以適當(dāng)?shù)谋稊?shù)稀釋發(fā)酵液上清液，用SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院）檢測(cè)葡萄糖質(zhì)量濃度。

3）ALA質(zhì)量濃度測(cè)定。ALA質(zhì)量濃度測(cè)定采用Mauzerall和Granick的分光光度法[27]：取適量發(fā)酵液于EP管中，12000 r/min離心3 min，以適當(dāng)?shù)谋稊?shù)稀釋發(fā)酵液上清液。取稀釋液300 μL，分別加入400 μL的乙酸鈉緩沖液（稱(chēng)取82 g無(wú)水乙酸鈉，加入57 mL冰醋酸，并用去離子水定容至1 L）和35 μL的乙酰丙酮，混合均勻后煮沸反應(yīng)10 min。冷卻至室溫，再加入 Modified Ehrlich’s reagent試劑（稱(chēng)取1 g對(duì)二甲氨基苯甲醛，加入體積分?jǐn)?shù)70%高氯酸8 mL，并用冰醋酸定容至50 mL）反應(yīng)10 min，在紫外分光光度計(jì)556 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光值，然后根據(jù)不同濃度的ALA標(biāo)準(zhǔn)樣品在556 nm波長(zhǎng)下的吸光值計(jì)算出樣品ALA的質(zhì)量濃度。

4）膽色素原質(zhì)量濃度測(cè)定[27]。取等OD發(fā)酵液于EP管中，4℃，12000 r/min離心5 min，棄上清液；用0.25 mol/L的磷酸氫二鈉緩沖液（稱(chēng)取6.703 g磷酸氫二鈉，溶于100 mL去離子水中，并用0.25 mol/L的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.65）清洗2次菌體后重懸菌體，并使用超聲破碎儀破碎細(xì)胞；將細(xì)胞裂解液在4℃、12000 r/min條件下離心5 min，取裂解液上清液500 μL，加入等體積的The regular Ehrlich’s reagent試劑 （稱(chēng)取2 g對(duì)二甲氨基苯甲醛，溶于100 mL濃鹽酸），室溫反應(yīng)5 min后在紫外分光光度計(jì)554 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，然后根據(jù)不同濃度的膽色素原標(biāo)準(zhǔn)樣品在554 nm波長(zhǎng)下的吸光值計(jì)算出樣品中膽色素原的質(zhì)量濃度。

5）血紅素質(zhì)量濃度測(cè)定。血紅素質(zhì)量濃度的測(cè)定采用熒光法[28]：取適量發(fā)酵液于EP管中，12000 r/min離心3 min，棄上清液，用等體積去離子水重懸菌體，測(cè)定其OD600；準(zhǔn)備2個(gè)相同的1.5 mL EP管（其中一個(gè)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)），分別加入0.1 OD的細(xì)胞重懸液，同時(shí)加入200 mmol/L草酸溶液，將其總體積補(bǔ)足至500 μL，然后加入2 mol/L草酸溶液500 μL，混合均勻后迅速在100℃條件下反應(yīng)30 min，對(duì)照組放置在室溫條件下。待樣品自然冷卻后在12000 r/min條件下離心5 min，取200 μL上清液于黑色96孔板中，在酶標(biāo)儀中測(cè)定樣品和對(duì)照組的熒光值，其中血紅素?zé)晒鉁y(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm。根據(jù)不同濃度血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光值計(jì)算出樣品中血紅素的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 血紅素合成途徑分析與模塊化構(gòu)建

在微生物代謝和工業(yè)生物技術(shù)中，如何找到一種高效的方法解決微生物代謝途徑中代謝流的平衡已成為一個(gè)難題。傳統(tǒng)的理性設(shè)計(jì)策略往往不能對(duì)細(xì)胞代謝有一個(gè)整體把握；而組合方法雖然覆蓋面較廣，但是需要進(jìn)行高通量篩選。對(duì)此，Bradley等[24]提出一個(gè)多模塊代謝工程改造理論（multivariate modular metabolic engineering，MMME），將代謝途徑中的關(guān)鍵酶分為特定的模塊，同時(shí)通過(guò)控制不同模塊的表達(dá)水平來(lái)平衡代謝途徑中的代謝流。由于MMME方法簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛，已逐漸成為代謝工程和工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中重要的改造手段。

根據(jù)Gunhild等[29]對(duì)血紅素合成途徑中酶分子結(jié)構(gòu)和功能的分析，血紅素合成途徑中的中間產(chǎn)物不穩(wěn)定，所有的卟啉原類(lèi)物質(zhì)會(huì)快速氧化成相關(guān)的卟啉類(lèi)物質(zhì)，因此可以推測(cè)血紅素合成途徑中的酶分子之間可能存在相關(guān)作用。例如，為了避免尿卟啉原Ⅰ的積累，HemC和HemD可能會(huì)形成一個(gè)蛋白復(fù)合體，而且在細(xì)菌中，編碼HemC和HemD的基因是由同一個(gè)操縱子操控的；在HemH作用下將鐵離子螯合進(jìn)原卟啉Ⅸ內(nèi)部的這個(gè)過(guò)程中需要HemG的參與[30]，因此推測(cè)HemG和HemH之間會(huì)形成一個(gè)蛋白復(fù)合體，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已經(jīng)在藍(lán)細(xì)菌中驗(yàn)證HemG與HemH的蛋白復(fù)合體的存在[31]。在本研究中為了保證血紅素合成的前體物質(zhì)ALA的質(zhì)量濃度，將ALA合成的關(guān)鍵基因hemAs和hemL劃分為第一模塊，用pUC19質(zhì)粒過(guò)量表達(dá)；為了優(yōu)化大腸桿菌中血紅素合成途徑的相關(guān)基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH，將 這7 個(gè)基因分為 2 個(gè)模塊，hemB、hemC、hemD、hemE基因?yàn)榈诙K，hemF、hemG、hemH為第三模塊，并使用3個(gè)兼容質(zhì)粒pRSFDuet-2（高拷貝質(zhì)粒）、pCDFDuet-2（中低拷貝質(zhì)粒）和 pACYCDuet-2（低拷貝質(zhì)粒），對(duì)第二、第三模塊中的基因進(jìn)行組裝優(yōu)化表達(dá)（圖1），考察其對(duì)血紅素產(chǎn)量的影響。

以E.coliDH5α基因組為模板分別擴(kuò)增hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH基因，同時(shí)將片段hemC、hemD融合為hemC-hemD，片段hemG、hemH融合成hemG-hemH，得到基因片段凝膠電泳圖如圖2所示。將上述各基因片段連接到TVector pMD19（Simple）上，測(cè)序正確后，將質(zhì)粒雙酶切，得到的各重組基因片段與經(jīng)過(guò)相同酶切位點(diǎn)處理后的表達(dá)載體連接，構(gòu)建一系列重組載體。

2.2 血紅素合成途徑優(yōu)化與血紅素的強(qiáng)化

將構(gòu)建好的重組載體兩兩組合，轉(zhuǎn)入含有pUC19-hemAs-hemL質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α中，得到重組菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)4 h后添加100 μmol/L Fe2+，測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況、ALA積累量、膽色素原質(zhì)量濃度和血紅素產(chǎn)量。如圖3所示，血紅素產(chǎn)量越高，重組菌的發(fā)酵液顏色越紅；其中，重組菌E.coli-D2用高拷貝質(zhì)粒表達(dá)第二模塊的基因，用中低拷貝質(zhì)粒表達(dá)第三模塊的基因時(shí)，其生物量遠(yuǎn)低于其他菌株，可能是由于基因hemG的產(chǎn)物原卟啉Ⅸ的過(guò)量積累對(duì)細(xì)胞具有毒害作用[32]；而且過(guò)量表達(dá)ALA下游途徑的基因后，ALA產(chǎn)量與重組菌E.coli-D1（沒(méi)有過(guò)量表達(dá)ALA下游途徑基因）相比，明顯下降；同時(shí)檢測(cè)了表達(dá)基因hemB后的產(chǎn)物PBG，發(fā)現(xiàn)各重組菌株的PBG產(chǎn)量沒(méi)有明顯差異，推測(cè)可能是HemB蛋白比較穩(wěn)定，并不是血紅素合成途徑中的限速酶；另外，從圖3（e）中可以看出，用中低拷貝質(zhì)粒表達(dá)第二模塊的基因，血紅素產(chǎn)量較高，其中6號(hào)菌株用低拷貝質(zhì)粒表達(dá)第二模塊的基因，用高拷貝表達(dá)第三模塊的基因，其血紅素產(chǎn)量最高，達(dá)到0.56 μmol/（L·OD）。

圖3 血紅素合成途徑基因分模塊表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響Fig.3 Effect of expression of genes in heme biosynthesis pathway on cell metabolism

2.3 血紅素分批發(fā)酵

選擇搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中血紅素產(chǎn)量最高的重組菌株E.coli-D6，進(jìn)一步驗(yàn)證其合成血紅素的能力，將E.coli-D6在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大培養(yǎng)，同樣在培養(yǎng)4 h后添加100 μmol/L Fe2+，發(fā)酵過(guò)程參數(shù)變化如圖4所示。

圖4 重組菌株E.coli-D6在3 L發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)合成血紅素Fig.4 Batch fermentation of heme by the recombinant strain E.coli-6 in a 3 L fermentor

從圖4可以看出，12 h后葡萄糖開(kāi)始大量被消耗，重組菌株開(kāi)始大量積累ALA，40 h左右ALA產(chǎn)量最高，達(dá)到3865 mg/L，隨著血紅素在菌體生長(zhǎng)后期的積累，ALA開(kāi)始消耗，產(chǎn)量慢慢下降，在48 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，ALA產(chǎn)量剩余2789 mg/L；28 h后，重組菌株開(kāi)始大量合成血紅素，在發(fā)酵48 h時(shí)，此時(shí)葡萄糖幾乎完全耗盡，血紅素產(chǎn)量最高，達(dá)到0.954 μmol/（L·OD），與搖瓶水平上血紅素的產(chǎn)量相比，提高了約70%。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，ALA大量積累，雖然后期隨著血紅素的積累，ALA開(kāi)始消耗，但是明顯從ALA到血紅素的轉(zhuǎn)化率仍然很低。血紅素的合成途徑中存在其他競(jìng)爭(zhēng)的分支途徑，研究表明，HMB自發(fā)環(huán)化形成糞卟啉原Ⅰ以及原卟啉到血紅素的轉(zhuǎn)化率低是血紅素合成過(guò)程中的限速步驟[1]。如何進(jìn)一步提高ALA到血紅素的轉(zhuǎn)化率可作為下一步研究的重點(diǎn)。

3 結(jié) 語(yǔ)

血紅素合成途徑復(fù)雜且受?chē)?yán)格調(diào)控，目前關(guān)于血紅素合成方面的研究比較少。本研究通過(guò)將來(lái)源大腸桿菌的血紅素合成途徑基因分成2個(gè)模塊，利用拷貝數(shù)不同的質(zhì)粒，將2個(gè)模塊隨機(jī)組合，在過(guò)量表達(dá)谷氨酰-tRNA還原酶（hemA編碼）、谷氨醛氨基轉(zhuǎn)移酶（hemL編碼）的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化了血紅素合成途徑。本研究構(gòu)建的重組大腸桿菌工程菌E.coli-D6：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h，生產(chǎn)血紅素0.56 μmol/（L·OD）。 在 3 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，其血紅素濃度達(dá)到 0.954 μmol/（L·OD）， 比搖瓶上提高了70%。采用代謝工程策略，改造微生物菌株來(lái)合成目的產(chǎn)物血紅素，有效提高了血紅素產(chǎn)量。