香子含笑葉揮發(fā)油GC-MS分析及抗菌性研究

閆浩　徐雪峰　杜金風(fēng)

摘要：為研究海南木蘭科植物香子含笑的成分及抗菌性，進(jìn)而為開發(fā)植物源防腐劑提供理論依據(jù)，以生長于海南霸王領(lǐng)區(qū)域的香子含笑新鮮葉片為原料，經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)性物質(zhì)。分離純化后，采用GC-MS技術(shù)進(jìn)行化學(xué)成分分析，共鑒定出34種化合物，占總含量的88.01%。其中大多為倍半萜類，此外還包括部分單萜類及酸酯類萜的含氧衍生物。鑒定出含量最多的成分為石竹烯（11.442%）、去氫白菖烯（11.319%）、3-蒈烯（9.412%）、香木蘭烯（8.981%）、氧化石竹烯（7.721%）。通過濾紙片擴(kuò)散法驗(yàn)證香子含笑葉提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌生長有不同程度的抑制效果，其MIC分別為0.313、0.625、0.625g/mL。該研究結(jié)果是對國家林木種質(zhì)資源平臺中關(guān)于香子含笑成分、功能的補(bǔ)充，也為以該植物葉為原料開發(fā)醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域新產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：香子含笑;抗菌性;GC-MS

中圖分類號：R9 ???文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ???論文編號：cjas18030024

GC-MS Analysis and Antimicrobial Study of Volatile Oil from Michelia hedyosperma Leaves

Yan Hao， Xu Xuefeng， Du Jinfeng

（Hainan Institute of Science and Technology， Haikou 571126， Hainan， China）

Abstract： To study the composition and antibacterial activity of Magnoliaceae plants， volatile oil was extracted?by the steam distillation method from fresh leaves of Michelia hedyosperma grown in the Bawangling area of?Hainan. After separation and purification， the chemical composition was analyzed by GC-MS and a total of 34 compounds were identified， accounting for 88.01% of the total composition. In addition to oxygen derivatives of monoterpenes and terpenes， most compounds belonged to sesquiterpenes. The components with higher abundance were Caryophyllene （11.442%）， Spathulenol （11.319%）， Carene （9.412%）， Aromadendrene?（8.981%）， Caryophyllene oxide （7.721%）. In this study， the inhibitory effect of extracts from the leaves of M. hedyosperma on the growth of Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Salmonella was studied using a filter?paper diffusion method. The MIC for the above bacteria was 0.313， 0.625， and 0.625 g/mL， respectively. M. hedyosperma is a unique and endangered plant resource in Hainan. Under the background of building Hainan into an ecologically livable international tourism island， this study provides a valuable basis for conservation?breeding and proliferation of M. hedyosperma. In addition， this study adds important information in the National?Forest Germplasm Resource Platform regarding the composition and functions of the plant， and provides references for the development of new products in the fields of medicines， chemicals and foods by using the?leaves of M. hedyosperma.

Keywords： Michelia hedyosperma; Antibacterial Activity; GC-MS

0 ?引言

香子含笑，溯危種[1]，又名黑枝苦梓，國家二級保護(hù)植物，在中國海南[2]、廣西和云南等地均有分布。該植物樹干通體挺拔，材質(zhì)堅(jiān)硬，耐腐蝕，過去常用于建筑、家具及工藝品制作等。據(jù)《本草綱目》記載，該植物種子可入藥，具有清熱、解毒、利尿之功效。此外該植物種子還可用于制作調(diào)味料、香薰料、保健品等，因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，曾被破壞性采伐，導(dǎo)致植株數(shù)量急劇減少，該植物自然更新能力十分有限，已成為瀕危物種。近年來隨著國內(nèi)環(huán)保政策的實(shí)施和居民意識的提高，香子含笑的保護(hù)性利用再一次成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[1-8]。香子含笑中含有的多酚及黃酮具有抗氧化能力，有一定延緩衰老的作用，己被開發(fā)成多種保健品。筆者前期在該植物葉片中檢測到經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的小白菊內(nèi)酯成分[9]，該成分最早發(fā)現(xiàn)于菊科植物，后在木蘭科植物中也發(fā)現(xiàn)了該成分，具有良好的抗腫瘤、抗病毒、抗炎及抑制白細(xì)胞增長等功能[10]，國內(nèi)外研究十分活躍。文獻(xiàn)表明，小白菊內(nèi)酯對人體肺癌、腸腺癌及神經(jīng)管細(xì)胞癌等3種腫瘤細(xì)胞離體情況下的半數(shù)致死濃度（LG50）分別為413、615、710μmol/L[11]。Parada等[12]的研究表明，小白菊內(nèi)酯具有抑制關(guān)節(jié)滑膜纖維母細(xì)胞增長的功能。Feltenstein等[13]研究發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯可以抑制炎性大鼠關(guān)節(jié)水腫。但目前關(guān)于香子含笑葉揮發(fā)油的提取、分離及成分分析尚未見報(bào)道，本研究旨在為海南木蘭科植物的開發(fā)與保護(hù)性利用提供一定參考。

1 ?材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

筆者以自然生長于海南霸王領(lǐng)區(qū)域的香子含笑為

研究對象，原料經(jīng)保護(hù)區(qū)陳慶老師及海南科技職業(yè)學(xué)院張緒源博士鑒定為香子含笑，現(xiàn)由中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所選育保存。研究田間試驗(yàn)于2017年在海南霸王領(lǐng)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)近年自然氣候穩(wěn)定，室內(nèi)試驗(yàn)于海南南科技職業(yè)學(xué)院海南省藥食同源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)平均溫度26℃，氣壓101kPa，相對濕度穩(wěn)定在55%～60%，檢測于海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要儀器、材料和試劑

Agilent 7890A/5975C-GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀，IKA10000512控制型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，昆山舒美KQ-300DE臺式數(shù)控超聲波清洗器，上海躍進(jìn)LRHS-300III恒溫恒濕培養(yǎng)箱。大腸桿菌菌種（ATCC25922），金黃色葡萄球菌（ATCC6538），沙門氏菌（ATCC14028），其他試劑均為分析純（AR級）試劑。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品揮發(fā)性物質(zhì)及抑菌成分提取 采適量新鮮葉，粉碎后，用水蒸氣蒸餾法提取樣品中的揮發(fā)性非水溶物，回流液再以乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥除去水分，減壓蒸餾回收乙酸乙酯，最后得到淡黃色油狀物[14]。另將葉片通風(fēng)干燥粉碎至80目制成粗粉，稱取該粗粉10.0g，按照1：3的料液比，以質(zhì)量濃度為80%的乙醇45℃下超聲波提取3次，每次30min，合并濾液，減壓蒸餾除去乙醇，以蒸餾水將提取液定容至20mL，配制成含量為0.5g/mL（每毫升供試樣含0.5g原料的提取物）的供試樣備用[15]。

1.3.2 ?GC-MS聯(lián)用分析揮發(fā)油中主要成分 對提取的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，頂空進(jìn)樣溫度為100℃，定量環(huán)（1.0mL）溫度110℃，傳輸線溫度120℃，氣相平衡時(shí)間5.5min，樣品平衡時(shí)間7.0min，樣品瓶加壓時(shí)間0.1min，定量環(huán)增量時(shí)間0.5min，樣品環(huán)平衡時(shí)間0.05min，進(jìn)樣時(shí)間1.0min[16]。

GC條件：石英毛細(xì)管柱程序升溫，初溫40℃，保持1min后以5℃/min升溫速率，升溫到200℃保持5min，再以8℃/min升溫速率，升溫到280℃，然后保持至完成分析，載氣為高純度氦氣，柱流量1.0mL/min，壓力28.8kPa，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比50：1[17]。

MS條件：EI電子源，能量70eV，接口溫度及離子源溫度分別為280、230℃，四級桿溫度180℃，溶劑延遲2.5min，全掃描采集模式，荷質(zhì)比范圍（m/z）為50～550，掃描間隔0.50s，倍增器電壓1200V。

1.3.3 抑菌效果研究 以濾紙擴(kuò)散法測定香子含笑葉片提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門氏菌的抑菌效果，并配制含有不同濃度提取物的系列培養(yǎng)基確定最小抑菌濃度MIC。

按照牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、瓊脂20.0g、水1000mL的比例制作供大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門氏菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。無菌條件下，取適量以上培養(yǎng)基裝入試管擺成斜面劃線法接入供試菌種后37℃下培養(yǎng)24h活化，以比濁法用滅菌生理鹽水配制成106～107cfu/mL的菌懸液[18]。

將直徑約5mm的濾紙片浸于供試液中10min，取滅菌培養(yǎng)基3支微熱溶化，分別吸入0.1mL菌懸液，涂布均勻后37℃恒溫箱中使其固化，以浸有無菌水的濾紙片對焦設(shè)置對照，37℃培養(yǎng)24h后，分析供試樣的抑菌效果。

吸取不同體積的供試液配制成濃度為2.500、1.250、0.625、0.313、0.156g/mL的系列培養(yǎng)基，以不加供試液的培養(yǎng)基為對照，固化后每皿吸入0.1mL菌懸液涂布均勻，37℃下培養(yǎng)24h。分析培養(yǎng)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)最低抑菌濃度。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 GC-MS譜圖

香子含笑葉揮發(fā)油經(jīng)檢測后得到GC-MS總離子流（TIC）如圖1。

2.2 化學(xué)組成及分析結(jié)果

用面積歸一化法對樣品中揮發(fā)成分的相對含量進(jìn)行分析，分析結(jié)果按各峰的質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并將各峰的質(zhì)譜裂片圖與文獻(xiàn)資料比對，檢測出該揮發(fā)油中共有94種化合物，進(jìn)一步與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對相似度90%以上的化合物有34種，結(jié)果見表1。

2.3 抑菌性或抗菌性分析及MIC測定

香子含笑提取物的抑菌作用見表2。從結(jié)果分析，提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的生長均有不同程度的抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制效果最好，最大抑菌圈直徑9.5mm，平均抑菌圈直徑為9.2mm;其次是對沙門氏菌的抑制效果，最大抑菌圈直徑為9.0mm，平均抑菌圈直徑為8.5mm;對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為7.8mm，平均抑菌圈直徑為7.5mm。

香子含笑提取物對3種供試菌的最低抑菌濃結(jié)果見表3。為清晰地表示香子含笑抑菌效果，本研究濃度為質(zhì)量濃度（每毫升供試液中含有原料的質(zhì)量）。結(jié)果表明，當(dāng)供試樣濃度為0.313g/mL時(shí)對大腸桿菌的生長產(chǎn)生良好的抑制作用，對金黃色葡萄球菌及沙門氏菌產(chǎn)生抑制效濃度則需達(dá)到0.625g/mL左右。

3 ?結(jié)論

經(jīng)檢測生長于海南霸王領(lǐng)地區(qū)的香子含笑揮發(fā)油中共有94種化合物，其中已鑒定出31種，占總成分的88.01%，主要成分為石竹烯（11.442%）[20]、去氫白菖烯（11.319%）、3-蒈烯（9.412%）、香木蘭烯（8.981%）、氧化石竹烯（7.721%）。文獻(xiàn)表明石竹烯及其氧化物可用于調(diào)配食用香精（如丁香、胡椒、柑橘等），建議用量在加香食品中濃度約為2～200mg/kg，也可用于合成乙?；裣┑冉?jīng)濟(jì)價(jià)值更高香料[21]。蒎烯常用做抗氧化劑，是一個重要工業(yè)原料。蒎烯可用于矯正一些工業(yè)產(chǎn)品的香味，并可做涂料溶劑、殺蟲劑和增塑劑等[22-24]。

自然界中許多植物具有抗菌、抑菌作用，近年來國內(nèi)外對植物源及藥食同源防腐劑的研究十分活躍。文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)表明國內(nèi)已有150余種植物天然成分應(yīng)用于食品防腐領(lǐng)域，除按照文中所述方法進(jìn)行抗菌性測試外，作者還以大孔吸附樹脂粗分了該植物葉片中的多酚、黃酮，并以煮熟后的豬肉、西蘭花、豆腐等食物測試了其實(shí)際抗菌能力，結(jié)果表明于自然條件下該植物提取物具有明顯的抑菌抗菌效果。

4 ?討論

揮發(fā)油GC-MS分析難點(diǎn)在于分析條件的選擇，也就是GC-MS離子流圖中各揮發(fā)油成分的分離效果，本方法以乙酸乙酯為溶劑，在測試時(shí)間內(nèi)無基線漂移現(xiàn)象，香子含笑葉揮發(fā)油成分離效果好，樣品中化合物于4～45min內(nèi)基本分離，分布時(shí)間范圍寬，準(zhǔn)確度高。香子含笑葉片的揮發(fā)油中分離出的大部分成分均可用于制作生產(chǎn)香料。此外在該植物中還首次發(fā)現(xiàn)了β-欖香烯（含量為4.181%）這一活性成分，該成分是最早從姜科植物溫郁金中提取的抗癌活性成分，以該成分為主要活性物質(zhì)生產(chǎn)的欖香烯乳注射液（Elemene Injection）可用于治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、骨轉(zhuǎn)移癌、腦瘤等惡等多種惡性腫瘤[27]，本研究首次證實(shí)了在木蘭科含笑屬植物中也存在這一重要的醫(yī)學(xué)原料，是作者于本科植物中發(fā)現(xiàn)的繼小白菊內(nèi)酯后又一己被應(yīng)用的天然抗癌成分，是對該植物藥理工功能的重要彌補(bǔ)。

本研究選用香子含笑葉提取物驗(yàn)證其對食品中常見菌的抑制作用，闡述其抑菌活性[25]，加之前期針對該植物含笑總酚、總黃酮及總酯的研究，為海南植物資源的重要價(jià)值又增加了有力依據(jù)。因本研究針僅針對葉片，屬于可再生資源，故為海南省植物資源的保護(hù)性開發(fā)與利用同樣提供了一定的理論支撐。

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