單分子技術(shù)在G蛋白偶聯(lián)受體二聚體中的應(yīng)用

蔡 欣，王春勇，王德秀，蘇文霞，魯 洪，王鳳斌

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053; 2. 壽光市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 壽光 262700)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)構(gòu)成最大的細(xì)胞膜受體超家族，是重要的藥物靶點(diǎn)，其相關(guān)藥物占市場上藥物的40～50%。大量研究表明，GPCRs不僅能以單體的形式發(fā)揮生物學(xué)作用，也可以相互作用形成同源/異源二聚體，甚至高階寡聚體，并具有獨(dú)特的功能，如Apelin受體(putative receptor protein related to AT1，APJ)和血管緊張素1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)形成的異源二聚體，配體Apelin能通過該二聚體，抑制血管緊張素介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化[1]。目前，GPCR二聚化的研究方法有很多，如免疫共沉淀、共振能量轉(zhuǎn)移等，這些技術(shù)能隱藏“噪音”，平均計(jì)算GPCR二聚體的潛在差異和異常，衡量其不同物理或化學(xué)狀態(tài)，但這些方法也隱藏了“噪音”中所含有的有價(jià)值信息，失去關(guān)于生物異質(zhì)性的有用數(shù)據(jù)。如用于表達(dá)GPCRs的細(xì)胞，盡管培養(yǎng)的細(xì)胞具有遺傳一致性，但本質(zhì)上成分仍是異質(zhì)的，這種異質(zhì)性在物種進(jìn)化上是非常重要的，能使生物體在波動(dòng)的環(huán)境中迅速適應(yīng)，給生物體帶來生物優(yōu)勢，最終生存下來。但這些方法需要較高的受體表達(dá)水平，受體過表達(dá)可能改變生理特性，引起不依賴配體的受體激活等。相比較而言，單分子技術(shù)提供了一個(gè)直接的窗口，并能克服樣品同步性的需求，通過記錄受體復(fù)合物的熒光強(qiáng)度或追蹤隨著時(shí)間變化的運(yùn)動(dòng)軌跡，更詳細(xì)和系統(tǒng)地研究細(xì)胞膜上GPCR二聚體的亞單位組成、軌跡均方位移、擴(kuò)散系數(shù)等，從而揭示罕見的中間狀態(tài)和隱藏的動(dòng)力學(xué)途徑[2]，這些是GPCRs實(shí)現(xiàn)不同的新功能和多種生理功能所必需的基礎(chǔ)，也是藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)。本文將對(duì)研究GPCR二聚化的單分子技術(shù)進(jìn)行簡要綜述。

1 GPCR二聚體在藥理學(xué)方面的重大潛力

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，GPCRs的信號(hào)通路是線性的，即正位激動(dòng)劑與受體的正位作用位點(diǎn)結(jié)合，激活G蛋白，引起一系列下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，但是由于正位作用位點(diǎn)保守性很強(qiáng)，正位激動(dòng)劑與其結(jié)合的親和力較大，因此目前很難對(duì)正位激動(dòng)劑進(jìn)行新藥開發(fā)。近幾十年，研究人員將目光轉(zhuǎn)向了一種新作用位點(diǎn)——?jiǎng)e構(gòu)位點(diǎn)，別構(gòu)調(diào)節(jié)劑與受體的別構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，使受體構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致與該受體相互作用的蛋白功能改變，別構(gòu)位點(diǎn)的出現(xiàn)不會(huì)影響正位激動(dòng)劑與正位作用位點(diǎn)的結(jié)合，反而會(huì)調(diào)節(jié)正位激動(dòng)劑的藥理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在GPCR二聚化中，一個(gè)受體被刺激后，通過別構(gòu)調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)另一個(gè)受體的正位配體的藥理學(xué)特性，從而改變下游信號(hào)傳導(dǎo)，如AT1R-B2R異源二聚化可增加AT1R對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性，這對(duì)先兆子癇綜合癥的發(fā)生起關(guān)鍵作用[3]。在GPCRs中，結(jié)構(gòu)不對(duì)稱會(huì)引起空間限制，影響信號(hào)復(fù)合體的排列，并最終在變構(gòu)功能中發(fā)揮作用。單粒子追蹤方法顯示，A1/A2AR異源二聚體以菱形排列，這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)對(duì)下游信號(hào)和功能具有重大影響。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在Ghrelin受體和多巴胺D2受體(dopamine D2receptor，D2R)形成異源二聚體中，Ghrelin受體作為變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，而不是信號(hào)受體，明顯改變D2R的信號(hào)[4]，該結(jié)果可以解釋異源二聚體在標(biāo)準(zhǔn)藥物篩選中很難檢測到的原因，其中一個(gè)受體可能只是另一個(gè)受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，而不是作為信號(hào)受體傳遞自己的信號(hào)。

GPCR二聚體具有非常大的藥物潛力，因此備受關(guān)注，其藥理學(xué)作用也越來越受到重視。阿片類受體二聚體的藥理學(xué)作用已被證明，研究發(fā)現(xiàn)，阿片受體的激動(dòng)劑6′-Guanidinonaltrindole(GNTI)不能單獨(dú)激活κ阿片受體(κ opioid receptor，κOR)或δOR，卻能選擇性地激活κOR-δOR異源二聚體，異源二聚體的組織特異性強(qiáng)，能夠降低藥物的副作用，將6′-GNTI注射到老鼠脊髓內(nèi)可以觀察到鎮(zhèn)痛作用，所以κOR-δOR異源二聚體的研究有利于鎮(zhèn)痛藥的研發(fā)[5]。目前，作用于κOR-δOR異源二聚體的二價(jià)配體藥物也在被研發(fā)，提供了潛在的新療法。二價(jià)配體包含了通過間隔連接的κOR選擇性拮抗劑5′-GNTI和δOR選擇性拮抗劑納曲吲哚(naltrindole)[6]。眾所周知，α1腎上腺素能受體(α1adrenergic receptor，α1AR)能夠調(diào)節(jié)血管功能，在臨床上可以靶向控制血壓。最近研究表明，CXCR4的跨膜肽TMD2能夠阻斷CXCR4-α1AR二聚體的形成，從而抑制α1AR對(duì)血管平滑肌收縮作用[7]。靶向GPCR二聚體的藥物有望能夠治療多種疾病，雖然目前取得的成果不多，但隨著GPCR二聚體知識(shí)的不斷增長，會(huì)取得更多的成果。

2 GPCR二聚體的時(shí)空動(dòng)態(tài)新型檢測法——單分子技術(shù)

2.1 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)(total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM)對(duì)于所有分子來說，必須先通過細(xì)胞膜才能進(jìn)出細(xì)胞，因此，在細(xì)胞膜上或附近發(fā)生著許多生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的顯微鏡技術(shù)(如熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等)很難對(duì)這些過程進(jìn)行成像，但TIRFM能夠分析活細(xì)胞膜附近一些分子的定位情況和動(dòng)力學(xué)過程，如膜蛋白定位、胞吞過程等。其原理是當(dāng)一束光從光密介質(zhì)進(jìn)入光疏介質(zhì)時(shí)，根據(jù)斯涅耳定律，一部分光會(huì)發(fā)生折射，而一部分光會(huì)發(fā)生反射，當(dāng)入射角不斷增大，折射角也會(huì)不斷增大，當(dāng)折射角剛好達(dá)到90度時(shí)，就發(fā)生了全反射現(xiàn)象。全反射發(fā)生后，光波不會(huì)被反射回第一介質(zhì)，由于光的波粒二相性，其中一部分能量會(huì)進(jìn)入折射率較小的介質(zhì)，沿著折射面?zhèn)鞑?，這部分光我們稱為隱失波，其能量在Z軸上呈指數(shù)衰減(Fig 1A)。因此，隱失波在照明樣品時(shí)，僅激發(fā)樣本表面薄層范圍內(nèi)的熒光基團(tuán)，同時(shí)減弱來自胞內(nèi)區(qū)域的熒光，使顯微成像在Z軸上的空間分辨率得到明顯改善，Z軸分辨率可達(dá)40～150 nm，大大提高了圖像的信噪比[8]。

TIRFM能夠提供納米級(jí)的分辨率和極快速的成像，用于微小結(jié)構(gòu)和單分子成像，如細(xì)胞膜上單個(gè)蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究、細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像等。目前，應(yīng)用TIRFM從單分子層次對(duì)GPCR二聚體的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)N-甲酰肽受體(N-formyl peptide receptor，F(xiàn)PR)同源二聚體的解離和2D結(jié)合速率分別為11.0 s-1和3.1[copies/μm2]s-1，在1 s內(nèi)，F(xiàn)PR就能完成單體和二聚體相互轉(zhuǎn)化的過程[9]。TIRFM與SNAP-tags技術(shù)聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)β-AR二聚體(20.5 ℃)壽命約為4 s，比FPR二聚體(37 ℃)長約40倍，比毒蕈堿M1受體二聚體(23 ℃)長約6倍[10]。由于膜蛋白的連續(xù)和隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，蛋白分子之間會(huì)發(fā)生隨機(jī)碰撞，因此要控制分子的表達(dá)水平。本課題組利用TIRFM發(fā)現(xiàn)APJ能以單體、同源二聚體和寡聚體的形式存在，且在顆粒密度小于0.3顆粒/μm2的情況下，單體、二聚體和寡聚體分別占有不同比例。另外，單個(gè)APJ之間存在瞬時(shí)相互作用，不斷形成和分解新的受體復(fù)合物[11](Fig 1B、1C)。

2.2 受激發(fā)射損耗(stimulated emission depletion, STED)顯微技術(shù)雖然傳統(tǒng)顯微鏡(如熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等)和TIRFM能夠解決生命科學(xué)領(lǐng)域的很多問題，但是衍射現(xiàn)象限制了他們的空間分辨率，衍射極限可用Abbe′s law量化[12]，公式如下：dx,y=λ/2NA；dz=2λ/NA2。dx,y指的是橫向分辨率，dz指的是縱向分辨率，λ為激發(fā)光波長，NA為顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑。根據(jù)公式，能夠清晰地計(jì)算出最高橫向分辨率為180 nm，最高縱向分辨率為500 nm。Hell等在1994年提出STED概念，于2014年獲得諾貝爾獎(jiǎng)[13]。該技術(shù)能夠突破這種衍射極限，Z軸分辨率可達(dá)40～150 nm，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。其原理是樣品被兩束激光以高?qiáng)度脈沖形式照射，第1束激光(Exc beam)用于激發(fā)熒光分子，第2束激光(STED beam)用于損耗熒光分子，將熒光分子的周圍從受激狀態(tài)返回到基態(tài)。損耗激光的光路產(chǎn)生1個(gè)呈圓環(huán)型的能量分布，即圓環(huán)型的STED光，從而大大縮小有效的熒光檢測區(qū)域，使樣品發(fā)射熒光的體積限制在非常小的范圍內(nèi)，只能檢測沒有完全損耗的熒光分子的中心，從而提高分辨率。這一技術(shù)可用于活細(xì)胞和固定樣品的成像，在一些生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，如細(xì)胞膜上和泡囊中蛋白質(zhì)的分布與動(dòng)態(tài)過程等。Van Laar等[14]利用STED，研究軸突內(nèi)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸部位處線粒體DNA的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)在帕金森相關(guān)應(yīng)激條件下，線粒體生物發(fā)生會(huì)根據(jù)解剖分區(qū)的方式不同而改變，有助于神經(jīng)退行性疾病的治療。STED具有多種類型，如多色STED、脈沖STED、連續(xù)波[continuous-wave(CW)]STED和Gate STED等[15]。多色STED通過添加多個(gè)Exc beam和利用同一STED beam進(jìn)行，激光束具有不同的激發(fā)光譜，但是具有相似的發(fā)射尾。脈沖STED使用脈沖式的激發(fā)光和損耗光，在短時(shí)間內(nèi)發(fā)出大量的激發(fā)光，從而有效地將熒光分子周圍的熒光淬滅，提高空間分辨率。一般來說，激發(fā)光的脈沖比損耗光的脈沖要短，損耗光的脈沖比熒光分子的振動(dòng)馳豫的時(shí)間要長，但是比熒光分子的壽命要短。脈沖STED的優(yōu)點(diǎn)是損耗時(shí)只需相對(duì)較低的平均功率；而且，由于較低重復(fù)頻率的使用，熒光在被激發(fā)之前，在三重態(tài)馳豫中就能發(fā)出熒光，從而減少了光漂白[16]。另外，由于一些熒光的自發(fā)光能夠忽略掉脈沖激光，所以連續(xù)的激光仍在被使用，CW STED用連續(xù)激光(可見光和近紅外光)代替脈沖激光，降低了系統(tǒng)的復(fù)雜性(不需要脈沖光)和費(fèi)用，增加系統(tǒng)的用途。CW STED中，熒光在激發(fā)狀態(tài)呆的時(shí)間越長，損耗光將該熒光從受激狀態(tài)返回到基態(tài)的可能性就越大，但是由于連續(xù)激光的峰強(qiáng)度較低，所以分辨率比脈沖STED的分辨率較低。為了解決這個(gè)問題，Gate STED應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)將CW STED與時(shí)間門控檢測聯(lián)系起來，CW STED中，熒光分子被激活后，延遲一段時(shí)間后再收集熒光，那么淬滅熒光的相對(duì)概率將升高，原因是損耗光對(duì)熒光的耗損依賴于在激發(fā)態(tài)下熒光團(tuán)暴露的光子數(shù)量，熒光光子在熒光團(tuán)激發(fā)之后被收集，這就確保所收集的熒光源已經(jīng)處于激發(fā)態(tài)至少一段時(shí)間。而時(shí)間門控可以忽略掉早期熒光的發(fā)射光子，激發(fā)熒光和收集熒光之間延遲的時(shí)間越長，越可以確保記錄的主要是熒光中心的熒光團(tuán)，有效空間分辨率越高(Tab 1)。

Fig1AssessmentofGPCRdimerwithTIRFMA:Principle of TIRFM. n1(refractive index of the sample) is less than n2(refractive index of the cover slip). The excitation beam enters from the left at incidence angle(θ), which is greater than the critical angle c(θc). The excitation beam is reflected off the cover-slip-sample interface and an evanescent field is generated on the opposite side of the interface in the sample. Only fluorophores in the evanescent field are excited, as indicated by the green particles; B: TIRFM image of cells expressing APJ-GFP; C: Single-molecule co-tracking of APJ homodimers by TIRFM.

2.3 單分子定位顯微技術(shù)單分子定位顯微技術(shù)，如基態(tài)耗盡顯微術(shù)(ground state depletion，GSD)、光敏定位顯微術(shù)(photoactivatable localization microscopy，PALM) 和隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，能連續(xù)激活和定位熒光，從而避免光的衍射極限，主要原理是熒光信號(hào)以單分子的形式被激活，通過函數(shù)擬合，計(jì)算出單分子熒光光斑的中央位點(diǎn)，經(jīng)過上萬次循環(huán)的依次激活和計(jì)算，從而得出完整的超高分辨率圖像，分辨率高達(dá)10～75 nm。該類技術(shù)缺點(diǎn)是需要對(duì)批量圖片進(jìn)行后處理算法，因而有可能產(chǎn)生假象。GSD通過減少同時(shí)發(fā)射熒光團(tuán)的數(shù)目來克服衍射極限，成像速度為2～10 min/幅，高能激光激發(fā)熒光團(tuán)標(biāo)記的樣品，光子轟擊電子，增加“自旋翻轉(zhuǎn)”的概率，使熒光團(tuán)由激發(fā)態(tài)進(jìn)入三重態(tài)或“暗態(tài)”，在三重態(tài)中，熒光團(tuán)不發(fā)射光子，樣品顯得更暗，有效地耗盡了基態(tài)，因此命名為“GSD”[17]。這些熒光團(tuán)可以隨機(jī)地返回到基態(tài)，并且可以在返回到三重態(tài)之前，經(jīng)歷激發(fā)到基態(tài)躍遷的多個(gè)光子發(fā)射，在任何給定時(shí)間內(nèi)，單個(gè)熒光團(tuán)發(fā)射的光子在空間和時(shí)間上與相鄰的熒光團(tuán)不同。光子的爆發(fā)可以與高斯函數(shù)擬合，計(jì)算的質(zhì)心對(duì)應(yīng)于熒光團(tuán)的位置，定位精度取決于透鏡的數(shù)值孔徑、激發(fā)光的波長和每個(gè)熒光團(tuán)發(fā)射的光子數(shù)量[3]。GSD在任何時(shí)間只有一組熒光團(tuán)主動(dòng)發(fā)射，所以必須幾分鐘內(nèi)收集數(shù)以千計(jì)的圖像，從而建立一個(gè)完整的定位圖，由于較長的采集時(shí)間與高功率激光，GSD更適合于固定的而不是活的樣品。

PALM與STORM的成像速度相同，均為5～20 min/幅，二者之間的主要差異是熒光激活和成像的順序，在PALM中，熒光被隨機(jī)激活，然后成像，再激活和成像，如此進(jìn)行多個(gè)循環(huán)，直到檢測到目標(biāo)分子的所有位置。而在STORM中，熒光激活和成像同時(shí)進(jìn)行，能夠明顯提高數(shù)據(jù)收集的速度。PALM可用于單分子追蹤，在給定時(shí)間內(nèi)激發(fā)一個(gè)或極少數(shù)的熒光團(tuán)，使衍射極限區(qū)域不重疊，重復(fù)激發(fā)循環(huán)直到檢測到目標(biāo)分子的所有位置，然后將其組裝到最終圖像中。目前，利用PALM發(fā)現(xiàn)，促黃體激素受體能預(yù)先形成同源二聚體和具有不同空間構(gòu)型的寡聚體，改變寡聚體的不對(duì)稱性將調(diào)節(jié)信號(hào)的敏感性和強(qiáng)度[18]。

Tab1DifferencesbetweenSTEDandconfocalscanningmicroscope

2.4 結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(structured illumination microscopy，SIM)SIM在乳腺癌細(xì)胞中檢測到雌激素受體(estrogen receptor，ER)能形成同源/異源二聚體，且占有比例不同，如ERα/α同源二聚體占有23.0%、 ERα/β2異源二聚體18.1%[19]。SIM以一系列具有高空間頻率的正弦條紋激光為光源，對(duì)樣品進(jìn)行掃描，這種光源是激光穿過可移動(dòng)光柵，并通過物鏡投射到樣品上產(chǎn)生的，顯微鏡光路中的柵格與衍射極限下的樣品結(jié)構(gòu)圖像疊加會(huì)產(chǎn)生摩爾紋，當(dāng)柵格處于不同相位和角度時(shí)，摩爾紋圖案也會(huì)發(fā)生變化，通過多張摩爾紋圖像的計(jì)算，把低頻信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哳l信號(hào)，重建成一個(gè)具有兩倍寬場分辨率的高分辨率圖像，橫向分辨率提高至100～130 nm，縱向分辨率提高至280～350 nm[20]。由于受限于多次柵格旋轉(zhuǎn)平移所需時(shí)間和曝光時(shí)間，SIM的成像速度小于1幅/s。

與其他超高分辨率技術(shù)相比，SIM有兩個(gè)突出優(yōu)勢：首先，縱向分辨率的提高能明顯改善焦點(diǎn)失調(diào)問題，提高信噪比；其次，適用染料為常規(guī)熒光蛋白，沒有特定的性能要求，因此適用多色成像。在細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用中，SIM的一個(gè)重要特征是可以使用標(biāo)準(zhǔn)染料和染色方法，通過光學(xué)切片在三個(gè)維度中同時(shí)成像多個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。但是SIM圖像為多幅圖片計(jì)算實(shí)現(xiàn)，很容易產(chǎn)生假象并容易引起光漂白，另外對(duì)球面像差敏感，在球面像差存在的條件下，照明圖像退化，因此，在較高頻率下獲得的信息量減少。在玻璃、透鏡浸沒介質(zhì)和生物樣品之間折射率失配導(dǎo)致的球面像差中，很難觀察離蓋玻片較遠(yuǎn)的區(qū)域。

2.5 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(single-molecule fluorescent resonance energy transfer，smFRET)FRET采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近(<10 nm)時(shí)，通過雙偶極反應(yīng)，將光子從一個(gè)受激發(fā)的熒光團(tuán)(供體)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)(受體)。供體的放射光譜必須將受體的激發(fā)光譜重疊起來，適合FRET實(shí)驗(yàn)的常用熒光團(tuán)對(duì)為CFP/YFP、GFP/羅丹明和FITC/Cy3等。采用FRET可以解決光學(xué)顯微鏡分辨率限制的分子相對(duì)鄰近度問題，來顯示蛋白質(zhì)間的相互作用、一個(gè)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化等。當(dāng)兩個(gè)染料發(fā)射波長相差很大時(shí)，采用敏化發(fā)射(sensitized emission，SE)FRET，要獲得FRET圖像，首先要先確定系數(shù)A和系數(shù)B，系數(shù)A主要指的是受體對(duì)FRET信號(hào)的干擾，系數(shù)B主要指的是供體對(duì)FRET信號(hào)的干擾。公式如下：Corrected FRET=RawFRET-(A×Acceptor)-(B×Donor)。本課題組利用SE FRET檢測到APJ-神經(jīng)降壓素1型受體(neurotensin receptor type 1，NTSR1)異源二聚體的存在(Fig 2)，該二聚體能通過Gαq介導(dǎo)，增加ERK1/2磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]。當(dāng)兩個(gè)染料發(fā)射波長相差很小，容易引起串色時(shí)，采用特定滲透FRET，公式如下：Corrected FRET=RawFRET-[(Acceptor-(Donor in Acceptor×Donor))×(Acceptor in FRET)]-[(Donor-(Acceptor in Donor×Acceptor) )-(Donor in FRET)]。

目前，在FRET基礎(chǔ)上又延伸出其他方法，如時(shí)間分辨FRET、光漂白FRET等，但是這些技術(shù)對(duì)GPCR二聚體的研究也是按總體平均水平進(jìn)行的。smFRET可通過測量供體、受體熒光光強(qiáng)以及二者間的共振能量轉(zhuǎn)移效率，揭示標(biāo)記位點(diǎn)間的距離[22]，常用熒光團(tuán)對(duì)為Cy3/Cy5、Cy3B/ATTO 647N。激光激發(fā)目的蛋白上的供體熒光分子(Cy3)，供體熒光分子轉(zhuǎn)移部分能量到受體熒光分子(Cy5)，兩者發(fā)出的熒光經(jīng)分光光路，分成中心波長在568 nm和675 nm的平行兩束，后被EM-CCD收集。供體與受體熒光點(diǎn)的信號(hào)分別成像于CCD視野的左右半?yún)^(qū)，實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)其坐標(biāo)對(duì)應(yīng)關(guān)系將來自同一被標(biāo)記物上的供體與受體熒光點(diǎn)匹配。Dijkman等[23]利用smFRET發(fā)現(xiàn)，NTSR1能形成同源二聚體，且存在濃度依賴的瞬時(shí)相互作用，具有多個(gè)亞穩(wěn)態(tài)交界面。

3 總結(jié)

目前觀察到的一些研究和臨床現(xiàn)象很難確定是否為受體二聚化的作用結(jié)果，但受體二聚化是能夠解釋這些現(xiàn)象的因素之一，如一些抗帕金森和抗精神病的藥物，被認(rèn)為對(duì)GPCR單體具有特異性作用，但很可能對(duì)GPCR二聚體也具有特異性作用，所謂的“不純藥物”的脫靶效應(yīng)可能是由于他們結(jié)合GPCR二聚體引起的。單分子技術(shù)為GPCR二聚體的研究提供了新的研究和藥物研發(fā)方向，結(jié)合不斷增長的GPCR二聚體結(jié)構(gòu)方面的知識(shí)，將會(huì)獲取更多的成果。目前有將技術(shù)結(jié)合用于研究GPCR二聚體，如本課題組將TIRFM和BiFC結(jié)合起來，檢測到APJ能夠形成同源二聚體。多種技術(shù)的結(jié)合在GPCRs二聚體研究中發(fā)揮了重要作用，能從“時(shí)間、空間、動(dòng)態(tài)、連續(xù)”檢測更多GPCRs之間的相互作用，這對(duì)于疾病發(fā)病機(jī)制的研究及新型藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)具有深遠(yuǎn)意義[24]。

Fig 2 Assessment of APJ-NTSR1 heterodimer with SE FRET

HEK293 cells were cotransfected with pCFP-NTSR1 and/or pYFP-APJ. 24 h after transfection, and fluorescent images were acquired using MetaFluor 7.0 Software.