斑馬魚眼部細胞凋亡模型的建立

楊 菲，華永慶，林紫微，黃天一，崔 杰，李夢雨，陳婷婷，許惠琴

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

隨著人類社會工業(yè)化及信息化的發(fā)展，不良的生活作息和環(huán)境污染等因素越來越侵害人們的健康，眼部疾病的發(fā)生率逐年上升[1]。目前，用于眼部疾病模型的研究主要集中在小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和恒河猴等哺乳動物，但由于其周期普遍較長，不利于眼部用藥的快速篩選。斑馬魚(Daniorerio)作為一種視覺高度發(fā)達的模式動物，其視網(wǎng)膜形態(tài)學結(jié)構(gòu)與人類和其他脊椎動物非常相似[2]。斑馬魚眼睛在整體中占較大比重，其胚胎透明的特性便于實驗操作以及器官可視化[3-4]。因此，模式生物斑馬魚用于眼部實驗具有優(yōu)勢。鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)作為常用的增塑劑來增大塑料的可塑性和強度。研究表明，DBP有致癌、致畸、致突變和致哮喘的作用[5]，染毒后尤其容易使機體的眼部細胞發(fā)生凋亡。本研究選用斑馬魚作為模式動物，用DBP建立眼部細胞凋亡模型，并觀察藥物的作用，以驗證模型的有效性，為眼部用藥的研究提供一種簡單快捷的評價方法。

1 材料

1.1 實驗動物斑馬魚AB品系，購于凱基生物有限公司，晝夜節(jié)律為晝 ∶夜=14 h ∶10 h；溫度(28.5±0.5)℃。

1.2 藥物與試劑DBP(純度>99.5%，源葉生物科技有限公司，批號：S51140)；N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，純度>99%，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：S0077；人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)，純度≥98%,購自源葉生物科技有限公司，批號：B21057；鏈霉蛋白酶E(Solarbio公司，批號：721J041)；吖啶橙(Acridine Orange，AO)染色液(1 g·L-1)，購自源葉生物公司，批號：R20290；MS-222(Sigma, 批號: MKBV1603V)；亞甲藍(Solarbio公司)。

1.3 儀器M205FA體式熒光顯微鏡(Leica公司)；SPX-150生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)。

2 方法

2.1 藥物溶液的配制

2.1.1胚胎培養(yǎng)液 量取純水1 000 mL，加鹽水調(diào)節(jié)電導率至550～580 μs·cm-1，加入0.1 g·L-1亞甲藍溶液1 mL，混合均勻，即得。

2.1.2DBP儲備液 精密稱取21 mg DBP，加胚胎培養(yǎng)液至7.54 mL，即得10 mmol·L-1DBP儲備液，置于4 ℃冰箱備用，使用時，用胚胎培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.1.3NAC儲備液 精密稱取16.27 mg NAC，加胚胎培養(yǎng)液至1.994 mL，即得500 mmol·L-1NAC儲備液，置于4 ℃冰箱備用，使用時，用胚胎培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.1.4Rg1儲備液 精密稱取20 mg人參皂苷Rg1，加胚胎培養(yǎng)液至2.497 mL，即得10 mmol·L-1Rg1儲備液，置于4 ℃冰箱備用，使用時，用胚胎培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.1.5鏈酶蛋白酶E溶液 精密稱取25 mg鏈酶蛋白酶E粉末，置于50 mL胚胎培養(yǎng)液中，待完全溶解，即為0.5 g·L-1鏈酶蛋白酶E溶液。

2.1.6AO溶液 取50 μL AO染色液(1 g·L-1)，加9.95 mL胚胎培養(yǎng)液稀釋至5 mg·L-1。

2.1.7麻醉劑 精密稱取三卡因粉末400 mg，加入Tris緩沖液(調(diào)至pH 7)，再加入超純水至100 mL，混合均勻，得三卡因儲存液，儲存于4 ℃冰箱，用時量取三卡因儲存液4.2 mL，加入超純水至100 mL，混合均勻，即得。

2.2 DBP對斑馬魚存活率的影響將挑選好的正常胚胎置于6孔板中，每孔20枚，并加入3 mL胚胎培養(yǎng)基，從受精后30 h(hpf)開始加入各濃度DBP(0.1、10、50、100 μmol·L-1)，在正常環(huán)境下培養(yǎng)42 h，于18 h和42 h觀察死亡胚胎數(shù)目，上述實驗平行重復3次，數(shù)據(jù)匯總后統(tǒng)計存活率。

2.3 DBP誘導眼部細胞凋亡模型將挑選好的正常胚胎置于6孔板中，每孔12枚，并加入3 mL胚胎培養(yǎng)基，從受精后30 h或54 h開始，吸盡胚胎培養(yǎng)基，分別加入各濃度DBP(0.1、1、5、10、50 μmol·L-1)，在直射光(54-324 lux)或非直射光條件下繼續(xù)培養(yǎng)18 h，上述實驗平行重復3次。AO染色，并在體式顯微鏡下觀察，眼部綠色熒光顯示為凋亡細胞，采集圖片并進行數(shù)據(jù)處理。

2.4 給藥方式將正常斑馬魚胚胎置于6孔板中，每孔12枚魚卵，并給予3 mL胚胎培養(yǎng)基飼養(yǎng)至30 hpf，吸盡培養(yǎng)基；分組，空白對照組加入3 mL胚胎培養(yǎng)基，模型組加入3 mL 10 μmol·L-1DBP，6個給藥組每孔除加入1.5 mL 20 μmol·L-1DBP外，分別加入1.5 mL NAC(0.2、2 mmol·L-1)以及人參皂苷Rg1(0.2、2、10、100 μmol·L-1)，共培養(yǎng)18 h，上述實驗平行重復3次。AO染色，并在體式顯微鏡下觀察眼部凋亡細胞，采集圖片并進行數(shù)據(jù)處理。

Fig 1 Effect of 18 h(A) and 42 h(B) DBP treatmenton survival rate of

A:Control;B:0.1 μmol·L-1DBP;C:10 μmol·L-1DBP;D:50 μmol·L-1DBP;E:100 μmol·L-1DBP.**P<0.01vscontrol group

A:Control;B:0.1 μmol·L-1DBP;C:1 μmol·L-1DBP;D:5 μmol·L-1DBP;E:10 μmol·L-1DBP;F:50 μmol·L-1DBP

2.5 圖片采集及數(shù)據(jù)處理將胚胎放在有0.5 g·L-1蛋白酶E溶液的培養(yǎng)皿中，在室溫下放置8 min；當胚胎有個別開始脫膜時，立即加入胚胎培養(yǎng)液稀釋，終止脫膜，迅速將脫膜后的胚胎移入干凈的培養(yǎng)皿中，漂洗2遍后，用5 mg·L-1AO溶液在暗室中染色1 h，進而用胚胎培養(yǎng)液漂洗3次，每次5 min，然后用2 mL 0.04 g·L-1的MS-222麻醉5 min，置載玻片上，于體式熒光顯微鏡下鏡檢拍照，采用ImageJ軟件對斑馬魚眼部凋亡細胞數(shù)進行統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度DBP對斑馬魚存活率的影響為確定DBP對斑馬魚存活率的影響，在30 hpf后加入0.1、10、50、100 μmol·L-1DBP。加入DBP后18、42 h統(tǒng)計斑馬魚存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 1)，30 hpf的斑馬魚給予濃度低于10 μmol·L-1的DBP，在42 h內(nèi)不影響幼魚存活率，50、100 μmol·L-1DBP以時間-劑量依賴的方式降低存活率(P<0.01)。

3.2 不同濃度DBP對30 hpf的斑馬魚眼部細胞凋亡的影響為觀察DBP對斑馬魚眼部細胞凋亡的影響，在30 hpf的斑馬魚培養(yǎng)基中加入0.1、1、5、10、50 μmol·L-1DBP共培養(yǎng)18 h，即斑馬魚受精48 h后，發(fā)現(xiàn)0.1、1、5 μmol·L-1DBP組模型效果不穩(wěn)定，10、50 μmol·L-1DBP誘導斑馬魚眼部凋亡作用最為明顯(P<0.01)，見Fig 2。

3.3 不同濃度DBP對54 hpf的斑馬魚眼部細胞凋亡的影響在上述實驗中，實驗結(jié)束時間為受精后48 h，斑馬魚幼魚還未完全出卵，拍照前需要用鏈霉蛋白酶E破卵。為了排除其影響，延長造模前的培養(yǎng)時間，選擇54 hpf的斑馬魚進行DBP造模18 h，即斑馬魚受精72 h，此時斑馬魚幼魚已經(jīng)完全出卵，不需要鏈蛋白酶E破卵。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 3)，72 hpf的斑馬魚空白組眼部會產(chǎn)生自發(fā)凋亡，此時在相同造模條件下觀察，模型組與空白組比較，差異不明顯。因此，最終選擇30 hpf作為斑馬魚眼部細胞凋亡的開始造模時間。

3.4 光照對斑馬魚眼部細胞凋亡的影響為了探究斑馬魚在72 hpf生長過程中自身眼部細胞凋亡的原因，在斑馬魚的培養(yǎng)過程中采用非直射光照，探究直射光與非直射光對斑馬魚眼部細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 4)，非直射光照對斑馬魚眼部細胞凋亡沒有明顯改善作用。故在建立斑馬魚眼部細胞凋亡模型構(gòu)建過程中，可以采取正常的斑馬魚培養(yǎng)光照條件。

綜上所述，在30 hpf的斑馬魚幼魚中，10、50 μmol·L-1DBP造?？梢姼鼮槊黠@的眼部細胞凋亡，且此時空白組斑馬魚幼魚未產(chǎn)生自發(fā)性的眼部細胞凋亡，但是高濃度DBP(50 μmol·L-1)會影響斑馬魚幼魚的存活率，故最終選擇在正常溫度及光照培養(yǎng)條件下，30 hpf的斑馬魚，10 μmol·L-1DBP造模18 h，作為斑馬魚眼部細胞凋亡模型的造模條件。

A:Control;B:0.1 μmol·L-1DBP;C:1 μmol·L-1DBP;D:5 μmol·L-1DBP;E:10 μmol·L-1DBP;F:50 μmol·L-1DBP

3.5 抗凋亡藥物對斑馬魚眼部細胞凋亡的影響在30 hpf的斑馬魚培養(yǎng)基中加入10 μmol·L-1DBP與不同濃度人參皂苷Rg1或NAC共培養(yǎng)18 h。Fig 5結(jié)果表明，模型組與空白組相比，斑馬魚眼部細胞凋亡明顯(P<0.01)。與模型組相比，NAC(1 mmol·L-1)和人參皂苷Rg1(1、5、50 μmol·L-1)都能以濃度依賴的方式明顯緩解眼部細胞凋亡(P<0.05)。

4 討論

斑馬魚已成為研究脊椎動物發(fā)育和疾病遺傳機制越來越受歡迎的模式生物。70%的人類基因至少有1個斑馬魚直系同源物，84%的已知人類致病基因具有斑馬魚對應物[6]。其眼發(fā)育具有時空特異性，在受精后24 h時，循環(huán)系統(tǒng)、腦發(fā)育和眼發(fā)育形成，48 h時開始出卵膜，具有視功能，相當于人類新生兒時期[7]。在本研究中，DBP構(gòu)建斑馬魚眼部細胞凋亡模型的周期僅48 h，與用傳統(tǒng)哺乳動物造模相比，大大縮短了實驗周期，為與眼部細胞凋亡相關(guān)的眼部用藥的研究提供了快速篩選模型。另一方面，斑馬魚易于飼養(yǎng)，并可低成本大量繁殖，每對斑馬魚每周可產(chǎn)100～200只魚卵[3]，這一生殖特性極大地節(jié)約了實驗成本。

DBP已經(jīng)在多種工業(yè)使用了50多年，是最常用的增塑劑，主要用于軟質(zhì)聚氯乙烯(PVC)，在最終產(chǎn)品中最多可占40%。長期暴露于DBP會對動物產(chǎn)生發(fā)育和生殖毒性。DBP在體內(nèi)可減少超氧化物歧化酶、過氧化氫酶，升高丙二醛，造成DNA損傷，引起細胞凋亡[5]。在斑馬魚從幼魚向成魚生長過程中，DBP會導致卵黃蛋白原合成減少[8]。在斑馬魚成魚中，DBP延遲睪丸的發(fā)育，減少精子產(chǎn)生，這種影響在除去DBP，用清潔水凈化30 d后可以部分恢復[9]。在本實驗中，30 hpf的斑馬魚幼魚暴露在10 μmol·L-1DBP中，采用AO染色技術(shù)，在體式熒光顯微鏡下觀察斑馬魚眼部凋亡細胞，可見隨劑量和造模時間的增加，凋亡細胞呈綠色熒光從眼球中心由內(nèi)向外發(fā)散。在此基礎上，用抗凋亡藥物NAC和人參皂苷Rg1驗證該模型能否用于眼部用藥的藥效評價。NAC直接保護DNA免受氮芥、硫芥等烴化劑的損傷，阻止烴化劑引起的細胞凋亡，在氧化應激引起的細胞損傷中起抗凋亡作用[10]。而人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分，已有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有較好的抗凋亡、抗衰老作用[11]。NAC和人參皂苷Rg1都能夠明顯減少DBP導致的斑馬魚眼部細胞凋亡。上述實驗證實，DBP引起的眼部細胞凋亡是可被藥物逆轉(zhuǎn)的，這為斑馬魚用于眼部疾病研究的可行性及合理性提供了可靠的實驗依據(jù)。已有實驗證實，敲除斑馬魚HSF1或gdf6a基因，可造成斑馬魚眼部細胞凋亡[12-13]，但是由于基因敲除后對機體的影響未知，是否適用于眼部用藥篩選有待進一步研究。

綜上所述，應用DBP建立斑馬魚眼部細胞凋亡模型，具有靈敏、高效、便捷、低成本、周期短等特點，為眼部疾病的治療藥物研究提供新方法。