入侵植物黃頂菊的植物學性狀和種子傳播特性觀察及ITS分子鑒定

陳 曦， 李新臣， 宋小玲， 強 勝， 戴偉民

(南京農(nóng)業(yè)大學雜草研究室， 江蘇 南京 210095)

黃頂菊在2001年入侵中國河北和天津，引起了國內(nèi)學者的廣泛關(guān)注[7-11]。李香菊等[9]將河北境內(nèi)的黃頂菊與Powell[2]描述的黃頂菊形態(tài)特征進行對比，推測入侵河北的黃頂菊可能是黃頂菊屬的一個新的種間雜交種。白藝珍等[12]發(fā)現(xiàn)，黃頂菊在中國的潛在適生區(qū)域集中分布于廣東、廣西、云南、海南、福建、臺灣、江西、湖南、貴州、四川、重慶、湖北、安徽、江蘇和上海，其中高風險區(qū)域包括廣東、廣西、臺灣、海南、福建、云南、四川、貴州和重慶等地，表明華南和西南地區(qū)比北方地區(qū)更適合黃頂菊生長。目前，黃頂菊的入侵范圍已逐漸擴大到華北地區(qū)，即山東、河南、河北、天津和北京，有些野外發(fā)生點已緊鄰江蘇[10]。作者所在課題組在南京的溫室中種植黃頂菊，發(fā)現(xiàn)黃頂菊能夠在南京完成整個生活史。

對于入侵植物，尤其是一年生入侵植物，種子傳播是其入侵成功與擴散的關(guān)鍵[13]，快速準確鑒定入侵植物和掌握其種子傳播特性，有利于制定入侵植物的防控措施；而ITS序列因其穩(wěn)定性被廣泛應用于屬內(nèi)及種間關(guān)系的研究[14-15]，利用ITS序列分析可明確入侵中國的黃頂菊的分類地位，從而達到快速鑒定的目的。為此，作者以入侵天津的黃頂菊植株為研究對象，進行植物學性狀觀察和統(tǒng)計，研究黃頂菊種子的傳播特性，并對其ITS序列進行測定和系統(tǒng)進化樹分析，以期為黃頂菊的快速準確鑒定以及制定有效的防控措施提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試35株黃頂菊植株分別于2017年11月和2018年1月采自天津靜海區(qū)環(huán)湖北路，具體地理坐標為北緯38°57′25″、東經(jīng)117°07′41″。該區(qū)域?qū)儆谂瘻貛О霛駶櫞箨懶约撅L氣候，四季分明，年均溫約14.5 ℃，年均降水量552.5 mm。

在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓科研基地(北緯32°01′17″、東經(jīng)118°51′08″)采集加拿大一枝黃花(SolidagocanadensisLinn.)4株、紫莖澤蘭〔Ageratinaadenophora(Spreng.) R. M. King et H. Rob.〕4株、勝紅薊(AgeratumconyzoidesLinn.)3株和萬壽菊(TageteserectaLinn.)3株，用于ITS序列分析；其中，前3種為國內(nèi)常見菊科入侵種，萬壽菊為栽培種。該區(qū)域?qū)儆诒眮啛釒駶櫄夂颍募痉置?，年均溫約18 ℃，年均降水量1 081.4 mm。

1.2 方法

1.2.1 植物學性狀觀察和統(tǒng)計 于2017年11月下旬，在天津靜海區(qū)環(huán)湖北路黃頂菊種群(發(fā)生面積約1 333.3 m2)中隨機采集黃頂菊成熟植株，觀察植株生境，并測量株高、莖直徑(距地面30 cm處)和根系形態(tài)。之后將植株帶回實驗室，取下所有蝎尾狀花序分別放于塑料袋中，將種子由蝎尾狀花序中剝離后分別放于紙袋中，常溫保存、備用。于2017年12月，在南京農(nóng)業(yè)大學雜草研究室中統(tǒng)計黃頂菊花序和種子的生物學性狀，包括小花數(shù)、飽滿種子數(shù)和結(jié)實率以及種子的千粒質(zhì)量、萌發(fā)勢和萌發(fā)率。根據(jù)公式“結(jié)實率=(飽滿種子數(shù)/總種子數(shù))×100%”計算種子結(jié)實率；采用萬分之一電子天平稱量種子千粒質(zhì)量。

在墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中均勻撒入100粒成熟飽滿的種子，加入10 mL去離子水，共5皿，視為5次重復；密封后置于XZ型智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度25 ℃、光照時間12 h·d-1、光照強度120 μmol·m-2·s-1。以種子胚根長度大于種子長度的50%視為種子萌發(fā)標準，分別在培養(yǎng)3和7 d時統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)，計算種子萌發(fā)勢和萌發(fā)率(分別為培養(yǎng)3和7 d時發(fā)芽種子數(shù)占總種子數(shù)的百分比)。

于2018年3月取約1 500粒成熟飽滿的種子，播種于南京農(nóng)業(yè)大學牌樓科研基地；在蝎尾狀花序形成后的0、3、5、7和10 d，分別取5個蝎尾狀花序正中間的頭狀花序，觀察花序發(fā)育過程，并制做管狀花子房縱切面的石蠟切片[16]。采用Olympus SZX7型體視鏡(日本Olympus公司)觀察管狀花和舌狀花的子房；采用Olympus BH4型顯微鏡(日本Olympus公司)觀察石蠟切片，每個時期觀察約50個視野；采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件拍照。

1.2.2 種子傳播特性研究 采用郝建華等[17]的方法測定不同風力條件下黃頂菊種子的水平漂移距離。用風扇(直徑250 mm、高80 cm)作為風源，釋放風速0.7、1.5、2.2和3.5 m·s-1的穩(wěn)定水平風；在風扇前方的降落區(qū)域內(nèi)固定擺放白色紙板，用鑷子輕輕夾住25粒成熟飽滿的種子，在風源前釋放，用卷尺(精度1 mm)測量種子在順風條件下的水平漂移距離。采用AT816數(shù)字風速儀(深圳市?，斢⒑蕾Q(mào)易有限公司)測定風速。每次隨機選取100粒成熟飽滿的種子進行測定，3次重復。

只要知道非線性控制系統(tǒng)的狀態(tài)方程,且f(x(t),u(t),t)的各階導數(shù)均存在,就可以根據(jù)上述公式求出狀態(tài)向量的逐次近似解,并且無窮級數(shù)解的極限函數(shù)即為非線性控制系統(tǒng)狀態(tài)方程的精確解.上式可改寫為：

在3 L蒸餾水中輕輕放入100粒成熟飽滿的種子，分別于靜止和攪拌條件下觀察漂浮種子數(shù)量，每處理3次重復。采用MS-H280-Pro磁力攪拌器(美國Scilogex公司)進行攪拌處理，于轉(zhuǎn)速200 r·min-1條件下攪拌5 s，每6 h攪拌1次；每6 h觀察水分蒸發(fā)情況，并加入蒸餾水補足至3 L。分別于處理的0、6、12、18、24、30和36 h后統(tǒng)計漂浮種子的數(shù)量。

1.2.3 葉片DNA提取及ITS片段擴增和測序 于2018年4月在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓科研基地分別采集黃頂菊及上述4種菊科植物的新鮮幼嫩葉片約300 mg，用液氮充分研磨后，采用植物DNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司出品〕提取葉片DNA，操作參照試劑盒說明書。

根據(jù)文獻[18]設(shè)計上游引物以及下游引物，上游引物ITS1的序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4的序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。以葉片DNA為模板進行PCR擴增，反應體系總體積20.0 μL，包含2×PCR Master Mix〔購自生工生物工程(上海)股份有限公司〕10.0 μL、10 nmol·mL-1正向引物和反向引物各2.0 μL、1.0 g·μL-1模板DNA 1.0 μL和雙蒸水 5.0 μL。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物于4 ℃保存。取擴增產(chǎn)物各1.5 μL，用含0.5 μg·mL-1EB的質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠對其純度進行電泳檢測，并由南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS 19.0軟件計算數(shù)據(jù)的平均值和標準誤；采用EXCEL 2013軟件進行統(tǒng)計和作圖；采用Duncan’s新復極差法進行顯著性檢驗。

采用MEGA 7.0軟件，基于文獻[15，19-20]，從NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中下載已公布的黃頂菊屬及其近緣屬植物的111條ITS序列，結(jié)合本研究獲得的黃頂菊和其他4種菊科植物的ITS序列，分別用鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)和最小進化法(ME)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用自舉檢驗法檢驗各分支的可靠性，共1 000次循環(huán)；建立系統(tǒng)進化樹時，空缺(gap)作缺失(missing)處理。

2 結(jié)果和分析

2.1 黃頂菊的植物學性狀及其管狀花和舌狀花的發(fā)育過程

黃頂菊植株的形態(tài)特征以及花序發(fā)育過程和縱切面解剖結(jié)構(gòu)見圖1。

觀察和統(tǒng)計結(jié)果顯示：黃頂菊株高0.3～2.0 m，距地面30 cm處的莖直徑1.62～5.45 mm；根系發(fā)達，為主根系植株，但主根欠發(fā)達而須根發(fā)達(圖1-A，B)。黃頂菊的花序為頭狀花序聚合而成的蝎尾狀花序，每個頭狀花序包含小花1～20朵，其中，舌狀花1朵、管狀花0～19朵(圖1-C，D，E)。黃頂菊邊緣舌狀花為黃色，雌性可育，具有舌狀花冠，合瓣花，花冠下部連合(呈筒狀)，上部連合(呈扁平舌狀)；管狀花為黃色，兩性可育，花冠連合(呈管狀)，緣部5裂，管狀花的雄蕊位于花冠的內(nèi)方，花絲頂端有5個條形花粉囊組成的花藥，雌蕊位于花的中央。成熟種子黑色、披針狀、扁平、無冠毛，種皮具10棱痕(圖1-F)。黃頂菊單株有小花8 302朵，飽滿種子6 698粒，結(jié)實率為80.7%，種子千粒質(zhì)量為0.224 0 g，種子萌發(fā)勢和萌發(fā)率分別為86.0%和98.6%。

A： 群落Community； B： 單株Individual； C，D： 蝎尾狀花序形態(tài)Morphology of scorpioid inflorescence； E： 頭狀花序形態(tài)Morphology of capitulum； F： 成熟種子Mature seed； G： 管狀花的下位子房發(fā)育過程Development process of inferior ovary of tubular floret； H： 舌狀花的下位子房發(fā)育過程Development process of inferior ovary of ray floret； I： 管狀花子房縱切面的解剖結(jié)構(gòu) Anatomic structure of longitudinal section of ovary in tubular floret. 圖1 黃頂菊植株和花序的形態(tài)及其管狀花和舌狀花的發(fā)育過程Fig. 1 Morphology of plant and inflorescence of Flaveria bidentis (Linn.) Kuntze and development processes of its tubular floret and ray floret

當黃頂菊的蝎尾狀花序形成后，隨著時間的推移，管狀花和舌狀花均逐漸發(fā)育。管狀花的黃色花冠逐漸伸長，柱頭露出后展開為鴨舌二裂狀，下位子房顏色由淺綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?，最終變?yōu)楹谏挛蛔臃康男螤钜灿蓹E球狀逐漸伸長至披針狀(圖1-G)。舌狀花的下位子房由淺綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨罱K變?yōu)楹谏?，披針狀下位子房逐漸伸長并加粗(圖1-H)。管狀花和舌狀花的下位子房均發(fā)育出細胞型胚乳，在初生胚乳分裂后即產(chǎn)生細胞壁，形成胚乳細胞(圖1-I)管狀花和舌狀花均可結(jié)實，二者的種子在形態(tài)和活力上無明顯差異。

2.2 黃頂菊種子的傳播特性

2.2.1 風傳播特性 在不同風速下黃頂菊種子水平漂移距離見圖2。結(jié)果顯示：在0.7～3.5 m·s-1風速范圍內(nèi)，隨風速增大黃頂菊種子的水平漂移距離逐漸增大，且差異顯著(P<0.05)。其中，在0.7 m·s-1風速(相當于自然界中一級風)下，種子的水平漂移距離最小，僅為19.46 cm；在3.5 m·s-1風速(相當于自然界中三級風)下，種子的水平漂移距離最大，達到60.54 cm，顯示黃頂菊種子具有隨風傳播能力。

2.2.2 水漂浮性 在靜止和攪拌條件下，經(jīng)不同浸泡時間后黃頂菊漂浮種子數(shù)的差異見表1。結(jié)果顯示：浸泡6～36 h，靜止與攪拌處理的漂浮種子數(shù)差異明顯。在攪拌條件下，隨攪拌次數(shù)和浸泡時間的增加，漂浮種子數(shù)逐漸減少，浸泡36 h(6次攪拌)后已無漂浮種子。在靜止條件下，浸泡36 h后仍無種子下沉，漂浮種子數(shù)保持恒定，顯示黃頂菊種子具有長時間的漂浮能力和隨水流長距離傳播的可能性。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.圖2 不同風速下黃頂菊種子的水平漂移距離Fig. 2 Horizontal dispersal distance of seed of Flaveria bidentis (Linn.) Kuntze at different wind speeds

處理Treatment不同浸泡時間的漂浮種子數(shù)1) Number of floating seed at different soaking times1)0 h6 h12 h18 h24 h30 h36 h靜止Motionless100.0±0.0a100.0±0.0a100.0±0.0a100.0±0.0a100.0±0.0a100.0±0.0a100.0±0.0a攪拌Stirring100.0±0.0a76.0±4.6b24.0±3.6c10.0±2.0d7.3±1.5d0.7±0.6d0.0±0.0d

1)同行中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases in the same row indicate the significant (P<0.05) difference.

2.3 黃頂菊葉片ITS片段測序及其遺傳關(guān)系分析

對供試的黃頂菊單株以及加拿大一枝黃花、紫莖澤蘭、勝紅薊和萬壽菊單株葉片的ITS片段進行擴增，結(jié)果見圖3。對獲得的ITS片段進行測序，結(jié)果顯示：黃頂菊、加拿大一枝黃花、紫莖澤蘭、勝紅薊和萬壽菊的ITS片段的平均長度分別為682、661、674、693和686 bp，各片段序列已登錄至GenBank。其中，3株黃頂菊的ITS序列登錄號分別為MK729066、MK729067和MK729068，4株加拿大一枝黃花的ITS序列登錄號分別為MK729073、MK729074、MK729075和MK729076，4株紫莖澤蘭的ITS序列登錄號分別為MK729069、MK729070、MK729071和MK729072，3株勝紅薊的ITS序列登錄號分別為MK729087、MK729088和MK729089，3株萬壽菊的ITS序列登錄號分別為MK731978、MK731979和MK731980。

基于上述5種植物的17條ITS序列，并從NCBI查詢獲得黃頂菊屬及其近緣屬植物的111條ITS序列，對ITS序列的堿基位點進行比對，結(jié)果顯示：與其他植物相比，供試黃頂菊的ITS序列含有變異位點310個、簡約信息位點284個、保守位點242個和自裔位點26個；T(U)、C、A和G的堿基數(shù)分別占堿基總數(shù)的26.6%、23.6%、24.0%和25.8%。供試黃頂菊與原產(chǎn)地黃頂菊的ITS序列完全一致。

采用鄰接法、最大似然法和最小進化法分別構(gòu)建系統(tǒng)進化樹， 3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中各樣本的系統(tǒng)關(guān)系基本一致。從NJ系統(tǒng)進化樹(圖4)上可見：供試黃頂菊與原產(chǎn)地黃頂菊的遺傳距離最近，而與其他4種供試菊科植物以及黃頂菊屬及其近緣屬植物的遺傳距離均較遠。

M： DNA marker； 1-3： 黃頂菊Flaveria bidentis (Linn.) Kuntze； 4-7： 加拿大一枝黃花Solidago canadensis Linn.； 8-11： 紫莖澤蘭Ageratina adenophora (Spreng.) R. M. King et H. Rob.； 12-14： 勝紅薊Ageratum conyzoides Linn.； 15-17： 萬壽菊Tagetes erecta Linn.圖3 黃頂菊及其他4種菊科植物的ITS片段擴增圖譜Fig. 3 ITS fragment amplification map of Flaveria bidentis (Linn.) Kuntze and other four species in Asteraceae

實線框內(nèi)樣本為供試黃頂菊以及產(chǎn)自南美洲的黃頂菊Samplings in solid box are the tested ones of Flaveria bidentis (Linn.) Kuntze and the ones from South America； 虛線框內(nèi)樣本為供試的加拿大一枝黃花、紫莖澤蘭、勝紅薊和萬壽菊Samplings in dashed box are the tested ones of Solidago canadensis Linn.， Ageratina adenophora (Spreng.) R. M. King et H. Rob.， Ageratum conyzoides Linn. and Tagetes erecta Linn. 分支上的數(shù)據(jù)為自展支持率 The data on the branches indicate the bootstrap values.圖4 基于ITS序列構(gòu)建的黃頂菊及菊科其他植物的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 4 NJ phylogenetic tree of Flaveria bidentis (Linn.) Kuntze and other species in Asteraceae based on ITS sequence

3 討論和結(jié)論

3.1 供試黃頂菊與原產(chǎn)地黃頂菊的形態(tài)特征差異

Powell[2]對原產(chǎn)地黃頂菊形態(tài)的描述為：一年生草本；株高100 cm；莖被短絨毛；葉藍綠色，無毛或密被短柔毛，披針狀、橢圓形，有鋸齒或刺狀鋸齒；頭狀花序總苞片一般為3(4)，每個頭狀花序包含小花2～9朵，其中，舌狀花0～1朵、管狀花2～8朵。劉全儒[8]和李香菊等[9]通過觀察和比較，認為中國出現(xiàn)的黃頂菊莖和葉的形態(tài)特征與原產(chǎn)地基本一致，但株高、頭狀花序總苞片數(shù)以及頭狀花序所包含的管狀花數(shù)均高于原產(chǎn)地。本研究結(jié)果顯示：天津的黃頂菊根、莖、葉的形態(tài)特征與劉全儒[8]和李香菊等[9]的描述較為一致，且管狀花數(shù)(0～19朵)也多于原產(chǎn)地。導致這種現(xiàn)象的可能原因有2個：一是黃頂菊在中國的入侵地的地理位置與原產(chǎn)地有較大差異，導致其遺傳分化，表現(xiàn)出植株變高、小花數(shù)增加，以適應入侵地的生境；二是屬內(nèi)種間易雜交導致形態(tài)的變化[9]。ITS序列分析結(jié)果表明：在NJ系統(tǒng)進化樹上，供試黃頂菊與原產(chǎn)地黃頂菊的遺傳距離最近，而與其他4種供試菊科植物以及黃頂菊屬及其近緣屬植物的遺傳距離均較遠。說明入侵天津后黃頂菊形態(tài)上的變化是其對入侵地生境適應的結(jié)果，并非雜交產(chǎn)生的遺傳變異。

3.2 黃頂菊種子的傳播特性

作為一年生菊科入侵植物，黃頂菊的危害性極大，其單株最高可產(chǎn)生30多萬粒種子[21]。自2001年發(fā)現(xiàn)黃頂菊入侵中國[8，22]后，盡管采取了多種防控措施，但由于其傳播方式不明確，依然呈現(xiàn)入侵面積逐漸擴大的趨勢。雖然本研究測定的種子數(shù)較少，但隨機測定的結(jié)實總量依然達到每株近萬粒飽滿種子，萌發(fā)率高達98.6%，對入侵地的生態(tài)環(huán)境造成極大威脅。此外，本文測定的種子數(shù)偏少可能是由于不同的生長環(huán)境和地點，植株的結(jié)實量不同。

郝建華等[17]對10種菊科外來種類的研究結(jié)果表明：在風的作用下，對種子水平漂移距離影響最大的因子是連萼種子的質(zhì)量和冠毛長度。本研究中，黃頂菊種子在3.5 m·s-1風速(相當于自然界中三級風)下水平漂移距離在1 m以下，與黃頂菊種子無冠毛且種子質(zhì)量較大有關(guān)。黃頂菊種子的這一傳播特性也是其自入侵中國以來目前仍主要分布于華北地區(qū)的原因之一。陸秀君等[23]認為，在持續(xù)浸泡3個月后，黃頂菊的種子仍有約10%的萌發(fā)力。本研究結(jié)果表明：黃頂菊種子的漂浮能力較強，且在靜水狀態(tài)下其種子能維持較高的萌發(fā)率。據(jù)此推測黃頂菊種子一旦隨風擴散到水流的上游，很可能隨水流傳播到下游各處，并依靠其種子數(shù)量大、活力強的繁殖特性而快速定植，從而對入侵地的鄉(xiāng)土植物產(chǎn)生危害。

3.3 黃頂菊的防治措施

目前，對黃頂菊的防治措施主要有人工拔除、化學防除和生物防除3類：人工防除主要是利用人工對黃頂菊進行定期的拔除[24]，但這類措施用工量大，無法實施大面積的防除；化學防除主要以滅生性除草劑及激素類除草劑對黃頂菊進行防除[25]，該類措施的防除效果明顯，但大量使用則存在防治成本高且對環(huán)境有潛在危害的問題；生物防除可利用與黃頂菊具有較強競爭優(yōu)勢的植物作為其替代控制種類，從而達到防除的目的[26-30]，但替代種植過程相對緩慢，無法實現(xiàn)快速防控的目的。在植物的生殖生長階段，花期是對環(huán)境脅迫的敏感時期，同時也是決定種子產(chǎn)量的主要環(huán)節(jié)[31]。因此，對于黃頂菊這類一年生草本入侵植物，如果在其開花結(jié)實期(如花芽分化期)用低濃度花芽抑制劑進行處理，通過抑制其花芽分化降低其結(jié)實率和種子萌發(fā)力，使其不能完成整個生活史，既可以有效防止黃頂菊的大面積擴散和入侵，又能降低防治成本，從而達到綠色防治的目的。

致謝：中國農(nóng)業(yè)科學院皇甫超河研究員和河北省農(nóng)林科學院王貴啟研究員對野外采樣和調(diào)查工作提供了幫助，在此表示感謝！