佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑中兩種成分的測定方法研究

孫福仁 高晗 李雪利 張肖建 李軍山 李振江

摘要：為提高佛手配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，利用佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑控制佛手配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。以15批不同產(chǎn)地的佛手飲片為原料，制備佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立含量測定方法，以柚皮苷、橙皮苷為指標(biāo)成分，測定了15批佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相關(guān)含量。結(jié)果表明：柚皮苷、橙皮苷分別在0.0251～0.1255，0.1605～0.8023μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均加樣回收率分別為102.27%和101.48%，重復(fù)性考察RSD值分別為0.78%和0.89%，12h穩(wěn)定性考察RSD值分別為0.59%和1.46%。所提出的方法能同時(shí)測定柚皮苷和橙波苷兩種成分，節(jié)約了分析時(shí)間，提高了佛手產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑;橙皮苷;柚皮苷;含量測定

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.7535/hbgykj.2019yx03012

文章編號(hào)：1008-1534（2019）03-0221-06

佛手系蕓香科植物佛手的干燥果實(shí)，具有梳理肝氣、止痛、和胃的功效[1]，為常用理氣中藥。成熟佛手果實(shí)中含有檸檬油素、5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、7-羥基-6-甲氧基香豆素、4-甲氧基聯(lián)卞、檸檬內(nèi)酯、Δ5，22-豆甾烯醇、棕櫚酸等成分[2-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：佛手具有降低脂質(zhì)代謝、降低總膽固醇、促進(jìn)糖脂代謝等生物活性[4-6];佛手醇提液具有顯著鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰作用，可提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力[7]。

關(guān)于佛手中相關(guān)含量的測定研究，文獻(xiàn)[8]和文獻(xiàn)[9]介紹了采用RP-HPLC法測定佛手中的橙皮苷含量;金曉玲等[10]測定出佛手飲片中的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.37%，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.334%;曹斯瓊等[11]應(yīng)用UPLC指紋圖譜方法，對廣佛手飲片、水煎液、配方顆粒進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)研究。HPLC指紋圖譜方法的建立，可用于評(píng)價(jià)佛手質(zhì)量[12-13]。然而，迄今尚未見有佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定方法的報(bào)道。佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以傳統(tǒng)煎煮法為理論依據(jù)，經(jīng)提取制備而成的膏粉或濃縮液，用于衡量佛手配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。筆者收集了不同產(chǎn)地的佛手飲片制備佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑，采用建立的能夠同時(shí)測定柚皮苷、橙皮苷含量的測定方法，對15批佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量進(jìn)行了測定。

1主要儀器與材料

CPA225D電子分析天平，德國賽多利斯股份公司提供;KH-7200E超聲波清洗器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司提供;WATERSCLASSHUPLC液相色譜儀，AgilentZorbaxEcilpesC18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。

15批不同產(chǎn)地、不同批次的佛手飲片，分別采購于四川、廣東、緬甸、越南、泰國等地，且于不同時(shí)間采收加工，經(jīng)原河北省藥品檢驗(yàn)所孫寶惠老師鑒定，確定為蕓香科植物佛手的干燥果實(shí)經(jīng)炮制加工后的飲片，飲片來源及批號(hào)見表1。

橙皮苷對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，純度為94.5%;柚皮苷對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，純度為96.5%;甲醇，色譜純，天津科密歐有限公司提供;乙腈，色譜純，天津科密歐有限公司提供;其余試劑均為分析純，水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件和系統(tǒng)適用性

采用AgilentZorbaxEcilpesC18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），以乙腈-0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）磷酸為流動(dòng)相，檢測波長為283nm，柱溫為30℃，流速為0.2mL/min，理論板數(shù)按橙皮苷、柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000[14-15]，測定條件見表2，色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

精密稱定用干燥劑減壓干燥24h的柚皮苷5.51mg、橙皮苷9.73mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密吸取2mL，放入10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1mL含柚皮苷22.0μg、橙皮苷38.9μg的混合對照品溶液。

2.3佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取各批次佛手飲片，除去雜質(zhì)。稱取100g，放入圓底燒瓶中，加入飲片量12倍的水，浸泡30min，加熱煎煮30min。第2次加入飲片量10倍的水，加熱煎煮20min。合并2次煎液，用0.074mm（200目）篩網(wǎng)過濾煎煮液，合并濾液。在高于60℃的溫度下，將佛手提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至生藥量與濃縮液體積比約為1∶3，再經(jīng)濃縮液冷凍干燥機(jī)干燥，得到干膏粉，即佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.4供試品溶液的制備

取各批次佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑，粉碎過2號(hào)篩。精密稱定0.3g，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇25mL，超聲（功率為250W，頻率為40kHz）處理10min，再稱定質(zhì)量。用90%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。分別以柚皮苷、橙皮苷的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，測定的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，線性關(guān)系結(jié)果見表3。結(jié)果表明，2種成分在適當(dāng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2精密度

取佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑S13樣品，參考供試品制備方法進(jìn)行處理，依照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積的RSD值，測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，柚皮苷與橙皮苷峰面積基本不變，RSD值分別為1.37%和1.52%，說明儀器的精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性

取佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑S13干膏粉適量，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件分別于0，2，4，8，12h進(jìn)樣測定，計(jì)算柚皮苷的峰面積，結(jié)果見表5。由表5可知，柚皮苷和橙皮苷RSD值分別為0.59%和1.46%（n=5），表明樣品中柚皮苷、橙皮苷在溶液狀態(tài)下12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4重復(fù)性

取佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑S13干膏粉適量，分別稱取5份，按供試品溶液制備方法制備。精密吸取供試品溶液1μL，依照上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，供試品溶液中柚皮苷、橙皮苷含量的RSD值分別為0.80%和0.84%（n=5），說明方法的重復(fù)性良好。

2.5.5加樣回收率

取同一批干膏粉（S13）9份，精密稱定。分別精密加入一定量的柚皮苷、橙皮苷儲(chǔ)備液，依照供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，每份平行測定2次，結(jié)果見表7。由表7可知，柚皮苷的平均回收率為102.27%（n=9），橙皮苷的平均回收率為101.48%（n=9）。說明方法的回收率較好，符合要求。

2.6樣品測定

取佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，按照2.4項(xiàng)所述方法制備樣品溶液。另取柚皮苷、橙皮苷對照品適量，按照2.2項(xiàng)所述方法制備對照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄柚皮苷、橙皮苷峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表8。

由表8可知，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中柚皮苷與橙皮苷的含量測定和轉(zhuǎn)移率數(shù)據(jù)平行性良好。15批佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分柚皮苷與橙皮苷含量之和為0.0299%～0.0849%，平均含量為0.0601%，SD值為0.0152%，RSD值為25.28%。柚皮苷與橙皮苷含量之和平均值的70%～130%的范圍為0.0420%～0.0781%，平均值加減3倍SD值的范圍為0.0145%～0.1056%。

3討論

3.1檢測波長的選擇

柚皮苷、橙皮苷紫外光譜圖如圖2所示。由圖2可從看出，柚皮苷、橙皮苷均為黃酮類成分，在紫外多個(gè)波段有吸收，283nm波長處有最大紫外吸收，故確定283nm為檢測波長。

3.2提取溶劑的選擇

柚皮苷、橙皮苷2種成分水溶性極差，適宜用有機(jī)溶劑提取。考慮到佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑使用水作為提取溶媒、使用100%甲醇作提取溶劑時(shí)，膏粉容易結(jié)塊，不能完全分散開，經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察，分別使用甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇為提取溶劑進(jìn)行含量比較，發(fā)現(xiàn)采用90%甲醇為提取溶劑時(shí)的含量最高，故選擇90%甲醇作為提取溶劑。

3.3流動(dòng)相選擇

分別比較了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸3種流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相的分離效果較好，故確定其作為流動(dòng)相。此外，橙皮苷、柚皮苷化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，極性接近，使用梯度洗脫的方法分析時(shí)間較長，故采用梯度洗脫方式分離，可使佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的其他成分與目標(biāo)成分之間實(shí)現(xiàn)較好地分離。

4結(jié)語

1）《中華人民共和國藥典》2015版中僅介紹了佛手含量測定以橙皮苷單一成分為指標(biāo)。通過方法摸索，在UPLC設(shè)備上建立了能夠同時(shí)測定柚皮苷、橙皮苷2種成分的方法，節(jié)約了分析時(shí)間，提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2）受佛手產(chǎn)地地理位置的影響，15批佛手飲片中橙皮苷的含量相差較大。標(biāo)準(zhǔn)湯劑以水作為溶媒時(shí)橙皮苷的水溶性較差，而15批佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑中柚皮苷與橙皮苷含量之和轉(zhuǎn)移率范圍為28.01%～43.64%，因此，佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑應(yīng)以柚皮苷、橙皮苷含量之和作為指標(biāo)成分。

3）本次研究利用UPLC法，采取梯度洗脫，建立了能夠同時(shí)測定柚皮苷和橙皮苷2種成分的分析方法，對文獻(xiàn)報(bào)道中的5，7-二甲氧基香豆素的成分也進(jìn)行了相關(guān)分析。然而，由于此成分在佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的含量較低，含量轉(zhuǎn)移率低于5%，故在含量測定指標(biāo)篩選時(shí)，舍去了該成分。黃酮類成分在佛手標(biāo)準(zhǔn)湯劑中所占的量較大，今后需對其作進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]張穎，孔令義.佛手化學(xué)成分的研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，8（6）：16-17.

ZHANGYing，KONGLingyi.StudiesontheconstituentsofCitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle[J].ModernChineseMedicine，2008，8（6）：16-17.

[3]高幼衡，黃海波，徐鴻華，等.佛手化學(xué)成分研究[J].中藥材，2002，25（9）：639-640.

GAOYouheng，HUANGHaibo，XUHonghua，etal.StudiesonthechemicalconsitutentsofCitrusmedicaL.var.sarcodactylis[J].JournalofChineseMedicinalMaterials，2002，25（9）：639-640.

[4]史晶晶，時(shí)博.橙皮苷對高脂血癥模型大鼠代謝紊亂的影響[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，31（4）：554-557.

SHIJingjing，SHIBo.Effectofhesperidinonlipidmetabolismdisorderinhyperlipemiamodelrats[J].ActaChineseMedicine，2016，31（4）：554-557.

[5]PARAFATIM，LUSCIAA，MORITTAVM，etal.Bergamedpolyphenolfractionpreventsnonalcoholicfartyliverdiseaseviastimulationoflipophagyincafeteriadietinducedratmodelofmetabolicsyndrome[J].JournalofNutritionalBiochemistry，2015，26（9）：938-948.

[6]吳昊，橘波，何俏軍，等.新橙皮苷在制備預(yù)防糖尿病藥物中的應(yīng)用[P].中國專利：CN102772424A，2012-06-13.

[7]金曉玲，徐麗珊，何新霞.佛手醇提取液的藥理作用研究[J].中國中藥雜志，2002，27（8）：604-606.

[8]宋劍鋒，富同義.RP-HPLC法測定佛手飲片中橙皮苷含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（5）：1036-1037.

SONGJianfeng，F(xiàn)UTongyi.ContentdeterminationofhesperidininfructusCitrissarcodactylisbyRP-HPLC[J].ChineseArchivesofTraditionalChineseMedicine，2007，25（5）：1036-1037.

[9]曾建偉，吳錦忠，林忠寧，等.HPLC測定不同產(chǎn)地佛手中橙皮苷的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（19）：97-99.

ZENGJianwei，WUJinzhong，LINZhongning，etal.DeterminationofhesperidininfructusCitrissarcodactylisfromdifferentprovenancesbyHPLC[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormalae，2012，18（19）：97-99.

[10]金曉玲，曹詣斌，徐麗珊，等.佛手氨基酸及多糖含量的測定[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，25（1）：66-68.

JINXiaoling，CAOYibin，XULishan，etal.ContentsofaminoacidsandpolysaccharidesfromBergamot[J].JournalofZhejiangNormalUniversity（NaturalSciences），2002，25（1）：66-68.

[11]曹斯瓊，陳向東，黃丹丹，等.佛手配方顆粒UPLC指紋圖譜研究[J].海峽藥學(xué)，2018，30（6）：48-52.

CAOSiqiong，CHENXiangdong，HUANGDandan，etal.UPLCfingerprintanalysisofCitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingleformulagranules[J].StraitPharmaceuticalJournal，2018，30（6）：48-52.

[12]李金玉，賀文婷，王喜英.不同采收期廣佛手指紋圖譜研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（14）：99-101.

LIJinyu，HEWenting，WANGXiying.HPLCfingerprintoffructusCitrisarcodactylisindifferentpickingtimes[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences，2015，43（14）：99-101.

[13]林樂維，蔣林，郝大慶，等.不同產(chǎn)地廣佛手藥材HPLC指紋圖譜的研究[J].中成藥，2009，31（12）：1805-1808.

LINLewei，JIANGLin，HAODaqing，etal.HPLCfingerprintoffructusCitrisarcodactylisfromGuangdongprovince[J].ChinsesTraditionalPatentMedicine，2009，31（12）：1805-1808.

[14]孫福仁，李軍山，馬浩，等.基于UPLC特征圖譜與主成分分析評(píng)價(jià)白芷配方顆粒質(zhì)量研究[J].河北工業(yè)科技，2018，35（6）：454-458.

SUNFuren，LIJunshan，MAHao，etal.StudyonevaluationofthequalityofformulagranuleofAngelicaedahuricaebasedonUPLCandPCA[J].HebeiJournalofIndustrialScienceandTechnology，2018，35（6）：454-458.

[15]田方，李軍山，常云鳳，等.一測多評(píng)法同時(shí)測定車前子配方顆粒中3種成分含量[J].河北工業(yè)科技，2018，35（6）：459-464.

TIANFang，LIJunshan，CHANGYunfeng，etal.SimultaneousdeterminationofthreeconstituentsinPlantagoseedformulagranulesbyQAMS[J].HebeiJournalofIndustrialScienceandTechnology，2018，35（6）：459-464.