殺草丹半抗原及其人工抗原的制備與鑒定

蔡陳芳,周常義,曾 磊,江 鋒,楊名平,蘇國成,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.廈門中集信檢測技術有限公司,福建廈門 361100)

殺草丹(Thiobencarb)是由日本組合化學公司在上世紀70年代開發(fā)的一種具有選擇性、內(nèi)吸傳導性除草劑,屬于硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥,其化學名為S-(4-氯芐基)-二乙基硫代氨基甲酸酯,中文別名為禾草丹、滅草丹、稻草完,分子式為C12H16ClNOS,結構式如圖1所示[1]。殺草丹既可單獨用于作業(yè),也可與其它農(nóng)藥試劑混合配制使用,廣泛應用在稻麥田、蔬菜田和果園中防除多種雜草。早期,殺草丹農(nóng)藥殘留量的檢測主要集中在谷物類和蔬菜類產(chǎn)品上。殺草丹農(nóng)藥殘留對水生生物、動物機體有顯著的毒害作用,并可通過食物鏈富集對人類健康造成影響[2-5]。近些年來,關于動物源食品中殺草丹農(nóng)藥殘留檢出限量普遍受到各國的重視。部分國家對于植物源或動物源食品中殺草丹農(nóng)藥殘留檢出限量值的要求如表1所示[6]。

圖1 殺草丹化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of thiobencarb

表1 部分國家地區(qū)對于植物源和動物源食品中殺草丹農(nóng)藥殘留的檢出限量值Table 1 Determination limits of thiobencarb residue for food of plant or animal origin in some countries

當前,針對殺草丹農(nóng)藥殘留量檢測使用的方法主要是氣相/液相色譜法[7-8]和氣相/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-10],而使用免疫分析方法作為檢測手段的文獻資料較少。Robert等[11]研究一小部分硫代氨基甲酸類農(nóng)藥與三嗪類農(nóng)藥半抗原的設計要點,為獲取高質(zhì)量特異性抗體提供資料參考。Shiro 等[12]合成了一種殺草丹半抗原并制備出單克隆抗體,利用競爭性酶聯(lián)免疫法對谷物和水質(zhì)中殺草丹農(nóng)藥殘留量進行檢測。

免疫分析方法的建立,關鍵技術在于能獲取到特異性強的抗體[13]。要實現(xiàn)這一目標,前提條件就得合成制備出合適的人工抗原。殺草丹化學結構穩(wěn)定,直接進行修飾引入活性基團形成半抗原所需反應條件較為劇烈、苛刻[14]。為使分子結構中氯苯環(huán)最大限度的暴露出來,本研究利用乙基羥乙胺、升華硫、一氧化碳氣體、對氯氯芐和琥珀酸酐等原材料,借鑒羰基化法,通過兩步化學反應合成殺草丹半抗原,進而偶聯(lián)載體蛋白制備出具有免疫原性的殺草丹人工抗原,為下一步動物免疫實驗獲取抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙基羥乙胺、升華硫、對氯氯芐、無水碳酸鉀、無水吡啶、考馬斯亮藍G250、乙酸乙酯、石油醚、乙腈(色譜級)、溴化鉀粉末(光譜級) 均為分析純(除特殊標注外),國藥集團;琥珀酸酐、N,N-二甲基亞酰胺(DMF)、N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA) Aladdin公司;殺草丹原藥(純度≥98%) 武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司;一氧化碳氣體 廈門空分特氣實業(yè)有限公司;柱層析硅膠(300～400目) 青島市基意達硅膠試劑廠;GF254硅膠板 青島海洋化工有限公司。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 東莞市普標實驗科技有限公司;3-30KS冷凍離心機 德國SIGMA公司;VR10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、C-MAG MS7磁力攪拌器 德國IKA公司;高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國WARIAN公司;Nicolet iS 50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司;UV-1800型紫外可見分光光度計 島津公司;F97 Pro熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司;Milli-Q Reference超純水儀 蘇州賽恩斯儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 羥基化殺草丹溶液配制:稱取0.0100 g羥基化殺草丹樣品,用色譜級乙腈稀釋定容至10 mL,其濃度為1 mg/mL;用乙腈稀釋該溶液,配制所需濃度溶液,貯藏于4℃冰箱備用。

殺草丹半抗原溶液配制:稱取0.0100 g殺草丹半抗原樣品,用色譜級乙腈稀釋定容至10 mL,其濃度為1 mg/mL;用乙腈稀釋該溶液,配制所需濃度溶液,貯藏于4 ℃冰箱備用。

磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)配制:稱取8.00 g氯化鈉、2.92 g十二水磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀于1000 mL燒杯中,加入900 mL超純水溶解,并用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=7.40,最終用超純水定容至1000 mL,置于4℃冰箱中備用。

牛血清蛋白BSA溶液配制:用pH=7.40、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為5 mg/mL牛血清蛋白BSA溶液,貯藏于4 ℃冰箱備用。

考馬斯亮藍G250染液配制:稱取0.1000 g考馬斯亮藍G250,溶于50 mL 95%的乙醇后,再加入100 mL 85%的磷酸,用超純水稀釋至1000 mL,過0.45 μm濾紙,染液分裝于500 mL棕色瓶中。

1.2.2 殺草丹半抗原合成路線 實驗以乙基羥乙胺、升華硫、一氧化碳氣體和對氯氯芐為原材料,通過化學反應合成羥基化殺草丹;然后在吡啶溶液中與琥珀酸酐反應,制備殺草丹半抗原[15-16]。殺草丹半抗原的合成路線如圖2。

圖2 殺草丹半抗原合成路線Fig.2 Synthesis of thiobencarb hapten注:1:羥基化殺草丹;2:殺草丹半抗原。

1.2.2.1 羥基化殺草丹合成 稱取0.96 g升華硫、3.85 g無水碳酸鉀,移取2 mL乙基羥乙胺、15 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液于500 mL兩口圓底燒瓶內(nèi),并將其置于45 ℃水浴鍋中反應。同時將一氧化碳氣體通入圓底燒瓶中,維持瓶中壓力大約0.1 MPa,化學反應進行6 h。稱取3.24 g對氯氯芐晶體溶于5 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液,將該溶液緩慢滴加入圓底燒瓶,20 min滴畢后,讓反應體系保溫反應2 h。

反應結束,往圓底燒瓶加100 mL超純水溶解稠狀深褐色反應產(chǎn)物,用60 mL乙酸乙酯萃取水溶液三次,收集有機相,用5 g無水硫酸鎂去除有機相溶液中水分,并過0.45 μm濾紙,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液。用25 mL甲醇溶解30 g柱層析硅膠粉末,填充層析柱。配制比例為2∶3的乙酸乙酯-石油醚洗脫液,對濃縮濾液過柱進行洗脫、分離。將收集洗脫物蒸發(fā)濃縮得到橙黃色濃稠物,貯藏于4℃冰箱備用。

1.2.2.2 羥基化殺草丹的鑒定 應用薄層層析色譜法分析鑒定該合成產(chǎn)物,用毛細管吸取微量產(chǎn)物樣液和殺草丹原藥,在硅膠板上點樣,放入層析缸中,以三氯甲烷-甲醇(體積比9∶1)混合溶液為展開劑,待溶劑達到硅膠板前言時,取出硅膠板自然條件下晾干,計算產(chǎn)物和殺草丹原藥各自比移值Rf,比移值計算公式如下。

應用質(zhì)譜法分析鑒定該合成產(chǎn)物,取溶解于0.1%甲酸-乙腈溶液中濃度為10 μg/mL羥基化殺草丹溶液進樣分析,進樣流速為0.2 mL/min,選擇ESI正離子模式,電噴霧電壓3000 V,毛細管電壓為40 V,離子源溫度105 ℃,輔助氣溫度350 ℃,碰撞氣為氬氣,進行一級質(zhì)譜掃描和二級質(zhì)譜掃描,分別獲取母離子質(zhì)荷比與子離子質(zhì)荷比。

1.2.2.3 殺草丹半抗原合成 稱取0.8350 g羥基化殺草丹、1.2080 g琥珀酸酐于250 mL圓底燒瓶中,加入5 mL無水吡啶,將燒瓶置于50 ℃水浴鍋中進行反應12 h,保持燒瓶處于輕微振蕩狀態(tài)。室溫下氮吹去除無水吡啶,燒瓶中加入10 mL 5%鹽酸溶液溶解反應產(chǎn)物,用60 mL乙酸乙酯分兩次萃取,收集有機相[17]。用5 g無水硫酸鎂粉末去除有機相中水分,過0.45 μm濾紙。40 ℃水浴中氮吹濃縮過濾后的有機相液體,收集晶體物質(zhì)。用乙酸乙酯二次結晶純化反應產(chǎn)物,最后干燥反應物,貯藏于4 ℃冰箱備用。

1.2.2.4 殺草丹半抗原的鑒定 應用質(zhì)譜法分析鑒定該合成物質(zhì),取溶解于0.1%甲酸-乙腈溶液中濃度為10 μg/mL殺草丹半抗原溶液進樣分析,進樣流速為0.2 mL/min,選擇ESI負離子模式,電噴霧電壓3000 V,毛細管電壓為60 V,離子源溫度105 ℃,輔助氣溫度350 ℃,進行一級質(zhì)譜掃描,獲取母離子質(zhì)荷比。

應用紅外光譜法中KBr 壓片法分析鑒定該合成物質(zhì),紅外光譜掃描儀運行參數(shù)設置:分辨率為4 cm-1,透光率范圍為0～100% T,波數(shù)范圍為4000～400 cm-1。具體操作方法:采集0.2000 g純KBr粉末壓片的背景紅外光譜,掃描0.2000 g純KBr粉末和0.2000 g合成物質(zhì)研磨混合壓片樣品,獲取圖譜信息,通過特征基團振動頻率分析,判斷合成物質(zhì)是否含有羧酸基團。

1.2.3 殺草丹人工抗原制備路線 人工抗原的制備采用碳二亞胺法(DCC法)[18-19],抗原中的載體蛋白選用牛血清蛋白BSA。人工抗原制備路線如圖3,先將殺草丹半抗原與N-羥基琥珀酰亞胺、N,N-二環(huán)己基碳二亞胺進行反應,獲得活性酯,然后再與載體蛋白偶聯(lián),制備人工免疫抗原。

圖3 殺草丹人工抗原制備路線Fig.3 Synthesis of artificail thiobencarb antigen

1.2.3.1 殺草丹人工抗原的制備 稱取0.2 mmol殺草丹半抗原、0.0230 g(0.2 mmol)N-羥基琥珀酰亞胺于100 mL燒杯中,加入2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液,置于26 ℃室溫下振蕩15 min,溶解反應物質(zhì)。接著加入0.25 mmol N,N-二環(huán)己基碳二亞胺,26 ℃室溫下振蕩過夜,反應時間達10 h。反應結束,將反應產(chǎn)物離心處理(5000 r/min,5 min),收集上清活性酯液,沉淀物用0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液洗滌1次,離心合并上清液。

1.2.3.2 殺草丹人工抗原的鑒定 配制系列濃度梯度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液和系列濃度梯度為10、25、50、100、200、250 μg/mL殺草丹半抗原溶液,采用紫外可見分光光度計掃描,測定方式選擇吸光值,峰值檢測閾值為0.001,掃描速度為中速,確定牛血清蛋白溶液和殺草丹半抗原溶液的最大吸收波長。再設置紫外掃描波長范圍200～400 nm,對殺草丹半抗原溶液、牛血清蛋白溶液和殺草丹人工抗原溶液進行光譜掃描,觀察對比三種溶液吸收峰,初步判斷人工抗原制備情況。

應用熒光光譜法分析鑒定制備的殺草丹人工抗原,設置激發(fā)波長為278 nm,激發(fā)寬帶10 nm,發(fā)射波長起止范圍200～900 nm,對一定濃度的殺草丹半抗原溶液、牛血清載體蛋白溶液和人工抗原溶液進行熒光光譜掃描,觀察對比三種溶液熒光光譜,進一步判斷人工抗原制備情況。

1.2.3.3 反應溫度對殺草丹人工抗原制備的影響 將一只裝有10 mL 5 mg/mL牛血清蛋白BSA溶液的燒杯置于26 ℃室溫條件下,往燒杯溶液中滴加入上清活化酯液;將另一只裝有10 mL 5 mg/mL牛血清蛋白BSA溶液的燒杯置于冰浴槽內(nèi),也往燒杯溶液中滴加入等量的上清活化酯液。磁力攪拌狀態(tài)下反應8 h。在冰浴和26 ℃室溫條件下各做3組平行試驗。結束反應后,將反應物全裝入經(jīng)前處理過的透析袋中,置于4 ℃環(huán)境下,用磷酸鹽緩沖液透析72 h,每8 h更換一次約400 mL的透析液,將獲得的人工抗原溶液分裝、保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.4 殺草丹人工抗原濃度的測定方法 參考人工抗原合成相關研究[20],通過測定人工抗原中蛋白質(zhì)濃度,近似估算為人工抗原的濃度。采用考馬斯亮藍法測定人工抗原中蛋白質(zhì)含量[21]。以牛血清蛋白BSA溶液濃度為橫坐標、其吸光度值為縱坐標的蛋白質(zhì)濃度標準曲線,然后依據(jù)標準曲線計算出人工抗原中蛋白質(zhì)的含量。通過對數(shù)據(jù)進行線性回歸擬合處理,得到了牛血清蛋白BSA濃度標準曲線的線性回歸方程式,即Y=10.125X+0.0081(Y為吸光度,X為牛血清蛋白濃度(mg/mL),R2=0.9994),吸光度符合線性要求。

1.2.5 殺草丹人工抗原偶聯(lián)比計算方法 采用紫外分光光度計對殺草丹半抗原溶液、牛血清載體蛋白溶液和人工抗原溶液進行200～600 nm波長的紫外光譜掃描,觀察三種物質(zhì)溶液吸收峰的變化,根據(jù)紫外吸收光譜圖初步判斷殺草丹半抗原是否與牛血清載體蠶白偶聯(lián)成功,并運用以下公式計算人工抗原中半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比[22]。

偶聯(lián)比計算公式為:

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中獲取的相關數(shù)據(jù),采用Microsoft Office Excel 2007軟件處理與計算;紅外、熒光、紫外等光譜圖的繪制利用Origin Pro 8.0軟件完成。

2 結果與分析

2.1 羥基化殺草丹的合成及鑒定

羥基化殺草丹樣品液與殺草丹原藥溶液經(jīng)薄層層析鑒定,結果圖4所示。殺草丹原藥溶液(點X1)和羥基化殺草丹樣品液(點X2)在點板后均只獲得一個明顯的黃顏色擴展點,測得殺草丹原藥溶液(點X1)比移值Rf=0.29和羥基化殺草丹樣品液(點X2)比移值Rf=0.35。殺草丹原藥純度大于98%，其薄層層析擴展良好，擴展點唯一且清晰明顯，而羥基化殺草丹樣品液薄層層析擴展與其對比，該擴展點也清晰顯現(xiàn)，表明羥基化殺草丹樣品液分離純化達到一定要求。

圖4 殺草丹原藥(X1)與羥基化殺草丹(X2)薄層層析圖譜Fig.4 The TLC spectrum of thiobencarb(X1) and hydroxyated thiobencarb(X2)

羥基化殺草丹的分子式為C12H16ClNO2S,經(jīng)過計算得到相對分子質(zhì)量為273.8。對其樣液進行質(zhì)譜分析,一級質(zhì)譜全掃描結果如圖5所示,在ESI(+)質(zhì)譜圖中的加H分子量為[M+H]=274.1,與計算分子量相符合。在母離子確定條件下,對樣液進行二級質(zhì)譜掃描,結果如圖6所示,羥基化殺草丹碎片子離子的質(zhì)荷比分別為116.0和124.9,與文獻資料報道相符[23]。由此可確定該合成產(chǎn)物為羥基化殺草丹。

圖5 羥基化殺草丹一級質(zhì)譜圖Fig.5 MS spectrum of hydroxyated thiobencarb

圖6 羥基化殺草丹二級質(zhì)譜圖Fig.6 MS/MS spectrum of hydroxyated thiobencarb

2.2 殺草丹半抗原的合成及鑒定

殺草丹半抗原的分子式為C16H20ClNO5S,相經(jīng)過計算得對分子質(zhì)量為373.7。采用毛細管法測定殺草丹半抗原的熔點,3次測定結果顯示該物質(zhì)熔程在182～184 ℃,說明合成的殺草丹半抗原晶體物純度較高、物質(zhì)穩(wěn)定性良好。殺草丹半抗原的ESI(-)質(zhì)譜圖如圖7所示,對其樣液進行一級質(zhì)譜全掃描,在ESI(-)質(zhì)譜圖中的減H分子量為[M-H]=372.0,與計算分子量相符合,初步判定該合成物為殺草丹半抗原。

圖7 殺草丹半抗原質(zhì)譜掃描圖Fig.7 MS spectrum of thiobencarb hapten

殺草丹半抗原樣品經(jīng)紅外光譜儀掃描后,獲取譜圖信息如圖8所示。對合成樣品物的紅外吸收光譜分析結果如表2所示。樣品物在3650～3580 cm-1附近出現(xiàn)明顯的-OH基團吸收峰和在1850～1660 cm-1附近出現(xiàn)明顯-C=O基團吸收峰,這是具有羧酸基團特征吸收頻率的表征,在紅外光譜中容易辨認[24],其它基團吸收峰也在相應波數(shù)附近出現(xiàn)。因此,進一步證明了該合成物為殺草丹半抗原。

圖8 殺草丹半抗原紅外掃描譜圖Fig.8 IR spectrum of thiobencarb hapten

表2 殺草丹半抗原紅外吸收分析表Table 2 IR analysis of thiobencarb hapten

2.3 殺草丹人工抗原的鑒定

2.3.1 牛血清蛋白與殺草丹半抗原紫外光譜中最大吸收波長的確定 采用紫外可見分光光度計分別掃描系列梯度濃度的牛血清蛋白溶液和殺草丹半抗原溶液如圖9、圖10所示。結果表明,牛血清蛋白最大吸收波長在278 nm、殺草丹半抗原最大吸收波長在221 nm。

圖9 牛血清蛋白溶液濃度梯度紫外掃描光譜圖Fig.9 Ultraviolet spectrum of the gradient concentration of bovine serum albumin solution

圖10 殺草丹半抗原溶液梯度濃度紫外掃描光譜圖Fig.10 Ultraviolet spectrum of the gradient concentration of thiobencarb hapten solution

2.3.2 人工抗原紫外可見光譜法分析 采用紫外可見分光光度計對殺草丹半抗原溶液、牛血清蛋白溶液和人工抗原溶液進行光譜掃描,紫外光譜掃描結果可見圖11,偶聯(lián)前殺草丹半抗原在221 nm 處有特征吸收峰,而牛血清載體蛋白在278 nm 處有特征吸收峰,偶聯(lián)后的人工抗原特征吸收峰出現(xiàn)在260 nm處,明顯不同于半抗原和載體蛋白吸收曲線,對比發(fā)現(xiàn)其吸收峰發(fā)生了偏移,可初步判定牛血清載體蛋白上面偶聯(lián)上了殺草丹半抗原分子。

圖11 殺草丹半抗原、牛血清蛋白和人工抗原紫外掃描光譜圖Fig.11 Ultraviolet spectrum of thiobencarb hapten, bovine serum albumin solution and artificial antigen

2.3.3 人工抗原熒光光譜法分析 采用熒光分光光度計對殺草丹半抗原溶液、牛血清載體蛋白溶液和人工抗原溶液進行光譜分析,熒光發(fā)射光譜圖如圖12。從圖中可以看出,殺草丹半抗原在掃描波長內(nèi)沒有熒光峰產(chǎn)生;牛血清載體蛋白在340 nm處有熒光峰出現(xiàn),這與文獻[25- 26]報道相一致,由于牛血清蛋白上含有色氨基酸殘基,而色氨基酸殘基與酪氨酸殘基能使蛋白質(zhì)產(chǎn)生內(nèi)源熒光,其熒光峰位于341 nm附近;人工抗原在340 nm處的熒光強度明顯降低,表明牛血清載體蛋白上偶聯(lián)了殺草丹半抗原分子,因為殺草丹半抗原是通過與載體蛋白中氨基反應而結合上的,致使載體蛋白上氨基酸殘基受到影響[27],進而表現(xiàn)為對牛血清載體蛋白具有一定熒光猝滅作用;同時在560 nm附近產(chǎn)生了新的熒光峰,這可能是殺草丹半抗原分子與牛血清載體蛋白形成的偶合物中有新的共軛體系形成[28],具有一定熒光特性,從而產(chǎn)生新的熒光特征峰。

圖12 殺草丹半抗原、牛血清蛋白和人工抗原熒光發(fā)射光譜圖Fig.12 Fluorescence emission spectrum of thiobencarb hapten,bovine serum albumin solution and artificial antigen

2.3.4 人工抗原中蛋白含量的確定與其偶聯(lián)比 在冰浴和26℃室溫反應溫度條件下,制備的殺草丹人工抗原中蛋白質(zhì)平均濃度分別為(1.963±0.020)和(2.589±0.023) mg/mL。殺草丹人工抗原的偶聯(lián)比計算結果如表3所示。

表3 不同反應溫度下制備的人工抗原偶聯(lián)比值Table 3 Coupling ratioof artificial antigen prepared under different temperature

由表3可看出,殺草丹人工抗原的偶聯(lián)比是受反應溫度影響的。在26 ℃室溫條件下反應獲得的殺草丹人工抗原,其偶聯(lián)比明顯高于冰浴條件下反應獲得的人工抗原,造成該現(xiàn)象的原因可能是反應溫度過低,致使載體蛋白活性下降,并影響載體蛋白空間結構,使載體蛋白上的自由氨基未能充分暴露出來,能夠產(chǎn)生偶聯(lián)作用的點位減少,不利于與活性酯液反應[29]。與此同時,制備的人工抗原偶聯(lián)比越高大,表明載體蛋白分子上連接上半抗原數(shù)目越多,越有利用提高人工抗原的免疫原性[30],因此選擇26 ℃室溫條件作為制備殺草丹人工抗原的最佳反應溫度。

3 結論與討論

本研究應用薄層層析法和質(zhì)譜法可準確鑒定羥基化殺草丹合成成功,應用質(zhì)譜法和紅外光譜法可鑒定出殺草丹半抗原成功合成并含有羧酸基團,從而利于后續(xù)殺草丹半抗原及殺草丹人工抗原的成功合成。試驗結果發(fā)現(xiàn),26 ℃室溫條件下制備的殺草丹人工抗原,其紫外可見光譜吸收峰發(fā)生了明顯藍移,吸收峰出現(xiàn)在260 nm波長處,異于牛血清蛋白與殺草丹半抗原的吸收峰,其熒光光譜在340 nm處的熒光強度也有顯著削弱,并且在560 nm處有新的熒光峰產(chǎn)生,均表明殺草丹人工抗原制備成功;同時該條件下制備出的人工抗原偶聯(lián)效果較佳,殺草丹半抗原與牛血清載體蛋白的偶聯(lián)比達6.59∶1,處于適宜偶聯(lián)比5∶1～25∶1范圍內(nèi)[31]。

試驗中研究制備出殺草丹半抗原結構與Shiro等[12]研究制備的殺草丹半抗原結構存在一定的相似特點,即制備出的兩種半抗原最大程度上保留了殺草丹分子結構,半抗原上的偶聯(lián)橋臂均具有3～6個直連碳原子,符合設計要求,可增強殺草丹半抗原與大分子載體蛋白的偶聯(lián)效率,因此本研究殺草丹半抗原制備方法嚴格遵循小分子農(nóng)藥半抗原設計合成基本原則,制備殺草丹半抗原的新路徑具有可行性。

在人工抗原制備上,目前選用的載體蛋白有牛血清蛋白(BSA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HAS)、兔血清白蛋白(RSA)、雞卵清蛋白(OVA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等[32]。由于牛血清蛋白具有良好溶解性、理化性質(zhì)穩(wěn)定、廉價易得、且自由氨基數(shù)量多等優(yōu)點,故常用作載體蛋白[33]。半抗原偶聯(lián)上載體蛋白,不僅可增大其自身分子量,還可利用大分子載體蛋白所具有的強免疫原性去刺激、誘導機體發(fā)生免疫應答,產(chǎn)生特異性抗體。據(jù)研究報道,當前小分子農(nóng)藥半抗原與載體蛋白進行偶聯(lián)的方法較為多樣,有碳二亞胺法、混合酸酐法、琥珀酸酐法、活性酯法、重氮法、戊二醛法、光氣法等等,而偶聯(lián)方法的選擇,主要依據(jù)半抗原分子上所帶活性基團的種類(如-COOH、-OH、-NH2、-SH等)、溶解度、穩(wěn)定性來決定[34]。試驗中合成的殺草丹半抗原具有羧基基團,因此選擇操作便捷、反應產(chǎn)率較高的碳二亞胺法進行殺草丹人工抗原制備。

目前國內(nèi)關于殺草丹人工抗原的制備鮮有報道,市場上相應的免疫分析快速檢測試紙條或試劑盒也沒有成品銷售。本研究中合成制備殺草丹半抗原利用的原材料較易獲取、價格便宜,且操作工藝簡單,反應條件溫和,有益于規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn);制備出的殺草丹人工抗原,可為進一步動物免疫實驗獲取并篩選出高質(zhì)量、特異性強的抗體提供參考性技術資料,并推進殺草丹快速免疫分析檢測方法的建立。