板橋黨參通過PP2A信號通路改善AD模型大鼠認知功能障礙

諶 勤，羅洪斌, 2, 3，謝文執(zhí)

(湖北民族大學1. 醫(yī)學部生物化學與分子生物學教研室、2. 科技學院生物化學與分子生物學教研室、3. 神經(jīng)精神共患病研究所，湖北 恩施 445000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常見的老年癡呆癥，臨床主要表現(xiàn)為記憶力、計算能力及定向能力障礙。老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)、膽堿能系統(tǒng)功能失調(diào)、突觸受損及神經(jīng)元缺失[1]為其主要病理改變。Tau蛋白磷酸化假說認為[2]，在AD患者的臨床早期即發(fā)生其大腦內(nèi)Tau被過度磷酸化修飾(其磷酸化水平高于正常人的3～4倍)，導(dǎo)致Tau與微管蛋白的結(jié)合能力下降，并引起該蛋白從微管中脫落，進而影響中樞神經(jīng)細胞發(fā)育、軸突運輸及突觸間信息的傳遞。脫落的過度磷酸化Tau會互相聚集形成NFTs，并具有明顯的神經(jīng)毒性，且磷酸化修飾程度與AD患者的癡呆程度呈正相關(guān)[3]。大量研究表明，蛋白磷酸酯酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A) 能使過度磷酸化修飾的Tau發(fā)生去磷酸化修飾，并恢復(fù)Tau的正常微管組裝能力，而PP2A活性的下降會導(dǎo)致AD的特征性病理改變[4-5]。岡田酸(okadaic acid，OA)是PP2A的特異性抑制劑，大鼠腦海馬注射OA后可明顯下調(diào)PP2A活性，并誘導(dǎo)Tau發(fā)生過度磷酸化修飾，進而導(dǎo)致大鼠空間學習記憶障礙[6]。因此，以PP2A為靶點的AD藥物研究策略，可為該病的治療帶來新的希望。

板橋黨參(BanqiaoCodonopisisPilosula，BCP)為桔?？泣h參，屬川黨參中的小條黨參，因主產(chǎn)于恩施州板橋鎮(zhèn)，故簡稱“板黨”，為恩施州道地藥材，具有補氣補血活血之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，BCP臨床療效確切，在增強免疫力、活血、抗氧化、延緩衰老等方面具有重要的藥理作用[7-9]。BCP還可通過糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)信號通路，改善AD模型大鼠的學習記憶能力，恢復(fù)海馬受損神經(jīng)元功能，促進神經(jīng)發(fā)育[10]。但AD發(fā)病機制中除GSK-3β信號通路外，PP2A信號通路也發(fā)揮了重要作用，查閱文獻暫未發(fā)現(xiàn)BCP能作用于此信號通路。故有必要探討B(tài)CP對PP2A信號通路的影響，可為中藥防治AD提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑按60 kg成人為標準，給予BCP低、中、高用藥劑量分別為15、30、60 g·kg-1·d-1，大鼠按250 g為標準，相當于成人的臨床等效的低、中、高劑量分別為0.54、1.08、2.16 g·kg-1·d-1。換算方法根據(jù)《藥理實驗中動物間和動物和人體間的等效劑量換算》計算獲得[11]。BCP水煎液制備方法：稱量432 g BCP切片，煎取3次，合并濾液，濃縮定量至2.16 kg·L-1備用。OA購自美國Millipore公司；pT231、pS396、pS404、pT181、p307-PP2Ac抗體，購自美國SAB公司；DM-PP2Ac抗體，購自美國Santa Cruz公司；Tau-5、PP2Ac、M-PP2Ac抗體，購自美國Abcam公司；甲酯酶(PME)、N-甲基-D-天冬氨酸受體1(NMDAR1)、突觸素(Synaptophysin)抗體，購自美國Millipore公司；NMDAR2B、突觸蛋白-1(Synapsin-1)抗體，購自美國Proteintech公司；β-actin抗體，購自美國Bioworld Technology公司。

1.2 儀器腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；DMS-2型Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)；VT1200S振蕩切片機(德國Leica公司)；三目數(shù)字攝影顯微鏡(日本Nikon公司)；099CK5424勻漿機(美國Glas-Col公司)；1510全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國基因公司)。

1.3 實驗動物與分組♂SD大鼠120只，體質(zhì)量(250±30)g，購自湖北省實驗動物研究中心，合格證號為42000600017418。自由進食飲水2周后，隨機分為10組：DMSO組(分為1周組和2周組)、OA組(分為1周組和2周組)、BCP低、中、高劑量組(每個劑量組又分為1周組和2周組)，共10組，每組10只，另選20只備用。

1.4 AD模型的建立、給藥及Morris水迷宮訓練DMSO、OA組用溫水灌胃，BCP治療組分別用低、中、高劑量BCP水煎液灌胃，所有大鼠灌胃時間均分為1周和2周。1周組在灌胃的d 2開始水迷宮訓練，2周組在灌胃的d 9開始水迷宮訓練，訓練時間均為5 d，水迷宮訓練結(jié)束后d 2造模(水迷宮訓練方法參考文獻[10])，選擇能在15 s內(nèi)找到隱藏平臺大鼠(其搜索軌跡筆直簡單)用于后續(xù)實驗[12]。造模方式參考本課題組前期實驗[13]，分別為DMSO組雙側(cè)腦海馬各注射10% DMSO 1.5 μL，OA組和BCP治療組大鼠雙側(cè)腦海馬各注射OA(0.392 mmol·L-1) 1.5 μL。造模后將大鼠放入溫暖環(huán)境，等待蘇醒。造模24 h后立即進行Morris水迷宮測試。記錄實驗大鼠尋找隱藏平臺的潛伏期和游泳軌跡。實驗過程見Fig 1。

1.5 Western blot實驗水迷宮測試后，取新鮮大鼠腦海馬組織，勻漿后進行Western blot操作。實驗方法參照本課題組前期實驗[10]。一抗(PME、pS307-PP2Ac、p-Tau-Ser 396、p-Tau-Ser 404、NMDAR 1、Synaptophysin等)孵育過夜；熒光二抗孵育1 h后,TBST洗滌3次，每次10 min。Odyssey掃描儀掃描，ImageJ計算灰度值，SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。

Fig 1 1 week and 2 weeks of experiment procedure

A:1 week of experiment procedure; B: 2 weeks of experiment procedure.

1.6 尼氏染色測試結(jié)束后，選3只大鼠進行多聚甲醛灌流，完整的取出整個大腦，浸泡在4%多聚甲醛溶液中，4 ℃冰箱保存。1周后取出大腦，用振蕩切片機切片，厚度約30 μm，選取合適腦片進行尼氏染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 BCP對AD模型大鼠學習記憶能力的影響Fig 2水迷宮實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA模型組大鼠其逃避潛伏期明顯延長，同時游泳軌跡凌亂無章，說明大鼠空間學習記憶發(fā)生障礙。而低、中、高劑量的BCP不論是1周還是2周治療組，其逃避潛伏期均明顯縮短，目的性強，游泳路程縮短，且呈劑量依賴性。此結(jié)果提示，不同劑量的BCP在短期使用和長期使用后，均可明顯改善AD大鼠空間學習記憶障礙。

2.2 BCP對AD模型大鼠腦海馬組織PP2A活性的調(diào)節(jié)作用Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，OA組的甲酯酶PME水平增高，進而導(dǎo)致PP2Ac第309位點去甲基化和第307位點磷酸化升高，第309位點的甲基化水平降低。此結(jié)果證明，甲酯酶PME增高能引起PP2Ac第309位點甲基化水平降低、第307位點磷酸化升高，最終導(dǎo)致PP2Ac活性下降，說明本實驗造模成功。同樣的實驗結(jié)果又發(fā)現(xiàn)在BCP中﹑高劑量組中，不管是短時間使用，還是長時間使用，各組甲酯酶PME的表達量及PP2Ac第309位點去甲基化﹑第307位點磷酸化水平均明顯下降，而第309位點甲基化水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。說明BCP能明顯提高PP2Ac活性，且中﹑高劑量組效果更為明顯。

Fig 2 1 week and 2 weeks of BCP administration prevented rats from OA-induced spatial memory retention

A: 1 week and 2 weeks BCP administration improved swimming pathways, which were recorded 24 h after OA injection; B: 1 week and 2 weeks BCP administration shortened the escape latency of OA-injected SD rats in a dose-dependent manner.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsbefore OA injection;△△P<0.01vsOA injection.

Fig 3 Effects of 1 week and 2 weeks of BCP administration on OA-induced inhibition of n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA injection

2.3 BCP對AD模型大鼠腦海馬組織中Tau蛋白磷酸化水平的調(diào)控作用Fig 4結(jié)果顯示，OA模型組Tau蛋白pT181、pT231、pS396、pS404這4個位點的磷酸化水平高于DMSO對照組，說明OA確能上調(diào)Tau蛋白的磷酸化水平。而BCP治療1周和2周的中、高治療組，其Tau蛋白pT181和pS404位點的磷酸化水平明顯下降，且具有明顯的劑量依賴性。說明中、高劑量的BCP均能明顯降低Tau蛋白的異常磷酸化。

Fig 4 Effects of 1 week and 2 weeks of BCP administration onOA-induced Tau hyperphosphorylation in SD rat n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA injection

2.4 BCP對AD模型大鼠腦海馬組織突觸相關(guān)蛋白表達的影響如Fig 5所示，OA組突觸蛋白表達較DMSO組明顯下降，說明OA能明顯降低突觸相關(guān)蛋白的表達量。BCP治療組突觸蛋白較OA組增加，BCP中﹑高劑量組灌胃1周其海馬組織Synapsin-1和NMDA-2B蛋白表達上調(diào)，而Synaptophysin蛋白在用藥第1周的各組中也表達升高；在BCP灌胃2周的高劑量組，Synapsin-1蛋白增加，同時該中﹑高劑量組的Synaptophysin和NMDA-2B蛋白表達同樣增加。說明中﹑高劑量的BCP可明顯提高OA誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織中的突觸相關(guān)蛋白表達量。

2.5 BCP對AD模型大鼠腦海馬神經(jīng)元活性的影響Fig 6尼氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA模型組與DMSO對照組相比腦海馬CA1和CA3區(qū)其尼氏小體著色變淺，數(shù)量明顯減少。而BCP中、高劑量組在大鼠腦海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏小體著色加深且數(shù)量增多，特別是2周組，同時還具有劑量依賴性。此結(jié)果證明，中、高劑量BCP在兩個時間點均能增加大鼠腦海馬尼氏小體數(shù)量，恢復(fù)AD大鼠神經(jīng)元活性。

3 結(jié)論

AD患者因其高昂的護理和治療成本，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟壓力和精神負擔，因此，尋找防治AD的有效藥物就顯得尤為重要。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，BCP能抑制蛋白激酶GSK-3β活性，改善因該酶活性升高誘導(dǎo)的AD模型大鼠認知功能障礙，促進神經(jīng)發(fā)育[10]。說明該藥在防治AD方面具有重要的研究價值。大量文獻已證明，PP2A活性降低可促進Tau蛋白過度磷酸化，最終導(dǎo)致NFTs形成[14]。因此，尋找能有效提高PP2A活性的藥物就成為AD防治的重要研究內(nèi)容，同時，查詢文獻又未發(fā)現(xiàn)BCP能作用于PP2A信號通路，逆轉(zhuǎn)AD的病理改變。因此，本研究擬采用大鼠腦海馬注射PP2A特異性抑制劑OA來構(gòu)建AD動物模型，再給予BCP處理，探討使用不同劑量的BCP是否具有改善OA誘導(dǎo)的AD模型大鼠認知功能障礙的作用，并探明此藥的量效關(guān)系和不同使用時間(即1周和2周兩個時間點)的藥效關(guān)系。

本實驗的水迷宮實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦海馬注射OA能導(dǎo)致大鼠空間學習記憶障礙，而該模型中不同劑量的BCP在使用1周和2周后，均可明顯改善OA誘導(dǎo)的AD模型大鼠空間學習記憶障礙，且呈劑量依賴性。提示BCP在行為學方面具有改善學習記憶能力的作用。

Fig 5 Effects of 1 week and 2 weeks of BCP administration on OA-induced synaptic proteins in SD rat n=10)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA injection

Fig 6 Effects of 1 week(A) and 2 weeks (B) of BCP administration on OA-induced Nissl body decrease in SD rat hippocampus n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsOA injection

為探明BCP增加學習記憶能力的機制，研究者又進行了Western blot實驗，以檢測PP2A信號通路中各相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCP能有效抑制AD模型大鼠腦海馬組織中PME的表達，該酶作用的底物蛋白PP2A總的表達量雖未見明顯變化，但PP2A的催化亞基——PP2Ac的甲基化、去甲基化和磷酸化水平均有明顯改變，其中PP2Ac甲基化水平升高，而去甲基化和磷酸化水平明顯降低，最終提高了PP2A活性。故研究者認為，兩個時間點的BCP均能通過抑制PME表達，來上調(diào)AD模型大鼠腦海馬中的PP2A活性。

BCP是否能夠通過上調(diào)PP2A活性來下調(diào)Tau的磷酸化水平呢？本研究又選取了與PP2A相關(guān)的Tau蛋白磷酸化特異性位點修飾情況進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予兩個時間點的BCP，即使腦海馬注射了PP2A特異性抑制劑，Tau蛋白pT181、pT231、pS396、pS404這4個位點的磷酸化水平也明顯下降(該4個位點的過度磷酸化均能不同程度促進NFTs的形成[15])，且與劑量密切相關(guān)。上述實驗結(jié)果提示，BCP能通過上調(diào)PP2A活性，來下調(diào)Tau蛋白特異性位點的磷酸化水平。

由于認知水平與海馬組織中突觸相關(guān)蛋白表達水平存在正相關(guān)，因此，我們又檢測了使用BCP后AD大鼠腦海馬中突觸相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCP灌胃1周和2周后，突觸相關(guān)蛋白Synapsin-1、NMDA-2B及Synaptophysin表達均明顯增高，其中、高劑量組尤為明顯。提示BCP可提高因PP2A活性下降導(dǎo)致的AD模型大鼠腦海馬組織中突觸相關(guān)蛋白的表達水平，促進突觸發(fā)育。

尼氏小體結(jié)構(gòu)變化能反映神經(jīng)元功能情況，當受損神經(jīng)元功能修復(fù)后，已溶解甚至消失的尼氏小體可重新出現(xiàn)[16]。為驗證BCP是否具有修復(fù)受損神經(jīng)元的功能，我們又進行了尼氏小體染色實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的BCP使用1周和2周后，均能使AD模型大鼠腦海馬CA1和CA3區(qū)尼氏小體數(shù)量增多，著色加深，并呈劑量依賴性。提示中、高劑量的BCP能在不同時間點增加尼氏小體的數(shù)量和分布，修復(fù)AD大鼠腦海馬受損神經(jīng)元。

綜上所述，BCP能有效改善OA誘導(dǎo)的AD模型大鼠認知功能障礙，其可能的作用機制是通過調(diào)節(jié)PP2A信號通路中各相關(guān)蛋白的表達水平，進而上調(diào)PP2A活性，最終降低了Tau蛋白的磷酸化水平。同時，還可通過上調(diào)PP2A活性，提高海馬組織中突觸相關(guān)蛋白表達水平，修復(fù)受損神經(jīng)元，且該藥效與其使用時間、劑量具有一定相關(guān)性。這一研究結(jié)果可為BCP的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，但要明確其有效作用成分還有賴于進一步的研究探討。