植煙土壤高活性氨化菌的篩選鑒定及其氨化能力分析

王小花　黃鶯　陳雪　夏梓林　代飛　劉昌　張恒

摘? 要：為調(diào)控植煙土壤有機(jī)態(tài)氮分解，從貴州省威寧縣和湄潭縣植煙土壤分離出52株氨化細(xì)菌。通過納氏試劑法和氨化菌培養(yǎng)液培養(yǎng)法篩選，發(fā)現(xiàn)W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9、Z50對有機(jī)氮具有較強(qiáng)的分解效果。16S rDNA序列分析表明，菌株W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9和Z50分別屬于金黃桿菌屬、泛菌屬、芽孢桿菌屬、簡單芽孢桿菌屬、梭形桿菌屬、芽孢桿菌屬、土壤桿菌屬、巨大芽孢桿菌屬、短波單胞菌屬和節(jié)桿菌屬。通過氨化菌培養(yǎng)液培養(yǎng)法對菌株的分解能力測定表明，培養(yǎng)72 h后，Z9菌株的有機(jī)氮分解能力顯著（≤0.05）高于其余9株，分解效果達(dá)到46.1%～93.4%。室內(nèi)有機(jī)肥培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，施用菌株處理的無機(jī)氮含量均高于不施用菌株處理（CK），培養(yǎng)65 d時各菌株處理較CK處理無機(jī)氮含量增加了550.80～1823.71 mg/kg，添施菌株使無機(jī)氮含量提高了1.15～1.49倍。研究結(jié)果可用于有機(jī)氮分解復(fù)合微生物菌劑的配置。

關(guān)鍵詞：植煙土壤;有機(jī)態(tài)氮;氨化細(xì)菌;篩選;分解能力

中圖分類號：S572.01?? ???????文章編號：1007-5119（2019）03-0031-08????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.005

Abstract： To regulate the decomposition of organic nitrogen in tobacco soil， 52 strains of ammoniated bacteria were isolated from the soil of Weining and Meitan. After screening by the Nessler's reagent method and the ammoniated culture medium culture method， bacterial strains W2， W4， W6， W12， W16， Z3， Z6， Z15， Z9 and Z50 with strong decomposition effects on organic nitrogen were identified. 16S rDNA sequence analysis indicated that strains W2， W4， W6， W12， W16， Z3， Z6， Z15， Z9 and Z50 belong to ， ， sq.， ， ， sq.， ， ， B and . The results from the ammoniated culture medium culture method showed that the organic nitrogen decomposition ability of Z9 was significantly higher （≤0.05） than that of the other 9 strains after 72 h of culture， with the decomposition effect of 46.1%-93.4%. The results of indoor organic fertilizer culture test showed that the inorganic nitrogen content of the treatment with bacterial strains was higher than that of the treatment without bacteria （CK）， the inorganic nitrogen content of the treatment with bacterial strains increased 550.80-1823.71 mg/kg after 65 days of cultivation， and the inorganic nitrogen content increased 1.15-1.49 times by adding bacterial strains. The results of this study can be applied to the configuration of organic nitrogen decomposition composite microbial agents.

Keywords： tobacco planting soil; organic nitrogen; ammoniated bacteria; screening; decomposition ability

氮素是對烤煙產(chǎn)量、品質(zhì)影響最關(guān)鍵的營養(yǎng)元素，在烤煙獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的過程中發(fā)揮著重要的作用。目前在烤煙生產(chǎn)中，因過于追求高產(chǎn)而大量施用氮肥，導(dǎo)致烤煙貪青晚熟、煙葉內(nèi)在品質(zhì)不協(xié)調(diào)及氮素大量損失并引發(fā)環(huán)境問題。而烤煙生長獲取的氮素主要以無機(jī)氮形式為主，無法大量吸收大分子的有機(jī)態(tài)氮，而有機(jī)態(tài)氮轉(zhuǎn)化成無機(jī)態(tài)氮的速度較慢，不能很好地滿足烤煙生長前期對無機(jī)氮的需求。因此，如何在降低氮肥使用量的同時，增強(qiáng)土壤有機(jī)氮的分解率，提高植煙土壤中銨態(tài)氮含量，以滿足烤煙對無機(jī)氮“少時富，老來貧”的需求特性，成為目前烤煙施肥中亟待解決的關(guān)鍵問題。

氨化細(xì)菌是能分解有機(jī)氮化物而產(chǎn)生氨的一類微生物，是氨化作用的主要驅(qū)動力，而氨化作用是土壤氮素分解環(huán)節(jié)的起始環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到后續(xù)氮素分解過程。為了滿足烤煙生長前期對無機(jī)態(tài)氮的需求，可以分離篩選分解土壤有機(jī)氮效果較強(qiáng)的微生物菌劑，來調(diào)控土壤中無機(jī)氮的釋放。但近年來，許多學(xué)者的研究主要集中于煙田施入復(fù)合微生物菌肥后對烤煙的生產(chǎn)效應(yīng)、復(fù)合微生物菌劑對堆肥過程中的影響及水體脫氮，結(jié)合當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件篩選出適應(yīng)環(huán)境的不同功能菌株報道較少。本研究從兩個植煙土壤中分離純化篩選出適合當(dāng)?shù)厣车母呋钚园被?xì)菌，采用分子生物學(xué)方法對分離出的菌株進(jìn)行鑒定，同時研究其對有機(jī)氮的分解效果，為應(yīng)用有機(jī)氮分解復(fù)合菌劑提高烤煙品質(zhì)提供優(yōu)良的菌種資源。

1? 材料與方法

1.1? 供試土壤及類型

貴州省湄潭縣抄樂鄉(xiāng)，黃壤;貴州省威寧縣黑石鎮(zhèn)，黃棕壤。其土壤理化性狀見表1。

1.2? 采樣方法

2017年7—8月共采集土壤樣品60個，其中湄潭抄樂30個，威寧黑石30個。于烤煙旺長期采集新鮮土樣，裝于滅過菌的牛皮紙袋中并置于冰桶內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。土樣過2 mm篩，?4 ℃冰箱中保存，供分離氨化細(xì)菌用。

1.3? 培養(yǎng)基的制備

蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基用于氨化細(xì)菌的分離提純，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基用于氨化菌的氨化作用強(qiáng)度測定，LB液體培養(yǎng)基用于活化菌種及富集培養(yǎng)。

1.4? 氨化細(xì)菌的分離提純

稱取10.00 g土樣加入90 mL放有玻璃珠的無菌水中，置于30 ℃搖床上振蕩30 min，充分打散菌體膠團(tuán)。得到的土壤懸浮液采用梯度稀釋法進(jìn)行氨化細(xì)菌的分離，根據(jù)菌落數(shù)量、形態(tài)、顏色、表面狀況及染色特征，選取具有代表性的單個菌落用無菌接種環(huán)挑出，并按照無菌操作要求在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上采用劃線法進(jìn)行培養(yǎng)和純化。

1.5 ?高活性氨化細(xì)菌篩選

純化出的菌株采用納氏法進(jìn)行初步檢測，若出現(xiàn)深黃色或黃色沉淀證明培養(yǎng)液中有氨化細(xì)菌將蛋白質(zhì)分解后產(chǎn)生NH，由此現(xiàn)象初步確定所分離的菌株為氨化細(xì)菌。從中挑選出菌液為深黃色和黃色的菌株作為高活性菌株的待選株。采用滴定法測定其活性大小，進(jìn)行復(fù)篩。

1.6? 菌株16S rDNA鑒定

按照細(xì)菌DNA試劑盒（BIOMIGA）說明書提取出PCR反應(yīng)DNA模板，于?20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。然后采?7 F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'）和1492 R（5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'）通用引物對16s rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段回收后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行DNA片段測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行BLAST比對分析，進(jìn)行種屬鑒定。

1.7? 高活性氨化菌株對有機(jī)氮分解能力測定

將分離鑒定后的各氨化細(xì)菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中活化，于恒溫?fù)u床（130 r/min，28 ℃）

中培養(yǎng)12 h。然后將活化好的各氨化細(xì)菌菌液按1%的量接種于100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，每株菌設(shè)3次重復(fù)。于恒溫?fù)u床（130 r/min，28 ℃） 中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為0、12、24、36、48和72 h，定時取樣，測定各菌株培養(yǎng)液的銨態(tài)氮濃度。銨態(tài)氮濃度測定采用滴定法，試驗(yàn)用水均為無氨水。

1.8? 高活性氨化菌株對有機(jī)肥氮轉(zhuǎn)化能力測定

將篩選出的高活性菌種分別接種至100 mL培養(yǎng)液中進(jìn)行12 h活化培養(yǎng)。然后將活化好的各菌液按1%的量加入有機(jī)肥原料中，充分混合均勻后，噴灑蒸餾水，使有機(jī)肥水分保持在田間持水量的60%。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于0、5、35和65 d取樣，測定銨態(tài)氮（靛酚藍(lán)比色法）和硝態(tài)氮含量（紫外分光光度法）。每盆有機(jī)肥原料質(zhì)量為500 g，每菌種重復(fù)3次，以不添加菌種的有機(jī)肥為對照CK（表2）。

1.9? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，利用DPS V7.05統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2? 結(jié)? 果

2.1? 高活性氨化細(xì)菌菌株的篩選

2.1.1? 菌株的分離初篩 ?從威寧和湄潭植煙土壤中分別分離出27株、25株具有氨化作用的菌株，滴加納氏試劑后菌株均呈現(xiàn)出不同程度的黃色，各種菌株的測試結(jié)果見表3。顏色越深菌株的活性越強(qiáng)，因此，選擇了深黃色、黃色的氨化菌株，即菌株W16、W4、W2、W12、W6、W22、W25、W17、W21、W5、Z9、Z50、Z6、Z15、Z3、Z19、Z48、Z10、Z8、Z13和Z11，并對它們進(jìn)行復(fù)篩。

2.1.2? 菌株的復(fù)篩? 由表4可知，湄潭土壤各氨化細(xì)菌菌液中的NH-N濃度大小為Z9>Z15>Z50> Z6>Z3>Z19>Z48>Z10>Z8>Z13>Z11，威寧土壤各氨化細(xì)菌菌液中的NH-N濃度大小為W2>W16>W4> W6>W12>W22>W25>W17>21>W5。其中，除了湄潭土壤菌株Z15、Z50、Z9和Z10之間呈現(xiàn)顯著性差異和威寧土壤菌株W2、W6和W12之間呈現(xiàn)顯著性差異外，其他菌株則沒有存在差異。因此，各植煙土壤分別選取Z9、Z15、Z50、Z6、Z3、W2、W16、W4、W6和W12作為優(yōu)勢菌株。

2.1.3? 菌株16S rDNA鑒定 ?將篩選出的高活性氨化菌株Z9、Z15、Z50、Z6、Z3、W2、W16、W4、W6和W12做進(jìn)一步的16S rDNA分子系統(tǒng)學(xué)鑒定。以氨化細(xì)菌總基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），約在1500 bp處PCR特征擴(kuò)增條帶明亮、無拖帶，其分子量大小與菌株16S rDNA的理論值相符，表明所提取的氨化細(xì)菌總基因組DNA質(zhì)量好、純度高，可進(jìn)行下一步測序分析。

測序后將菌株的16S rDNA序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對分析。經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)，各菌株的同源性都達(dá)到99%～100%（表5）。一般認(rèn)為，全序列相似性在99%～100%的細(xì)菌，定為同一個種，相似性97%～99%的細(xì)菌定為同一個屬。結(jié)果表明菌株W2是金黃桿菌屬（），W4屬于泛菌屬（），W16為梭形桿菌屬（），Z6為土壤桿菌屬（），Z9和Z50分別屬于短波單胞菌屬（）和節(jié)桿菌屬（P，其余W6、W12、Z3、Z15均為芽孢桿菌屬（），集中在簡單芽孢桿菌屬（）和巨大芽孢桿菌屬（）兩個細(xì)菌類群。

2.2? 高活性氨化菌株對有機(jī)氮分解效果

從圖2可知，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，所篩選菌株均可以將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化成NH-N，且隨著培養(yǎng)時間的延長，NH-N濃度不斷增高，說明細(xì)菌培養(yǎng)液中有機(jī)氮不斷被轉(zhuǎn)化為NH-N。各菌株在24 h前銨態(tài)氮濃度都緩慢增加，表明菌株處于適應(yīng)期。培養(yǎng)24 h后菌株W2、Z9和Z15銨態(tài)氮濃度明顯快速增加，說明菌株在24 h后進(jìn)入對數(shù)生長期。而菌株Z50銨態(tài)氮濃度在培養(yǎng)36 h后趨于穩(wěn)定，菌株W12和W16在培養(yǎng)48 h后就趨于穩(wěn)定，表明菌株Z50比W12和W16進(jìn)入成熟期的時間早，菌量增加幅度變小、活性減弱。培養(yǎng)72 h后菌株W2、W16、W4、W6、W12、Z9、Z15、Z50、Z3和Z6處理中銨態(tài)氮濃度分別336、291.2、284.5、259.8、226、458.1、429、241.4、208.9和208.9 mg/L，有機(jī)氮分解率分別達(dá)到68.5%、59.4%、58.1%、53%、46.1%、93.4%、87.6%、49.3%、42.6%和42.6%，菌株Z9和Z15分解能力與其余菌株差異顯著。表明菌株Z9和Z15氨化活性活力最高。

2.3? 高活性氨化菌株處理下有機(jī)肥中氮形態(tài)轉(zhuǎn)化

有機(jī)肥培養(yǎng)過程中各處理銨態(tài)氮含量均呈下降趨勢（圖3），而各處理硝態(tài)氮含量均呈上升趨勢（圖4）。添加菌株處理的有機(jī)肥無機(jī)態(tài)氮含量隨培養(yǎng)時間的延長呈上升趨勢（圖5），且增加量均高于未施菌肥處理。培養(yǎng)65 d時，與對照（CK）相比，各菌株處理無機(jī)氮含量增加了550.80～1823.71 mg/kg，添施菌株使無機(jī)氮含量提高了1.15～1.49倍，其中效果較為顯著的處理分別為W6、W16、W2和Z3。菌株W6、W4、Z3和Z50處理的無機(jī)氮含量培養(yǎng)

35 d比培養(yǎng)5 d低，表明在微生物的作用下，無機(jī)氮含量由硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)N、NO及氨揮發(fā)的形式損失，導(dǎo)致在培養(yǎng)35 d時無機(jī)氮含量降低。各處理無機(jī)氮含量在培養(yǎng)65 d時明顯增加，且添加氨化菌株有機(jī)肥的無機(jī)氮含量均高于CK，說明此時期有機(jī)肥中的氨化菌株已經(jīng)完全適應(yīng)了環(huán)境，對有機(jī)態(tài)氮分解加快。但是篩選時活性最大的菌株W2、Z9和Z15對有機(jī)肥中有機(jī)氮分解的效果不是最強(qiáng)，表明有機(jī)肥中原有的部分微生物與后來添加的微生物之間相互抑制。

3? 討? 論

研究者通常采用間接測定培養(yǎng)液中銨態(tài)氮濃度來說明氨化菌的氨化能力。本研究利用培養(yǎng)液接種后，菌株W2、Z9和Z15對有機(jī)氮分解效果最顯著，較初始有機(jī)氮含量分別降低了68.5%、93.4%和87.6%。李輝等研究了人工濕地中氨化細(xì)菌去除有機(jī)氮的效果，從中篩選獲得的氨化細(xì)菌-1、氨化細(xì)菌-2與氨化細(xì)菌-5對有機(jī)氮的降解率分別達(dá)到46.2%、49.4%和52.6%。張文藝等從BAF反應(yīng)器中分離出氨化菌T1和Z1，兩株菌株對有機(jī)氮的

轉(zhuǎn)化率分別為86.91%和69.98%，相比之下本研究篩選的菌株有機(jī)氮分解率較高。但由于試驗(yàn)環(huán)境條件和測定方法的差異，需在相同環(huán)境下采用同樣方法進(jìn)一步比較。

有機(jī)肥的微生物有效性低，無機(jī)態(tài)氮素釋放速率慢，難以滿足烤煙生長前期需要。而有機(jī)氮的分解轉(zhuǎn)化，主要由氨化菌、亞硝化菌、反硝化菌、固氮菌起作用，其中氨化菌對有機(jī)氮的分解起決定作用。研究表明添施微生物菌劑后，隨著氨化細(xì)菌數(shù)量的增加，會增強(qiáng)氨化作用的強(qiáng)度，從而促進(jìn)有機(jī)氮的分解。微生物菌劑還顯著影響土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤中有益菌的增殖，促使土壤細(xì)菌組成得到改善。本研究添加的菌劑定殖能力很強(qiáng)，在有機(jī)肥中發(fā)揮了自身的氨化能力，提高了有機(jī)肥中無機(jī)氮的釋放速率，這有利于烤煙生長前期土壤無機(jī)態(tài)氮的增加，可解決配施有機(jī)肥后氮素分解速率慢，難以供給烤煙生長需要的問題。有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮的過程中，由于存在硝化細(xì)菌，促使有機(jī)肥中銨態(tài)氮大量轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，因此添施菌劑對有機(jī)肥中有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮的貢獻(xiàn)率仍需進(jìn)一步的深入探討。

芽孢桿菌種群龐大，繁殖能力強(qiáng)，耐熱、耐酸堿、理化性質(zhì)穩(wěn)定，抑菌譜廣泛，為目前主要的生防菌株;泛菌屬（）不僅具有耐鹽能力，還具有固氮的作用;土壤桿菌屬（）除了具有固氮、土壤重金屬修復(fù)等作用，也應(yīng)用于海洋方面;短波單胞菌屬（）、節(jié)桿菌屬（）、梭形桿菌屬（）等均對有機(jī)物及重金屬具有降解作用。故本試驗(yàn)中所篩選獲得的菌株均為有益細(xì)菌，不會引起煙株及土壤病蟲害。

4? 結(jié)? 論

從貴州省威寧縣和湄潭縣植煙土壤中篩選獲得活性較強(qiáng)的氨化菌株W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9和Z50，通過16S rDNA鑒定及BLAST同源性分析，確定菌株W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9和Z50分別屬于金黃桿菌屬（）、泛菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、簡單芽孢桿菌屬（）、梭形桿菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、土壤桿菌屬（）、巨大芽孢桿菌屬（）、短波單胞菌屬（）和節(jié)桿菌屬（）。這10株菌株均具有較強(qiáng)的氨化能力，可促進(jìn)有機(jī)肥中有機(jī)氮的分解，加速無機(jī)氮素的釋放，對于烤煙生產(chǎn)具有良好的應(yīng)用價值。篩選出的菌株可進(jìn)一步為氮轉(zhuǎn)化復(fù)合微生物菌劑的配置提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源，但有待通過生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)一步鑒定其實(shí)際使用效果。

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