二甲雙胍與二氯乙酸鹽對(duì)MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE-2C細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤作用

王文斌，任飛樺，胡少洋，劉 歡，廖清船，陳紅霞，任 平

(1. 咸寧市中心醫(yī)院甲乳外科，湖北 咸寧 437100；2. 湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是小兒最常見(jiàn)的顱外惡性實(shí)體腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%進(jìn)展期神經(jīng)母細(xì)胞瘤有MYCN擴(kuò)增[1]。MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度高，對(duì)常規(guī)化療藥物高度耐藥，常因多重治療出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)[2]。因此，尋找新的治療方法提高治愈率，減少毒性反應(yīng)意義重大。二甲雙胍(metformin)是治療2型糖尿病的一線口服藥物。體外研究顯示，二甲雙胍可抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤等[3-4]。但是二甲雙胍在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝時(shí)，誘導(dǎo)乳酸堆積，引起腫瘤周圍微環(huán)境酸化，從而降低二甲雙胍的抗癌效應(yīng)[5]。若能有效克服該副作用，無(wú)疑有助于增強(qiáng)二甲雙胍的抗癌效果。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，用于治療人類遺傳性線粒體代謝疾病和乳酸酸中毒的廉價(jià)藥二氯乙酸鹽(dichloroacetate，DCA)可殺死多種癌細(xì)胞，如卵巢癌、腦癌細(xì)胞等，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)損害，并可改善腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的獲得性耐藥[6-7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，DCA可減少乳酸堆積，破壞腫瘤細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞的生存[8]。因此推測(cè)，二甲雙胍和DCA對(duì)MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤可能具有協(xié)同抑制作用。本文旨在研究二甲雙胍和DCA對(duì)MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制，為MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株BE-2C細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2藥物與試劑 二甲雙胍鹽酸鹽、DCA，均購(gòu)自Sigma公司(使用前均用培養(yǎng)基配制成所需濃度)；RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、青霉素、鏈霉素，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自于碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖測(cè)試盒、乳酸測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；一抗Bax、Bcl-2，p-Akt、Akt、p-S6K、S6K、cleaved caspase-3及β-actin，均購(gòu)自于美國(guó)Cell Signaling公司；ECL發(fā)光液，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜(Thermo公司)；倒置顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；超凈工作臺(tái)( 蘇州凈化設(shè)備廠)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BE-2C細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%二氧化碳，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性與聯(lián)合指數(shù)的計(jì)算 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BE-2C細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按每孔8 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后分組進(jìn)行處理，分為空白對(duì)照組、二甲雙胍單獨(dú)用藥組(1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1)、DCA單獨(dú)用藥組(2.5、5、10、20、40、80 mmol·L-1)、二甲雙胍與DCA聯(lián)合用藥組(摩爾比1 ∶2)，以1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1的濃度為基準(zhǔn)，以上每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育30 min后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量96孔板的吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)/(空白對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)]×100%。使用Graph Pad Prism5.0軟件計(jì)算藥物半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50，同時(shí)應(yīng)用CalcuSyn1軟件，計(jì)算兩藥聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)，判斷兩藥聯(lián)用效果。

1.2.3培養(yǎng)基中葡萄糖含量和乳酸生成量的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BE-2C細(xì)胞，以2×105每孔的密度接種于6孔板中。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，更換含藥物的培養(yǎng)基。以培養(yǎng)基為對(duì)照組，以單用二甲雙胍10 mmol·L-1、DCA 20 mmol·L-1及其聯(lián)用組為實(shí)驗(yàn)組。藥物作用24 h后，收集培養(yǎng)基上清于EP管中，采用葡萄糖測(cè)試盒和乳酸測(cè)定試劑盒，檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖含量和乳酸生成量。

1.2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BE-2C細(xì)胞，以2×105每孔的密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，更換含藥物的培養(yǎng)基。以培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組，單用二甲雙胍10 mmol·L-1、DCA 20 mmol·L-1及其聯(lián)用組為實(shí)驗(yàn)組。藥物作用24 h后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，接著用預(yù)冷的PBS洗1次，再加入binding buffer 0.5 mL輕柔吹打混勻，吸取細(xì)胞至流式管，避光加入5 μL PI與5 μL Annexin-V FITC溶液孵育5 min，此外需設(shè)置空白管，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2，cleaved caspase-3的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BE-2C細(xì)胞，以2×105每孔的密度接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，更換含藥物的培養(yǎng)基。以生理鹽水為陰性對(duì)照組，單用二甲雙胍10 mmol·L-1、DCA 20 mmol·L-1及其聯(lián)用組為實(shí)驗(yàn)組。藥物作用24 h后，于冰上裂解收集蛋白，采用BCA檢測(cè)蛋白含量，取40 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，洗膜，室溫孵育二抗1 h，洗膜，ECL發(fā)光液顯影，通過(guò)ImageJ軟件分析各樣品目的蛋白的灰度值，用β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍與DCA聯(lián)用對(duì)BE-2C細(xì)胞增殖的抑制具有協(xié)同作用不同濃度的二甲雙胍或DCA處理BE-2C細(xì)胞24 h，采用CCK-8法檢測(cè)其細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，二甲雙胍或DCA對(duì)BE-2C細(xì)胞的抑制率隨濃度的增加而增高，具有濃度依賴性(Fig 1A、1B)。通過(guò)Graph Pad Prism5.0軟件，計(jì)算二甲雙胍的IC50值為(23.1±0.1)mmol·L-1，DCA的IC50值為(46.1±0.1)mmol·L-1，確定二甲雙胍與DCA聯(lián)用的摩爾比為1 ∶2。繼而通過(guò)CCK-8法，測(cè)定藥物聯(lián)用對(duì)細(xì)胞毒性的大小，并采用CalcuSyn1軟件計(jì)算兩藥聯(lián)用的CI。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用在不同效應(yīng)(即聯(lián)用時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率)時(shí)的CI均小于1，表明二甲雙胍和DCA聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)(Fig 1C)。倒置顯微鏡下觀察到單獨(dú)應(yīng)用二甲雙胍或DCA組的細(xì)胞數(shù)量減少，但未見(jiàn)明顯的脫落細(xì)胞，而聯(lián)用組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮明顯，并可見(jiàn)大量漂浮的死亡細(xì)胞(Fig 1D)。

2.2 二甲雙胍與DCA聯(lián)用對(duì)BE-2C細(xì)胞中葡萄糖攝取和乳酸生成的影響分別單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用10 mmol·L-1的二甲雙胍或20 mmol·L-1的DCA處理BE-2C細(xì)胞24 h，檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖和乳酸的含量。Fig 2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，二甲雙胍組的葡萄糖消耗和乳酸的產(chǎn)生量明顯增加(P<0.05)，而DCA組的葡萄糖消耗和乳酸的產(chǎn)生量明顯減少(P<0.01)；與二甲雙胍組相比，兩藥聯(lián)用組的葡萄糖消耗和乳酸的產(chǎn)生量明顯減少(P<0.05)，表明DCA可減少二甲雙胍引起的乳酸的堆積。

Fig 1 Synergistic inhibition of proliferation of BE-2C cells by metformin plus DCA n=5)

A: Metformin inhibited the viability of BE-2C cells in a dose-dependent manner; B: DCA showed a dose-dependent cytotoxicity in BE-2C cells; C: Combination index (CI) values of combined effect of metformin and DCA on BE-2C cells; D: The effects of metformin and DCA combination on morphology of BE-2C cells (×400).

Fig 2 Effects of metformin and/or DCA on glucose uptake and lactic acid production in BE-2C n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmetformin group

2.3 二甲雙胍與DCA聯(lián)用對(duì)BE-2C細(xì)胞凋亡的影響為了證實(shí)二甲雙胍與DCA聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同作用與凋亡相關(guān)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍和DCA單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用所引起的細(xì)胞凋亡變化。Fig 3結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，二甲雙胍或DCA單獨(dú)用藥組細(xì)胞凋亡比例明顯增高(P<0.05)；與二甲雙胍或DCA單獨(dú)用藥組相比，兩藥聯(lián)用組細(xì)胞凋亡比例明顯增高(P<0.05)，提示二甲雙胍與DCA聯(lián)用可誘導(dǎo)BE-2C細(xì)胞凋亡增加。

2.4 二甲雙胍與DCA聯(lián)用誘導(dǎo)細(xì)胞Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加為了進(jìn)一步研究?jī)伤幝?lián)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加有關(guān)，采用Western blot檢測(cè)二甲雙胍與DCA單用及聯(lián)用對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，二甲雙胍與DCA單用組細(xì)胞的Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)；與二甲雙胍或DCA單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)用組細(xì)胞的Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均較單用組增加，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平均較單用組明顯降低(P<0.01)。表明二甲雙胍與DCA聯(lián)用誘導(dǎo)BE-2C細(xì)胞凋亡增加，可能與下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、增強(qiáng)caspase-3活性有關(guān)。

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤是一種代謝異常性疾病[9]。腫瘤細(xì)胞由于線粒體呼吸鏈出現(xiàn)不可逆損傷，造成其在正常氧濃度條件下仍然傾向于糖酵解，這種現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)[10]。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)糖酵解的依賴和高水平的葡萄糖攝取利用率，因此，抑制糖酵解和葡萄糖代謝可成為腫瘤治療的潛在目標(biāo)。在諸多通過(guò)調(diào)節(jié)代謝而抗腫瘤的藥物中，DCA與二甲雙胍顯示出良好的抗腫瘤前景。

Fig 3 Effects of metformin and/or DCA on

A: Representative PI-Annexin V staining plots of BE-2C cells treated with control or 10 mmol·L-1metformin and/or 20 mmol·L-1DCA; B: Apoptotic rate detected by Annexin V-FITC /PI flow cytometry.△P<0.05,△△P<0.01 vs control group;**P<0.01vsmetformin group;##P<0.01vsDCA group.

Fig 4 Effects of metformin and/or DCA on protein levels of apoptosis-related proteins in BE-2C n=3)

△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01 vs metformin group;##P<0.01vsDCA group

本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍和DCA單獨(dú)應(yīng)用可明顯抑制MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE-2C細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有濃度依賴性，其IC50值分別為23.1 mmol·L-1和46.1 mmol·L-1，這些發(fā)現(xiàn)與先前報(bào)道的二甲雙胍與DCA降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活的結(jié)果一致[11-12]。而當(dāng)二甲雙胍與DCA以1 ∶2摩爾比聯(lián)用時(shí)，其聯(lián)用指數(shù)均小于1，顯微鏡下觀察，聯(lián)用后其細(xì)胞數(shù)量明顯減少，有大量漂浮的死亡細(xì)胞，表明兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用。

但是二甲雙胍可抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I，進(jìn)而抑制葡萄糖代謝，造成腫瘤細(xì)胞的糖剝奪，誘導(dǎo)了乳酸堆積，引起腫瘤周圍微環(huán)境酸化，從而降低二甲雙胍的抗癌效應(yīng)[5]。我們?cè)谘芯績(jī)伤帉?duì)葡萄糖的消耗和糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸生成能力的影響中發(fā)現(xiàn)，DCA可明顯減少二甲雙胍促進(jìn)葡萄糖的消耗而導(dǎo)致乳酸堆積的副作用，這表明二甲雙胍與DCA協(xié)同抑瘤作用可能與DCA抑制糖酵解有關(guān)。

細(xì)胞凋亡在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要作用，腫瘤細(xì)胞會(huì)逃避凋亡，這與腫瘤的發(fā)展形成及耐藥性有著密不可分的關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可激活A(yù)MP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，進(jìn)而抑制mTORC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[13]。DCA可增強(qiáng)有氧氧化作用，釋放大量活性氧簇，造成線粒體膜去極化，激活Kv通道等[14]，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中線粒體的功能紊亂，激活線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，殺傷腫瘤細(xì)胞。我們檢測(cè)兩藥聯(lián)用后其凋亡的變化，結(jié)果顯示，二甲雙胍與DCA均可誘導(dǎo)BE-2C細(xì)胞發(fā)生凋亡，且聯(lián)用后細(xì)胞凋亡明顯增加，與單用組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如c-Myc、抑癌基因p53等。Bcl-2家族成員可分為兩類，一類為細(xì)胞凋亡的抑制基因，主要有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等，在caspase級(jí)聯(lián)放大與線粒體之間扮演著“橋梁”的作用；另一類是促進(jìn)細(xì)胞死亡，主要包括Bax、Bak、Bid等，可調(diào)節(jié)凋亡進(jìn)程，釋放細(xì)胞色素C，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[15]。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍與DCA聯(lián)用可明顯抑制Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，說(shuō)明兩藥聯(lián)用可能通過(guò)改變Bcl-2與Bax的比例，增加了細(xì)胞凋亡。有活性的caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，把DNA降解為特異片段，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍與DCA聯(lián)用可增加cleaved caspase-3的表達(dá)，這些結(jié)果說(shuō)明二甲雙胍與DCA聯(lián)用發(fā)生的協(xié)同機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，二甲雙胍與DCA聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同作用可能與DCA抑制糖酵解，減弱二甲雙胍誘導(dǎo)的乳酸產(chǎn)生，增強(qiáng)二甲雙胍的抗癌效應(yīng)，也可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞凋亡率有關(guān)。本研究為二甲雙胍與DCA聯(lián)用治療MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供了良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在湖北科技學(xué)院任平教授實(shí)驗(yàn)室完成，謹(jǐn)此致謝。)