基于整合藥理學的經(jīng)典名方當歸補血湯防治糖尿病的作用機制研究

張倩韜，侯敏娜，彭修娟，杜 蓓，蔡 潔，劉 峰，3

(陜西國際商貿(mào)學院 1. 醫(yī)藥學院、2. 中藥研究院，陜西 西安 712046；3. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

經(jīng)典名方當歸補血湯源于《內(nèi)外傷辨惑論》(金·李東垣)，由君藥黃芪和臣藥當歸5 ∶1組成，是益氣養(yǎng)陰名方[1]。糖尿病(diabetes mellitus, DM)屬中醫(yī)“消渴癥”的范疇[2]，主要發(fā)病機制為先天不足、七情失調(diào)、勞欲過度致陰虛燥熱，陰虛易產(chǎn)生內(nèi)熱，熱灼更傷津液，津傷氣血，運行不通，血液在脈管中運行瘀滯。現(xiàn)代研究認為，DM是由于胰島素分泌絕對不足或胰島素抵抗引起的糖、脂肪、蛋白質、水和電解質代謝紊亂的代謝性疾病群，以高血糖為主要標志，隨著病情的遷延，容易出現(xiàn)心腦血管病變、DM腎病、神經(jīng)病變、DM足等并發(fā)癥。大量臨床研究表明，當歸補血湯對DM及其并發(fā)癥的療效明顯[3]，能全面改善該病癥的多個指標，延緩并發(fā)癥的發(fā)生，且藥物不良反應較少[4]。

“2017中國Ⅱ型糖尿病防治指南”指出，我國成年人Ⅱ型DM的發(fā)病率已高達10.9%，呈發(fā)病年輕化及逐年上升趨勢，已成為最常見的慢性病之一[5]。中醫(yī)藥治療“消渴癥”已有上千年的歷史，然而，中藥方劑藥效物質基礎難以闡明，藥理機制難以說清，服用劑量難以明確，長期應用的安全性評價等諸多問題，嚴重制約了經(jīng)典名方的深入研發(fā)。這就使得中藥防治DM藥效物質基礎的發(fā)現(xiàn)和作用機制的闡明，成為了當前亟待解決的問題。中藥整合藥理學平臺(integrative pharmacology of traditional Chinese medicine, TCMIP)是基于大數(shù)據(jù)和多學科交叉思維，在方劑、中藥材、中藥成分、疾病/癥狀靶標4個數(shù)據(jù)庫基礎上，構建“藥物成分-作用靶標-疾病通路”互相作用的網(wǎng)絡關系，預測中藥及其方劑的藥效物質基礎、作用機制、藥理效應等[6]。本研究借助TCMIP平臺，探討當歸補血湯防治DM及其并發(fā)癥的藥效物質基礎和作用機制，以期為當歸補血湯藥效物質基礎的辨識、制劑質量的評價、作用機制的闡明及其在DM的中藥防治中提供有益指導。

1 方法

1.1 當歸補血湯的化學成分來源在TCMIP的“中藥材數(shù)據(jù)庫”中，添加“黃芪”、“當歸”，建立當歸補血湯的化學成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 候選靶標來源及其靶標預測在TCMIP的“疾病靶標信息設定”中，以“diabetes”為關鍵詞，檢索疾病/癥狀的靶標，作為DM的已知疾病靶標；在“中藥靶標預測”界面中，選取藥物相似性分數(shù)≥0.7的化學成分預測的靶標當做候選靶標來源，相似性藥物作用的靶標即為當歸補血湯潛在的作用靶標。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用信息TCMIP整合了8個現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)資源，分別為Human Annotated and Predicted Protein Interaction Database、Reactome、Online Predicted Human Interaction Database、InAct、Human Protein reference Database、Molecular Interaction Database、Database of Interacting Protein和PDZBase。通過TCMIP的PPI數(shù)據(jù)庫，即可獲得當歸補血湯作用靶標與DM疾病靶標之間的PPI信息。

1.4 網(wǎng)絡構建與分析通過TCMIP的網(wǎng)絡分析模塊，針對當歸補血湯潛在藥靶與DM靶標之間的PPI計算網(wǎng)絡拓撲特征值，以“節(jié)點連接度(degree)”的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥方劑靶標-疾病基因相互作用網(wǎng)絡的核心節(jié)點(hubs)；在此基礎上，以“degree”、“節(jié)點緊密度(closeness)”和“節(jié)點介度(betweenness)”的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點為中藥方劑矯正疾病失衡網(wǎng)絡的關鍵靶標網(wǎng)絡。最后，對關鍵靶標網(wǎng)絡進行通路富集，選取P-Value值前30的關鍵通路，構建“中藥材-化學成分-核心靶標-關鍵通路-疾病關鍵病理環(huán)節(jié)”的多層次關聯(lián)網(wǎng)絡，從而揭示當歸補血湯的作用機制和藥效物質基礎。

1.5 基因功能和通路富集分析TCMIP鑲嵌了基因本體(Gene Ontology, GO)數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路數(shù)據(jù)庫的資源，對關鍵靶標的基因和通路富集分析，選擇P-Value值前20的關鍵通路信息列于表中。

2 結果

2.1 當歸補血湯化學成分及其預測靶標分析基于TCMIP平臺，黃芪收集到29個化學成分，主要為黃芪皂苷類、黃芪苷類、黃酮類等；當歸收集到65個化學成分，主要為揮發(fā)油類(如藁本內(nèi)酯、正丁烯內(nèi)酯、歸酮、異丁香酚)、有機酸類(阿魏酸)、當歸內(nèi)酯類等。黃芪的29個成分預測出796個藥物靶標，當歸的65個成分預測出774個藥物靶標。

采用“1.2”的方法，選取藥物相似性分數(shù)≥0.7的化學成分預測靶標，作為當歸補血湯潛在的作用靶標。當歸和黃芪兩藥共有靶標分析結果顯示，黃芪的潛在藥靶有399個，當歸的潛在藥靶有396個，且黃芪與當歸間共有作用靶標高達208個，說明黃芪和當歸間有很強的協(xié)同疊加作用。

2.2 當歸補血湯候選靶標基因功能及所參與的通路分析對當歸補血湯的潛在藥靶進行GO分析，所得分析結果中，選擇P-Value值前20的主要基因功能信息列于Tab 1中。Tab 1是當歸補血湯候選靶標基因所參與的生物學功能信息。由Tab 1可知，當歸補血湯候選靶標基因主要參與了機體的氫離子跨膜轉運、氧化還原過程、線粒體電子轉運、前體代謝物和能量生成、維生素代謝、化學突觸傳遞等生物學過程；在細胞組分方面，主要存在于線粒體、線粒體內(nèi)膜、線粒體基質等組分當中；在分子功能方面，主要介導了谷氨酸門控離子通道活性、離子型谷氨酸受體信號通路及谷氨酸受體信號通路、天門冬氨酸-谷氨酸受體活性及谷氨酸受體的活性、CYP450酶活性、輔酶Q活性等分子生物學過程。

Tab 1 The functional information of Danggui Buxue decoction candidate target

同時，對當歸補血湯潛在藥靶進行KEGG通路富集分析，所得分析結果中，選擇P-Value值前20的關鍵通路信息列于Tab 2中。Tab 2是當歸補血湯候選靶標基因組所參與的生物學調(diào)控通路信息。由Tab 2可知，當歸補血湯候選藥靶主要參與了內(nèi)分泌及代謝疾病、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、心肌收縮、非酒精性脂肪肝、帕金森病、神經(jīng)退行性疾病、藥物上癮等疾病過程，以及谷氨酸能神經(jīng)突觸、輔酶和維生素的代謝、能量代謝、氧化磷酸化、葉酸的一碳單位、氨基酸代謝等代謝途徑。

Tab 2 The pathway information of Danggui Buxue decoction candidate target

2.3 當歸補血湯防治糖尿病的核心靶標網(wǎng)絡、基因功能和通路富集分析

2.3.1當歸補血湯防治DM的核心靶標網(wǎng)絡 通過TCMIP的網(wǎng)絡分析模塊，采用“1.3”和“1.4”所示方法，建立當歸補血湯藥靶與DM靶標的PPI網(wǎng)絡，篩選得到202個關鍵靶標，其中藥物直接作用靶標86個，已知的疾病靶標10個，疾病與藥物間的共有靶標3個，其他間接靶標101個。根據(jù)Degree值僅顯示前100個靶標的PPI網(wǎng)絡，紅色代表藥物直接作用靶標，黃色代表已知的疾病靶標，綠色代表藥物與疾病間共有靶標，見Fig 1，圖中節(jié)點大小與Degree值成正比。

藥物作用靶點的主要來源是疾病靶點，由Fig 1可知，當歸補血湯與DM間的共有靶標有3個，分別為精氨酸加壓素受體(arginine vasopressin receptor，AVPR)的3個亞型：AVPR1A、AVPR1B和AVPR2。AVPR在體內(nèi)分布廣泛，與機體的血壓調(diào)節(jié)、心臟活動，血糖代謝、血栓形成、腎臟的水鹽代謝、炎癥反應和大腦學習記憶等過程密切相關[7]。有研究表明，AVPR基因缺陷，是導致腎性糖尿病(以煩渴、多飲、多尿及低比重尿為主要臨床表現(xiàn))的重要原因[8]，推測當歸補血湯對DM及其并發(fā)癥的防治作用可能與AVPR介導的心血管-腎臟系統(tǒng)作用有關。

Fig 1 Network of Danggui Buxue decoction candidate targets for diabetes

Red: Putative drug target; Yellow: Known disease target; Green: Common target; Gray: Others.

中藥方劑可通過保護胰島β細胞、調(diào)節(jié)血糖血脂代謝異常、改善胰島素抵抗、抑制炎癥反應[9]與氧化應激[10]等環(huán)節(jié)，來發(fā)揮防治DM的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當歸補血湯能降低血糖，明顯改善DM的“三多一少”癥狀[11]，及其心血管系統(tǒng)[12]、腎臟、周圍神經(jīng)病變、眼睛病變等并發(fā)癥。張瑩雯等[13]研究表明，當歸補血湯可抑制腎皮質轉化生長因子β1(TGF-β1)mRNA的表達，改善腎功能，延緩DM腎病病理進展；周肖等[14]運用當歸補血方加減對氣虛血瘀型糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)患者進行為期4周的三陰交、涌泉敷貼治療，結果表明，當歸補血方穴位敷貼能夠改善氣虛血瘀型DPN患者肢體疼痛、肢體麻木、手足畏寒、倦怠乏力等不適癥狀，并改善氣虛血瘀型DPN患者的感覺功能。郭藝娟等[15]研究表明，當歸補血湯加味通過降低DM大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的滲漏，對DM視網(wǎng)膜早期病變有防治作用，其作用機制可能是抑制NF-κB的激活。

2.3.2當歸補血湯防治DM的GO基因功能及KEGG通路富集分析 基于TCMIP的疾病靶標信息，采用“1.5”的方法，對DM靶標進行GO分析，選擇P-Value值前20的主要基因功能信息列于Tab 3中。Tab 3是DM靶標基因所參與的生物學功能信息。由Tab 3可知，參與DM病理過程的基因主要分布于細胞質基質、線粒體及線粒體內(nèi)膜等細胞器，通過調(diào)控機體細胞的凋亡和增殖，參與了ATP結合、蛋白激酶活化、腺苷酸環(huán)化酶激活、蛋白質磷酸化、氨基酸磷酸化、血小板激活、脂肪酸β氧化、線粒體電子轉運、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等多條信號通路的轉導，把細胞外的信號傳入細胞內(nèi)，進而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。

Tab 3 The target functional information of Danggui Buxue decoction on diabetes

基于TCMIP的疾病靶標信息，采用“1.5”的方法，對DM靶標進行KEGG通路富集分析，選擇P-Value值前20的關鍵通路信息列于Tab 4中。Tab 4是DM靶標基因組所參與的生物學調(diào)控通路信息。由Tab 4可知，參與DM病理過程的通路主要集中在內(nèi)分泌系統(tǒng)、細胞間隙連接、激素信號通路、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、長期的抑郁，長期應激狀態(tài)、谷氨酸能突觸、晝夜節(jié)律等多條信號通路，以及神經(jīng)退行性疾病、前列腺癌、乙型肝炎、神經(jīng)膠質瘤、阿爾茨海默病、亨廷頓病等疾病相關通路。中醫(yī)將DM劃分為脾癉和消癉兩種類型，全程分為郁、熱、虛、損4個階段。郁階段多見于DM前期，熱階段多見于DM早期，虛階段多見于DM中期，損階段多見于DM晚期。當歸補血湯可根據(jù)消渴癥不同階段的核心病機進行分型論治，從而達到多途徑、多層次、多靶點、多環(huán)節(jié)干預DM及其并發(fā)癥的作用。

Tab 4 The target pathway information of Danggui Buxue decoction on the diabetes

2.4 當歸補血湯防治糖尿病的“中藥-核心成分-關鍵靶標-主要通路”多維網(wǎng)絡關系分析基于Fig 1當歸補血湯藥靶與DM疾病靶標的PPI網(wǎng)絡信息，采用“1.3”和“1.4”的方法，構建了當歸補血湯防治DM的“核心成分-關鍵靶標-主要通路”多維網(wǎng)絡關系圖，見Fig 2(綠色表示中藥材，紫色表示化學成分，藍色表示藥物靶標，紅色表示疾病通路)。由Fig 2可知，當歸補血湯的50個核心“黃芪-當歸”化學成分，通過直接或間接作用于60個關鍵藥靶，這些藥靶作用于神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)、細胞間連接、激素信號通路、心血管循環(huán)系統(tǒng)等30條主要調(diào)控通路，來糾正DM及其并發(fā)癥的疾病失衡網(wǎng)絡。黃芪的29個化學成分中有22個參與了DM的防治，主要為三萜環(huán)黃氏醇、熊竹素、乙酰黃芪苷I、黃芪皂苷I～黃芪皂苷Ⅷ、膜莢黃芪苷Ⅰ、膜莢黃芪苷Ⅱ、異黃芪苷Ⅰ、異黃芪苷Ⅱ、綿毛黃芪皂苷Ⅸ等；當歸的65個化學成分中有28個參與了DM的防治，主要為阿魏酸、茴香酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、琥珀酸、癸二酸、壬二酸、二十四烷酸等有機酸，β-甜沒藥烯、甲基苯酚、乙基苯酚、二羥基苯乙酮、香草醛等油性成分，豆甾醇-β-D-葡萄糖苷、傘形花內(nèi)酯、東莨菪素等?？梢婞S芪為該方中發(fā)揮防治DM作用的核心中藥，也體現(xiàn)了當歸補血湯方重用黃芪的科學性和合理性。

Fig 2 The “compound-target-pathway” network of Danggui Buxue decoction

Green: Traditional Chinese medicine; Purple: Compound; Blue: Target; Red: Pathway.

3 討論

本研究采用整合藥理學方法，對經(jīng)典名方當歸補血湯防治DM的作用機制和藥效物質基礎進行了預測分析。預測過程中收集了方劑-病癥的化學結構數(shù)據(jù)、基因組學數(shù)據(jù)、蛋白組學數(shù)據(jù)及PPI交互網(wǎng)絡數(shù)據(jù)等，以便更合理的研究開發(fā)經(jīng)典名方當歸補血湯。

TCMIP預測結果表明，主要有50個“黃芪-當歸”化學成分，通過直接或間接作用相關靶標和通路，來糾正DM及其并發(fā)癥的疾病失衡網(wǎng)絡。在G0基因功能信息方面，預測結果表明，當歸補血湯通過直接或間接作用于線粒體、線粒體內(nèi)膜及細胞質基質等細胞器，通過介導多種離子通道活性、酶活性及受體信號通路，影響跨膜轉運作用，在物質轉運、電子轉運、物質代謝和能量代謝過程中起作用。在KEGG調(diào)控通路方面，預測結果表明，當歸補血湯主要參與了DM的谷氨酸能突觸傳遞、氧化磷酸化、輔酶和維生素的代謝、能量代謝，氨基酸代謝等代謝途徑，以及內(nèi)分泌系統(tǒng)、細胞間隙連接、激素信號通路、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、長期應激狀態(tài)等多條信號轉導通路，也參與了DM引發(fā)的神經(jīng)退行性疾病、非酒精性脂肪肝和心肌收縮等并發(fā)癥。

在GO基因功能信息和KEGG調(diào)控通路的基礎上，通過TCMIP的PPI數(shù)據(jù)資源，篩選到疾病與藥物間的共有靶標為AVPR1A、AVPR1B和AVPR2，該受體在體內(nèi)分布廣泛，參與了機體的血壓調(diào)節(jié)、心臟活動，血糖代謝、血栓形成、腎臟的水鹽代謝、炎癥反應和大腦的學習記憶等眾多生命活動。推測當歸補血湯對DM及其并發(fā)癥的作用機制可能是通過AVPR受體信號通路來發(fā)揮的。本研究是基于TCMIP所做的預測分析，當歸補血湯防治DM的藥效物質基礎及作用機制還需通過實驗研究加以驗證。望本研究能夠為經(jīng)典名方當歸補血湯的深入研究開發(fā)及中藥方劑對DM及其并發(fā)癥的防治提供一些新思路，進而為DM的中藥防治提供更多的臨床選擇。

(致謝：本研究是在中國中醫(yī)科學院中藥研究所提供的中藥整合藥理學平臺完成的，感謝該研究所的許海玉博士在研究過程中給予的指導和幫助。)