復(fù)方蜚蠊提取物PB對異體抗原聯(lián)合醋酸誘導(dǎo)大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制

盧 倩，孫敏哲，杜雯雯，劉 衡， 沈詠梅，吳桃清，趙 昱,，巫秀美

(1. 大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000；2. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，四川 成都 610000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因和發(fā)病機制尚不明確的炎癥性腸病。該病通常反復(fù)發(fā)作，發(fā)病時主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、體質(zhì)量減輕等[1]。臨床以發(fā)作、緩解及復(fù)發(fā)交替為特點，是常見的消化系統(tǒng)疾病[2]。研究表明[3]，UC的主要病理機制可能與免疫功能、細胞炎癥因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡、腸道菌群失調(diào)等有關(guān)。目前，UC的治療主要以5-氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類或免疫抑制劑類藥物為主[4]，長期用藥有一定的副作用，療效降低。研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方保留灌腸治療輕、中度UC具有明顯的療效[5]。

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)是蜚蠊科中體積最大的昆蟲，最早作為中藥記錄于神農(nóng)本草經(jīng)中，謂“性咸”、“味平”，歸肝腎脾經(jīng)，主血瘀，癥堅，具有消積生肌，清熱解毒等功效。臨床常用于小兒疳積、咽喉腫痛、蟲蛇咬傷、瘡癰腫毒、消化道潰瘍等[6]。美洲大蠊具有抗腫瘤、抗感染、提高機體免疫力、促進組織修復(fù)、抗炎鎮(zhèn)痛等多方面藥理作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，以美洲大蠊干燥蟲體的提取物為有效成分的中成藥康復(fù)新液，在臨床上保留灌腸治療UC具有明顯的療效[8]。因此，本實驗在此研究基礎(chǔ)上，將蜚蠊、蒲公英、薏苡仁、烏梅、陳皮按5 ∶2 ∶1 ∶1 ∶1組方配比，通過水提醇沉的方式獲得復(fù)方蜚蠊提取物PB，采用灌腸給藥的方法治療異體抗原聯(lián)合醋酸誘導(dǎo)的慢性UC大鼠，考察復(fù)方蜚蠊提取物PB對慢性UC的療效及作用機制，為其用于慢性UC的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物健康SPF級2月齡SD大鼠86只，♀♂各半，體質(zhì)量(200±10)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0004，飼養(yǎng)于大理大學(xué)IVC動物中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)健康家兔50只，♀♂不拘，體質(zhì)量(3.0～3.5) kg，大理大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(滇)2008-0003。

1.2 藥物與試劑復(fù)方蜚蠊提取物PB(包括蜚蠊、蒲公英、薏苡仁、烏梅、陳皮等混合提取物)(批號：20150724)，由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院張成桂副教授提供；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP)(批號：09160503)，上海信宜天平藥業(yè)有限公司；腸炎寧(批號：160303)，江西天施康弋陽制藥有限公司；冰醋酸(批號：20130114)，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；完全弗氏佐劑(批號：SLBK1733)，Sigma公司；大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(批號：R160927-102a)、白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)ELISA試劑盒(批號：R160927-002b)、IL-8 ELISA試劑盒(批號：R161025-008b)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)試劑盒(批號 R161025-101b)，均購自于欣博盛QuantiCyto?生物科技有限公司；大鼠C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)試劑盒(批號：20151215)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)試劑盒(批號：20161101)、IL-17試劑盒(批號：20161228)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒(批號：20161022)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)試劑盒(批號：20161228)、隱血試劑盒(批號：20160823)，均購于南京建成生物科技有限公司。

1.3 儀器TL-16R臺式高速冷凍離心機(上海離心機機械研究所)；T6新世紀紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；2010酶標儀(奧地利安圖斯公司)。

2 方法

2.1 異體抗原乳化劑的制備[9]取家兔新鮮結(jié)腸50根，刮取兔結(jié)腸黏膜，加入適量氯化鈉溶液制成勻漿液，-20 ℃過夜，解凍后，4 000 r·min-1、4 ℃冷凍離心30 min，取上清液于-20 ℃過夜，解凍后，4 000 r·min-1、4 ℃離心30 min，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃過夜后凍干，制備成家兔結(jié)腸抗原凍干粉，-20 ℃放置備用。異體抗原乳化劑每次臨用前配制，精密稱取家兔結(jié)腸抗原凍干粉600 mg(每只8 mg)，加入3.75 mL氯化鈉溶液溶解，待完全溶解后，取3.75 mL完全弗氏佐劑，渦旋混勻制備成異體抗原乳化劑。

2.2 動物模型建立[9]于d 1、8、15、22、29，取異體抗原乳化劑(現(xiàn)配現(xiàn)用)，分別在大鼠左側(cè)足跖、右側(cè)足趾、腹股溝、背部皮下、腹腔注射異體抗原乳化劑0.1 mL(每只含抗原8 mg，完全弗氏佐劑0.05 mL，末次注射不加佐劑)，末次注射禁食不禁水24 h后，對大鼠用5%醋酸1 mL灌腸，留置15 s，用氯化鈉溶液4 mL沖洗后，再用異體抗原乳化劑1 mL灌腸，留置30 min后，用4 mL氯化鈉溶液洗凈排出，造模完成。

2.3 分組及給藥正常組大鼠不造模(10只)，其余76只大鼠造模后，參考Hamamoto等[10]標準進行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分，按照大鼠DAI評分(0～3分為極輕度炎癥，4～6分為輕度炎癥，7～9分為中度炎癥，10～12分為重度炎癥)，剔除極輕度炎癥和重度炎癥大鼠，剩余60只大鼠按炎癥嚴重程度分層隨機分組：模型組(Model)、柳氮磺胺吡啶組(SASP 300 mg·kg-1)、腸炎寧組(Changyanning 300 mg·kg-1)、復(fù)方蜚蠊提取物PB低、中、高劑量組(PB 50、100、200 mg·kg-1)，每組10只，♀♂各半。除正常組、模型組灌腸0.9%氯化鈉溶液外，其余各組灌腸給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)14 d。

2.4 觀察指標及方法記錄各組大鼠給藥d 1、4、7、10、14的DAI評分。末次給藥24 h后，用質(zhì)量分數(shù)為10 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，4 ℃靜置4 h，3 500 r·min-1離心10 min，取上層血清，按試劑盒說明檢測IL-4、IL-8、IL-17、IFN-γ、CRP、IgG含量。解剖取出結(jié)腸，沿腸系膜緣剪開腸腔，氯化鈉溶液沖洗糞便，觀察腸壁，稱量濕質(zhì)量，采集結(jié)腸照片，參照標準[11]并進行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colonic mucosal damage index, CMDI)評分；切取病變嚴重區(qū)域結(jié)腸0.15 g，按1 ∶9(W/V)氯化鈉溶液勻漿，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，按試劑盒說明檢測上清液中TNF-α、MPO、EGF含量。剩余結(jié)腸用40 g·L-1甲醛固定，制作病理切片，并參照Ekstr?m[12]標準進行病理組織學(xué)評分(histopathological score，HS)。解剖取出肝臟、脾臟、胸腺等臟器，稱量質(zhì)量，計算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)/%=各臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠DAI評分的影響異體抗原聯(lián)合醋酸造模期間，除正常組以外，各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的厭食、懶動、體質(zhì)量下降、腹瀉、血便等情況。Tab 1結(jié)果顯示，實驗期間，正常組大鼠DAI評分較小且基本不變；根據(jù)給藥d 1的DAI評分，模型組DAI評分與正常組DAI評分差異有顯著性(P<0.01)，提示模型建立成功；復(fù)方蜚蠊提取物PB灌腸給藥d 14，PB各劑量組DAI評分均較低，提示經(jīng)復(fù)方蜚蠊提取物PB灌腸給藥治療后，大鼠的慢性UC癥狀在一定程度上得到緩解。與模型組比較，PB中劑量組DAI評分最低(P<0.01)，接近正常組。

Tab 1 Effect of Blattidae compound PB on DAI score of UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal；##P<0.01vsmodel

Tab 2 Effect of Blattidae compound PB on colon-related index in UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsSASP

3.2 復(fù)方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠結(jié)腸長度、寬度、CMDI評分和結(jié)腸指數(shù)的影響正常組大鼠腸壁肉眼觀察結(jié)腸黏膜無明顯水腫、糜爛和潰瘍形成；模型組大鼠腸壁可見明顯的充血與水腫。與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸長度變短，寬度變寬，CMDI評分最高(P<0.01)。與模型組比較，SASP組和腸炎寧組大鼠結(jié)腸長度變長，寬度變窄，CMDI評分降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；復(fù)方蜚蠊提取物PB各劑量組大鼠結(jié)腸長度無顯著性差異，結(jié)腸寬度明顯變窄(P<0.01)，CMDI明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，SASP組、腸炎寧組和PB中、高劑量組結(jié)腸指數(shù)明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見Tab 2。

3.3 復(fù)方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠臟器指數(shù)的影響Tab 3結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟、胸腺及脾臟指數(shù)均升高，但差異無顯著性。復(fù)方蜚蠊提取物PB低劑量組的肝臟指數(shù)，以及PB中劑量組的胸腺指數(shù)均升高(P<0.05)。與模型組比較，PB低劑量組肝臟、脾臟指數(shù)以及PB中、高劑量組胸腺指數(shù)均升高，但差異無顯著性。

3.4 復(fù)方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠血清生化指標的影響如Tab 4所示，與正常組比較，模型組大鼠IL-8、IL-17、CRP、IFN-γ、IgG含量均明顯升高(P<0.01)，而IL-4含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，SASP組、腸炎寧組、復(fù)方蜚蠊提取物PB各劑量組大鼠IL-8、IL-17、CRP、IFN-γ、IgG含量均明顯降低(P<0.01)；SASP組、腸炎寧組、PB高劑量組IL-4含量明顯升高(P<0.01)。與SASP組比較，PB低劑量組大鼠IL-4、IL-8含量明顯降低(P<0.01)，IL-17、IFN-γ含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

Tab 3 Effect of Blattidae compound PB on organ index in UC rats n=10)

*P<0.05vsnormal

3.5 復(fù)方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠結(jié)腸組織生化指標的影響如Tab 5所示，與正常組比較，模型組大鼠EGF含量明顯降低，MPO、TNF-α含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，SASP組、腸炎寧組、復(fù)方蜚蠊提取物PB中劑量組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、MPO含量明顯降低(P<0.01)，SASP組、腸炎寧組大鼠結(jié)腸組織中EGF含量明顯升高(P<0.01)。

Tab 4 Effect of Blattidae compound PB on serum IL-4, IFN-γ, IL-8, IL-17,CRP and IgG contents in UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsSASP;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsChangyanning

Tab 5 Effect of Blattidae compound PB on TNF-α, MPO and MPO in colonic tissues of UC rats

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsSASP;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsChangyanning

3.6 復(fù)方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠結(jié)腸組織HS的影響Tab 6、Fig 1結(jié)果顯示，正常組大鼠結(jié)腸黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結(jié)構(gòu)完整清晰，腸黏膜上皮細胞形態(tài)正常，腺體排列整齊，隱窩正常，無充血水腫、炎性細胞浸潤現(xiàn)象；模型組大鼠結(jié)腸黏膜不同程度的破損，杯狀細胞和隱窩大量丟失，黏膜層和黏膜基層炎性細胞浸潤，并伴有水腫。與正常組相比，模型組大鼠上皮細胞、炎性細胞及HS評分均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，SASP組、腸炎寧組及復(fù)方蜚蠊提取物PB低、中、高劑量組大鼠上皮細胞、炎性細胞及HS評分均明顯降低(P<0.01)；PB高劑量組與陽性藥SASP組數(shù)值相當(dāng)，PB低、中劑量組數(shù)值與陽性藥腸炎寧組相當(dāng)。

Tab 6 Effect of Blattidae compound PB on HS score of UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsSASP

Fig 1 The pathological sectionof rat UC organization by
clysis way(HE, ×200)

A：Normal; B：Model; C：SASP; D：Changyanning; E：PB high dose; F：PB medium dose; G：PB low dose

4 討論

本研究采用異體抗原聯(lián)合醋酸誘導(dǎo)大鼠慢性UC，大鼠在造模后出現(xiàn)腹瀉、血便、體質(zhì)量下降等癥狀，肉眼可見結(jié)腸黏膜糜爛和潰瘍形成，鏡下可見模型組大鼠結(jié)腸有大量炎性細胞浸潤，血清中CRP含量明顯升高。MPO是中性粒細胞產(chǎn)生的一種重要的過氧化物酶，其活性高低是判斷中性粒細胞浸潤程度的重要指標，也是結(jié)腸炎癥嚴重程度的重要指標[13]。模型組HS評分、結(jié)腸黏膜MPO、TNF-α含量明顯高于正常組；與模型組比較，陽性藥SASP組、腸炎寧組和復(fù)方蜚蠊提取物PB各劑量組HS評分、結(jié)腸黏膜MPO、TNF-α表達量均不同程度降低。結(jié)果提示，復(fù)方蜚蠊提取物PB可以降低中性粒細胞表達，促進黏膜修復(fù)，改善結(jié)腸病理組織變化。

目前研究認為，效應(yīng)CD4+T細胞的異?；罨赡苁菍?dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜免疫和后續(xù)炎癥反應(yīng)的重要機制之一[14]。CD4+T細胞主要包括Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞，參與體內(nèi)多種免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。INF-γ、IL-8、TNF-α主要是Th1細胞分泌的促炎因子，在清除細胞內(nèi)病原體中發(fā)揮重要作用；Th2細胞能分泌IL-4、TGF-β1等細胞因子，協(xié)助激活B細胞產(chǎn)生特異性抗體IgG，以清除細胞外病原體；Th17細胞是一類與Th1細胞和Th2細胞亞群不同分化機制和功能特性的新型CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-17、IL-23等細胞因子。IL-17具有較強激活中性粒細胞的能力，可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生和導(dǎo)致組織損傷。本實驗中，模型組大鼠血清中IL-17、INF-γ、IL-8、IgG含量均明顯升高，而IL-4含量明顯降低，提示模型組大鼠結(jié)腸黏膜損傷，上皮細胞新陳代謝功能障礙，有大量炎癥細胞浸潤，Th1/Th2平衡失調(diào)且傾向于Th1。而慢性UC大鼠經(jīng)過復(fù)方蜚蠊提取物灌腸治療后，UC癥狀明顯改善，大鼠體質(zhì)量增加，精神逐漸恢復(fù)，血便、稀便等癥狀減輕，排便頻數(shù)下降；血清中IL-17、IL-8、IFN-γ、IgG含量明顯降低，血清中IL-4的含量明顯升高。提示復(fù)方蜚蠊提取物PB可以調(diào)節(jié)炎癥因子的表達，減少炎癥細胞浸潤，減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體細胞免疫和體液免疫，使機體細胞免疫功能恢復(fù)平衡。

綜上所述，復(fù)方蜚蠊提取物可以通過調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫治療UC，但是復(fù)方蜚蠊提取物PB治療慢性UC并未出現(xiàn)明顯的劑量依賴性，可能與中藥復(fù)方制劑量效關(guān)系異常復(fù)雜有關(guān)。中藥復(fù)方的量效關(guān)系不僅有化學(xué)藥物的共同屬性，同時又具有鮮明的中醫(yī)藥特色，中藥復(fù)方在一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)后，每個單位被重新拆分和組合，形成了新的療效物質(zhì)成分[15]。由此可見，中藥復(fù)方的量效關(guān)系復(fù)雜，如何確定中藥復(fù)方劑量在臨床上的療效，仍然是中藥科研者需要面臨的問題之一。

(致謝：感謝大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院張俊、唐苗、余萬鑫及大理大學(xué)動物實驗中心吳定宇老師對本課題的支持！)