澤瀉湯加味方對(duì)鹽敏感性HBZY21細(xì)胞中 AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的影響

崔海鵬 劉玉玲 劉凱 孫曉旭 王途 趙娟 張樹(shù)峰

〔摘要〕 目的 探討澤瀉湯加味方對(duì)鹽敏感性腎小球系膜細(xì)胞中AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的作用機(jī)制。方法 采用高鹽和AngII誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的方法建立鹽敏感性高血壓體外細(xì)胞模型，設(shè)正常組、模型組、陽(yáng)性藥纈沙坦組、澤瀉湯加味方（高、中、低劑量）組。CKK-8法測(cè)定細(xì)胞活性;RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達(dá)水平;Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中AT1R、P22、P47、NOX4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組細(xì)胞中Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達(dá)水平、AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達(dá)水平以及ROS表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及澤瀉湯加味方中劑量組Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達(dá)水平、AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達(dá)水平以及ROS表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。不同濃度澤瀉湯加味方組間，中劑量組對(duì)AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的下調(diào)作用最為明顯。結(jié)論 澤瀉湯加味方對(duì)鹽敏感性高血壓腎損害的保護(hù)作用可能與抑制AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 鹽敏感性高血壓;腎損傷;澤瀉湯;血管緊張素II;AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.010

Impact of Modified Zexie Decoction on the AngII-NADPH-ROS Signaling

Pathway in Salt-Sensitive HBZY21 cells

CUI Haipeng， LIU Yuling， LIU Kai， SUN Xiaoxu， WANG Tu， ZHAO Juan， ZHANG Shufeng*

（Chengde Medical College， Chengde， Hebei 067000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of modified Zexie Decoction on the angiotensin II （AngII）-NADPH-reactive oxygen species （ROS） signaling pathway in salt-sensitive glomerular mesangial cells. Methods An in vitro cell model of salt-sensitive hypertension was established by inducing rat glomerular mesangial cells with high salt and AngII. Cells were divided into normal group， model group， positive valsartan group， and high-， medium-， and low-dose modified Zexie Decoction groups. CKK-8 assay was used to determine the cell viability. RT-PCR was used to determine the mRNA expression levels of Agtr1a， Cyba， and NOX4. Western blot was used to determine the protein expression levels of AT1R， P22， P47， and NOX4 in cells. The ROS levels in cells were measured by a ROS assay kit. Results Compared with the normal group， the model group had significantly higher mRNA levels of Agtr1a， Cyba， NOX4， protein levels of AT1R， P22， P47， and NOX4， and ROS levels （P<0.05）. Compared with the model group， the valsartan group and the medium-dose modified Zexie Decoction group had significantly lower mRNA levels of Agtr1a， Cyba， and NOX4， protein levels of AT1R， P22， P47， and NOX4， and ROS levels （P<0.05）. Among the three modified Zexie Decoction groups， the medium-dose group had the greatest downregulation of the AngII-NADPH-ROS signaling pathway. Conclusion The protective effect of modified Zexie Decoction against renal injury induced by salt-sensitive hypertension might relate to the inhibition of the AngII-NADPH-ROS signaling pathway.

〔Keywords〕 salt-sensitive hypertension; renal injury; Zexie Decoction; angiotension II; AngII-NADPH-ROS signaling pathway

鹽敏感性高血壓作為最常見(jiàn)的繼發(fā)性高血壓，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin angiotensin aldosterone system， RAAS）相關(guān)的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路）異常被認(rèn)為是鹽敏感性高血壓發(fā)生的重要機(jī)制之一[2-4]。越來(lái)越多的研究表明，中醫(yī)藥治療鹽敏感性高血壓，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5-6]，前期研究證實(shí)，澤瀉湯加味方在臨床治療鹽敏感性高血壓效果明顯[7]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，澤瀉湯加味方對(duì)高鹽高血壓大鼠腎臟有明顯的保護(hù)作用[8-9]。然而缺少運(yùn)用科學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)澤瀉湯加味方治療鹽敏感性高血壓作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。本文以鹽敏感性高血壓細(xì)胞模型作為研究對(duì)象，初步研究了澤瀉湯加味方對(duì)RAAS相關(guān)信號(hào)通路AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的影響，為進(jìn)一步將澤瀉湯加味方研發(fā)成高效、安全的治療鹽敏感性高血壓的新型降壓藥物提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1? 藥物

澤瀉湯加味方：澤瀉（批號(hào)0171422112）、白術(shù)（批號(hào)160180101）、澤蘭（批號(hào)512150401）、石菖蒲（批號(hào)170630），由承德醫(yī)藥集團(tuán)責(zé)任有限公司提供;纈沙坦膠囊（批號(hào)X0796）購(gòu)于北京諾華制藥有限公司。

1.2? 細(xì)胞株

大鼠腎小球系膜細(xì)胞株：HBZY21（武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）。

1.3? 主要試劑

DMEM-H（美國(guó)Hyclone公司）;胎牛血清（美國(guó)Sigma公司）;Trizol裂解液、RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）;TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix SYBR Green熒光定量檢測(cè)試劑盒（天根生化科技有限公司）;兔抗大鼠AT1R、P22、NOX4（Abcam公司）;P47（Santa公司）;兔抗大鼠β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（Bioworlde公司）。PCR引物（大連寶生物工程有限公司合成），引物序列見(jiàn)表1。

1.4? 主要儀器

T100 RT-qPCR儀、Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、多功能熒光酶標(biāo)儀均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1? 藥物制備

澤瀉湯加味方：澤瀉21 g，白術(shù)9 g，澤蘭15 g，石菖蒲15 g按比例配備，加8倍體積超純水浸泡4 h，煎煮1 h，過(guò)濾取濾液，藥渣中再加6倍體積超純水，煎煮1 h，過(guò)濾取濾液，將2次濾液合并，濃縮制成60 g/L水煎劑，保存于-20 ℃冰箱中備用。

2.2? 鹽敏感性高血壓細(xì)胞模型建立

復(fù)蘇HBZY21細(xì)胞，用加有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM-H培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)皿80%開(kāi)始傳代，取第5～9代細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，采用NaCl 137 mmol/L和AngII10-6 mmol/L刺激HBZY21細(xì)胞24 h，設(shè)模型組、纈沙坦（1 μmol/L）組、澤瀉湯加味方高（2 mg/L）、中（1 mg/L）、低（0.5 mg/L）劑量組，分別干預(yù)處理24 h，另設(shè)正常腎小球細(xì)胞作為對(duì)照。收集細(xì)胞，分別提取總RNA及蛋白質(zhì)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3? 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8法，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL密度接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加入含NaCl 137 mmol/L和AngII 10-6 mmol/L培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，分為空白（無(wú)細(xì)胞）對(duì)照組，模型組，不同濃度的澤瀉湯加味方組：0.2、0.5、1、2、3、5 mg/L，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的5 g/L的CKK-8液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～2 h，于酶標(biāo)儀460 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

細(xì)胞活力=（澤瀉湯加味方組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（模型組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。

2.4? RT-qPCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá)

根據(jù)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)設(shè)定澤瀉湯加味方高（2 mg/L）、中（1 mg/L）、低（0.5 mg/L）劑量組，另設(shè)模型組、纈沙坦（1 μmol/L）組，各組均采用NaCl 137 mmol/L和AngII 10-6 mol/L刺激HBZY21細(xì)胞24 h，再分別給藥處理24 h。收集正常組和各處理組細(xì)胞，分別提取總RNA及蛋白質(zhì)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，SuperReal PreMix SYBR Green熒光定量檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)Agtr1a、Cyba、NOX4、β-actin mRNA的ct值，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán);做溶解曲線。以各目的基因ct值與β-actin mRNA的ct值的差值為△ct，采用2-△△ct法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5? Western blot法檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)

RIPA裂解液處理提取各組細(xì)胞的總蛋白，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。45 μg蛋白于SDS-PAGE 12%分離膠分離并轉(zhuǎn)膜，常溫封閉1 h， AT1R（1∶800）、P47（1∶100）、P22（1∶500）、P47（1∶100）、NOX4（1∶2 000）、β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗（1∶5 000），常溫孵育l h，洗膜后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。各蛋白目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為各蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

2.6? 活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS的表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL密度接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加入含NaCl 137 mmol/L和AngII 10-6 mmol/L培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，設(shè)模型組、纈沙坦（1 μmol/L）組、澤瀉湯加味方中藥高（2 mg/L）、中（1 mg/L）、低（0.5 mg/L）劑量組，分別干預(yù)處理24 h，另設(shè)分為空白（無(wú)細(xì)胞）對(duì)照組，正常腎小球細(xì)胞作為對(duì)照。去除培養(yǎng)液，每孔加入熒光探針DCFH-DA10 μmol/L，37 ℃孵育20 min，用無(wú)血清的無(wú)酚紅培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，加入無(wú)酚紅培養(yǎng)基后于熒光酶標(biāo)儀下檢測(cè)各孔OD值，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。以正常組OD值與空白對(duì)照組OD值之間的差值的平均值并歸一后作為正常組ROS表達(dá)水平，其他各組

ROS相對(duì)表達(dá)水平=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（正常組OD值-空白對(duì)照組OD值）。

2.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以“x±s”表示，各組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1? 澤瀉湯加味方對(duì)鹽敏感性高血壓細(xì)胞活力的影響

與模型組相比，0.2 mg/L澤瀉湯加味方顯著提高了細(xì)胞活力（P<0.05）;而0.5、1、2 mg/L澤瀉湯加味方不同程度地降低了細(xì)胞存活率（P<0.05），1 mg/L澤瀉湯加味方抑制細(xì)胞增殖作用最明顯;此外，3、5 mg/L澤瀉湯加味方對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響。見(jiàn)表2。

3.2? 澤瀉湯加味方對(duì)各組細(xì)胞Agtr1a、Cyba、NOX4

mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、澤瀉湯加味方高劑量組細(xì)胞中Agtr1a的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），模型組細(xì)胞中Cyba的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），模型組、澤瀉湯加味方低劑量組細(xì)胞中NOX4的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及澤瀉湯加味方高、中、低劑量組Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。各劑量澤瀉湯加味方組中，澤瀉湯加味方中劑量組Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達(dá)水平最接近正常組水平，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1。

3.3? 澤瀉湯加味方對(duì)各組細(xì)胞AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），澤瀉湯加味方高、低劑量組細(xì)胞中AT1R、P47、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），澤瀉湯加味方低劑量組細(xì)胞中P22蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及澤瀉湯加味方中劑量組AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），澤瀉湯加味方高劑量組細(xì)胞中AT1R、P22、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），澤瀉湯加味方低劑量組細(xì)胞中AT1R蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。各劑量澤瀉湯加味方組間，澤瀉湯加味方中劑量組對(duì)AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路相關(guān)蛋白的下調(diào)作用最為明顯。見(jiàn)圖2。

3.4? 澤瀉湯加味方對(duì)各組細(xì)胞中ROS表達(dá)的影響

ROS檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、澤瀉湯加味方高劑量組、低劑量組細(xì)胞中ROS的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及各澤瀉湯加味方給藥組細(xì)胞中ROS的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），其中澤瀉湯加味方中劑量組ROS的相對(duì)表達(dá)水平接近正常組水平，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

4 討論

中國(guó)60%的高血壓患者屬于“鹽敏感性高血壓”，即機(jī)體攝入高鹽大大超過(guò)腎臟的排鹽能力范圍繼而血壓隨之升高，是造成我國(guó)鹽敏感性高血壓發(fā)病率明顯增高的重要原因[1]，韓運(yùn)峰等[10]發(fā)現(xiàn)在感覺(jué)神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠中，RAAS不完全受抑制，提示該模型的形成與RAAS中AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路異常激活有關(guān)。

血管緊張素II（angiotensionII，AngII）是RAAS中最重要的效應(yīng)因子。正常情況下，AngII通過(guò)與其受體AT1R結(jié)合，使交感神經(jīng)末梢釋放遞質(zhì)增多來(lái)維持體液穩(wěn)態(tài)，起到正常調(diào)節(jié)血壓作用。然而在各種致病因素的損害下，使這種體液穩(wěn)態(tài)被破壞，則可導(dǎo)致鹽敏感性高血壓的發(fā)生[11-12]。故本研究采用高鹽和AngII作為致病因素來(lái)破壞HBZY21大鼠腎小球系膜細(xì)胞的體外生存穩(wěn)態(tài)，在體外水平模擬鹽敏感性高血壓模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞中Agtr1a的mRNA以及其翻譯的AT1R蛋白表達(dá)水平較正常組顯著升高，表明高鹽和AngII的共同刺激可促進(jìn)AT1R的表達(dá)，AngII進(jìn)入細(xì)胞與其受體AT1R的結(jié)合在細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase， NADPH）氧化酶是一個(gè)由NADPH氧化酶NOX4、催化亞基p22和調(diào)節(jié)亞基p47等組成的多亞基復(fù)合體，在細(xì)胞內(nèi)，AngII可與AT1R結(jié)合促進(jìn)NADPH釋放電子到細(xì)胞膜外與氧分子結(jié)合生成活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species， ROS）[13]。在病理狀態(tài)下，ROS的過(guò)表達(dá)可引起鹽敏感性高血壓患者氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的增殖，腎小管血管內(nèi)皮功能障礙或損傷，血管壁中膜肥厚，纖維化及炎癥反應(yīng)，加劇腎損害[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽敏感性高血壓細(xì)胞內(nèi)NOX4的mRNA表達(dá)水平以及P47、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的活化在鹽敏感性高血壓細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

纈沙坦可阻斷AngII與其受體AT1R結(jié)合，抑制AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的活化[16]，最終達(dá)到治療鹽敏感性高血壓的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明纈沙坦可顯著抑制鹽敏感性高血壓細(xì)胞中AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的活性。但長(zhǎng)期服用纈沙坦等藥物，患者會(huì)出現(xiàn)頭痛、頭暈、病毒感染、上呼吸道感染、咳嗽、腹瀉、疲勞、鼻炎、背痛、惡心、咽炎及關(guān)節(jié)痛等副作用，對(duì)患者機(jī)體造成新的損害[17]。中藥則具有藥性溫和、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)。本研究采用的中藥澤瀉湯加味方在臨床治療鹽敏感性高血壓效果明顯[7]，然而其具體治療作用的分子機(jī)制研究較少。

澤瀉湯加味方是在漢·張仲景《金匱要略》澤瀉湯（澤瀉、白術(shù)）的基礎(chǔ)上，結(jié)合高血壓病程中普遍存在的水濁內(nèi)結(jié)、痰濕阻滯、瘀血阻絡(luò)的研究成果，加用活血、祛痰、開(kāi)竅的澤蘭、石菖蒲組成。有研究表明，澤瀉湯加味方可下調(diào)高鹽高血壓腎損害大鼠腎皮質(zhì)中AT1R、AT2R的mRNA表達(dá)水平[18]。本研究中發(fā)現(xiàn)，采用0.5、1、2 mg/L的澤瀉湯加味方可顯著抑制鹽敏感性高血壓細(xì)胞的活性力。同時(shí)，進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，澤瀉湯加味方中劑量組（1 mg/L）較模型組細(xì)胞中Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA及AT1R、P21、P47、NOX4的蛋白表達(dá)水平顯著降低，其細(xì)胞內(nèi)的ROS的活性顯著降低。由此表明澤瀉湯加味方中劑量組對(duì)AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的下調(diào)作用最為明顯。

綜上所述，澤瀉湯加味方可下調(diào)鹽敏感性高血壓細(xì)胞中AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路的活化水平。我們推斷其作用機(jī)制，可能是通過(guò)占據(jù)纈沙坦AT1R結(jié)合部位，阻斷AngII與其受體結(jié)合，抑制AngII-NADPH-ROS信號(hào)通路有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)，進(jìn)而起到治療高血壓的作用。而其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)高血壓防治指南修訂委員會(huì).中國(guó)高血壓防治指南2010[J].中華高血壓雜志，2011，19（8）：707-743.

[2] 王? 麗，盧成志，張? 欣，等.經(jīng)皮腎臟交感神經(jīng)射頻消融術(shù)對(duì)頑固性高血壓患者腎素血管緊張系統(tǒng)的影響[J].中華心血管病雜志， 2013，41（1）：3-7.

[3] VON LUEDER T G， KRUM H. RAAS inhibitors and cardiovascular protection in large scale trials[J]. Cardiovasc Drugs Ther， 2013， 27（2）：171-179.

[4] PRAJAPATI H， MCCALLUM A， FINLAY E. Hypertension， secondary to a renal artery aneurysm， treated by ex vivo aneurysm repair and autotrans plantation[J]. BMJ Case Reports， 2012，19（6）：1725-1726.

[5] 曾? 勇，張? 穩(wěn)，葉舒婷，等.中西藥物對(duì)高血壓病炎癥反應(yīng)干預(yù)作用的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014;12（1）：85-87.

[6] 王? 超，孫? 磊，王振滔，等.聯(lián)合中藥對(duì)高血壓治療的研究進(jìn)展[J]. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，39（4）：290-292.

[7] 范洪亮，張樹(shù)峰，張連和，等.澤瀉湯加味方治療高血壓80例降壓效果臨床觀察[J].中國(guó)心臟與心律電子雜志，2016，4（1）：3-6.

[8] 張婷婷，蔣希成，吳鑫宇，等.澤瀉湯加味方對(duì)高鹽條件下Dahl大鼠高血壓調(diào)節(jié)及腎功能的保護(hù)作用[J].中醫(yī)藥信息，2017，34（3）：44-46.

[9] 何紅梅，梅愛(ài)敏，田河林，等.澤瀉湯加味方對(duì)高鹽誘導(dǎo)大鼠高血壓腎功能損害的保護(hù)作用[J].山東醫(yī)藥，2017，57（17）：31-33.

[10] 韓運(yùn)峰，蘇誠(chéng)堅(jiān)，區(qū)碧如.非洛地平緩釋片及纈沙坦對(duì)感覺(jué)神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠的降壓作用及其機(jī)制探討[J].中華心血管病雜志，2005，33（3）：255-259.

[11] WOLAK T， ALIEV E， ROGACHEV B， et al. Renal safety and angiogenesis II blockade medications in patients undergoing non-emergent coronary angiography： a randomized controlled study[J]. Israel Medical Association Journal， 2013，5（11）： 682-687.

[12] TUCKER S， CHEN Y， ABELL R. In patients with chronic

diabetic nephropathy， do angiotensin converting enzyme inhibitors （ACEI） have greater renal protective effect as compared to angiotensin receptor blockers （ARB）[J]. J Okla State Med Assoc， 2013，106（7）： 294-295.

[13] KUSHIRO T， FUJITA H， HISAKI R， et al. Oxidative stress in the Dahl salt-sensitive hypertensive rat[J]. Clinical and Experimental Hypertension， 2005，27（1）：9-15.

[14] LIU L， WU X， XU H， et al. Myocardin-related transcription factor A （MRTF-A） contributes to acute kidney injury by regulating

macrophage ROS production[J]. Biochim et Biophysica Acta （BBA）-Molecular Basis of Disease， 2018， 1864（10）：3109-3121.

[15] 簡(jiǎn)怡娟，程錦國(guó)，董飛俠.NOX通過(guò)ROS介導(dǎo)促腎纖維化作用[J]. 中國(guó)醫(yī)師雜志，2015，17（7）：1108-1110.

[16] ARDIANA F， SUCIATI， INDRAYANTO G. Valsartan[J]. Profiles of Drug Substances， Excipients and Related Methodology， 2015，40：431-493.

[17] 馮? 柏，王? 屏，寧? 彰.纈沙坦致不良反應(yīng)74例文獻(xiàn)分析[J].中國(guó)新藥雜志，2010，19（12）：1094-1096.

[18] 陳景彥，陳炳宏，范洪亮，等.澤瀉湯加味方對(duì)高鹽高血壓腎損害大鼠AT1R、AT2R mRNA表達(dá)的影響[J].中醫(yī)雜志，2016，57（5）：428-430.