福建山羊溶血性曼氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

林裕勝 江錦秀 張靖鵬 游偉 胡奇林

摘 要：【目的】對(duì)福清一山羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的山羊肺炎病原進(jìn)行確診，為福建山羊溶血性曼式桿菌的分離鑒定及檢測(cè)提供研究基礎(chǔ)。【方法】對(duì)剖檢采取的組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，隨后對(duì)溶血性曼氏桿菌、羊口瘡病毒、綿羊肺炎支原體和絲狀支原體簇等羊常見(jiàn)呼吸道病原進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)分離菌進(jìn)行16S rRNA基因克隆測(cè)序，并對(duì)分離株進(jìn)行藥物敏感性研究。【結(jié)果】細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果顯示：從病死羊肺臟中分離到1株細(xì)菌;PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，除溶血性曼氏桿菌有擴(kuò)增條帶外，未檢測(cè)到其他病原;16S rRNA 測(cè)序結(jié)果顯示：分離株16S rRNA基因序列與GenBank上公布的其他溶血性曼氏桿菌的同源性為97.1%～100.0%，與溶血性曼氏桿菌美國(guó)D171參考株同源性高達(dá)100%;以上結(jié)果表明分離菌為溶血性曼氏桿菌，命名為FJ-FQ2018。藥物敏感性試驗(yàn)表明分離株對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、頭孢噻吩、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星等高敏，對(duì)氨芐西林中敏，對(duì)多粘菌素B、林可霉素低敏?！窘Y(jié)論】福建某養(yǎng)殖場(chǎng)引進(jìn)的山羊發(fā)生肺炎后經(jīng)病原分離鑒定確診為溶血性曼氏桿菌感染，分離菌株對(duì)8種抗生素的耐藥性存在差異。

關(guān)鍵詞：山羊;溶血性曼氏桿菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S 852.61文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）03-326-05

Abstract： 【Objective】To identify and study the pathogen that caused the goat pneumonia in a farm in Fuqing，F(xiàn)ujian，and provide reference for the isolation，identification and detection of goat Mannheimia . 【Method】Bacterial isolation and culture were conducted on the tissues taken by autopsy on the diseased goats. ORF virus，mycoplasma，ovipneumonia and mycoplasma cluster were performed by PCR. A microorganism was isolated ? and identified by 16S rRNA gene cloning and sequencing combined with PCR. Subsequently，sensitivities of the isolated strain toward various drugs were tested. 【Result】The PCR detection showed an unique amplified band of the isolated strain that matched Mannheimia haemolytica. The 16S rRNA sequencing of the strain shared 97.1%-100.0% similarities with those of other strains of M. haemolytica published in GenBank which included an 100% homology with the D171 strain. Positively confirmed to be of the M. haemolytica family，the isolate was code-named FJ-FQ2018. The drug sensitivity test showed the isolate to be highly sensitive to flufenicol，enoxacin，cephalothiophene，cefazoline，ciprofloxacin，et al，moderately sensitive to ampicillin，and slightly sensitive to polymyxin B and lincomycin. 【Conclusion】The pathogen of goat pneumonia isotaled from Fujian was a strain of M. haemolytica，and the ?drug sensitivities of the isolate was deemed varions toward 8 antibiotics.

Key words： goat; Mannheimia haemolytica; isolation and identification; antibiotic resistance

0 引言

【研究意義】溶血性曼氏桿菌Mannheimia haemolytica屬于巴氏桿菌科的一個(gè)成員，是牛、羊等反芻動(dòng)物呼吸道疾病的主要病原菌之一，該菌通常寄生于上呼吸道[1-3]，屬于條件致病菌。應(yīng)激條件或病原感染（副流感病毒、綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種等）會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體的免疫機(jī)制下降或致病，使溶血性曼氏桿菌更容易侵入下呼吸道，在肺部定居增殖，并引起急性纖維素性肺炎，是引起?！斑\(yùn)輸熱”的主要病原之一[4-5]。有研究表明，全球約30%的病死牛與該菌有關(guān)，此外，北美國(guó)家每年因該菌造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億美元，已經(jīng)成為養(yǎng)羊業(yè)和養(yǎng)牛業(yè)主要疫病之一[6-8]。

【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，由該菌引發(fā)的疾病吸引了越來(lái)越多獸醫(yī)工作者的關(guān)注，我國(guó)云南、新疆、甘肅、四川、內(nèi)蒙古、江蘇等地均有牛、羊溶血性曼氏桿菌感染的報(bào)道[3，9]。由于該菌在無(wú)血培養(yǎng)基上很難生長(zhǎng)，因此在初次分離時(shí)需在含有10%的血瓊脂培養(yǎng)、巧克力培養(yǎng)基或含有4%牛血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)，最佳生長(zhǎng)溫度為37℃，最佳pH值為7.0～7.5。鑒定方法主要包括生化鑒定、免疫學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定等，其中分子生物學(xué)鑒定主要以PCR為主?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2018年7月，福建省某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)羊群出現(xiàn)咳嗽癥狀，且有個(gè)別死亡，疑似溶血性曼式桿菌感染。鑒于福建省尚未見(jiàn)溶血性曼氏桿菌感染的報(bào)道，需要進(jìn)一步查明該病的病原菌?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采集了病死羊的肺臟，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，對(duì)分離株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)開(kāi)展藥物敏感性試驗(yàn)，為溶血性曼氏桿菌的分離鑒定及合理用藥供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源及采集

病料來(lái)自福建省福清市某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)病死羊。2018年7月，福清市某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)從外地引種43頭福清山羊，2周后有3頭4月齡山羊出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難等癥狀，發(fā)病1周后1頭死亡。對(duì)送檢病死羊進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)肺臟嚴(yán)重出血，氣管內(nèi)有大量白色分泌物，肺臟有纖維樣滲出物、局部瘀血，心包積水，心葉肉變。無(wú)菌采取肺組織，4～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 相關(guān)試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌微量生化鑒定管、馬血清購(gòu)自HyClone公司;血液瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;LB培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司;細(xì)菌革蘭氏染色液購(gòu)自廣東凱微生物科技有限公司;藥敏紙片購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;ExTaq酶、pMD19-T載體、DNA標(biāo)準(zhǔn)品等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌取肺臟深部組織劃線接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，再挑取單個(gè)的溶血菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

1.4 生化試驗(yàn)

利用購(gòu)買的細(xì)菌微量生化鑒定管，參照操作說(shuō)明對(duì)分離的菌株測(cè)定生化指標(biāo)，在37℃下培養(yǎng)24 h，隨后觀察結(jié)果。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

溶血性曼氏桿菌種特異性鑒別引物和細(xì)菌16S rRNA通用引物分別參考文獻(xiàn)[10-11]，羊口瘡病毒、綿羊肺炎支原體、絲狀支原體引物參照文獻(xiàn)[12-13]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.6 細(xì)菌形態(tài)觀察

挑取血瓊脂平板上長(zhǎng)勢(shì)較好的單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢以及細(xì)菌形態(tài)觀察。

1.7 PCR鑒定和16S rRNA基因序列鑒定

以提取的分離株的DNA作為模板，進(jìn)行PCR鑒定和16S rRNA測(cè)序。PCR和16S rRNA反應(yīng)體系20 μL：ExTaq Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，模板2 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL。PCR反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后PCR鑒定引物擴(kuò)增產(chǎn)物和16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中16S rRNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后送往福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的其他細(xì)菌進(jìn)行同源性分析（表1），采用DNAStar軟件構(gòu)建該菌的遺傳進(jìn)化樹。

1.8 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

在生物安全柜中，將純化后的分離株培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水稀釋后用經(jīng)酒精火焰滅菌的三角接種環(huán)涂布于血瓊脂平板上，隨后將藥敏紙片粘貼在平板上，操作完成后將平皿放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NC-CLS） 2009 年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌挑取病死羊肺組織，接種于血瓊脂平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)培養(yǎng)基上有光滑、半透明的菌落，且有明顯的溶血現(xiàn)象。

2.2 細(xì)菌染色特性

對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行涂片染色、鏡檢，可見(jiàn)革蘭氏陰性短球桿菌，菌體兩端鈍圓且著色較深，菌體單個(gè)、散在排列。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株具有溶血，氧化酶陽(yáng)性，能夠發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，不能發(fā)酵阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、吲哚;靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性。生化試驗(yàn)結(jié)果與溶血性曼氏桿菌的生化特征相符合。

2.4 PCR鑒定

對(duì)采取的病料組織提取核酸后進(jìn)行羊口瘡病毒、綿羊肺炎支原體、絲狀支原體等病原進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果未有檢測(cè)到擴(kuò)增條帶（圖略）;同時(shí)利用溶血性曼氏桿菌特異性引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后結(jié)果顯示，分離株在453 bp處有一條很亮的條帶，而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶（圖1）。

2.6 溶血性曼氏桿菌分離菌株的藥敏試驗(yàn)

分離本菌對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、卡那霉素、頭孢噻吩、慶大霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、鏈霉素、四環(huán)素高敏，對(duì)氨芐西林中敏，對(duì)多粘菌素B、林可霉素低敏。表明該地區(qū)分離的溶血性曼氏桿菌對(duì)抗生素的耐藥性較低。

3 討 論

溶血性曼氏桿菌是導(dǎo)致牛、羊等反芻動(dòng)物肺炎和新生羔羊急性敗血癥的病原菌，近年來(lái)對(duì)于溶血性曼氏桿菌的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，該菌被認(rèn)為是引起大角羊致死性肺炎的主要致病菌[14-16]。

溶血性曼氏桿菌分離較為困難。Shanthalingam等[17]于2009-2010年對(duì)美國(guó)3個(gè)不同地區(qū)的大角羊肺臟進(jìn)行溶血性曼氏桿菌的分離和PCR鑒定，結(jié)果顯示病原的分離率為3%，而PCR的檢出率為77%;馮旭飛等[18]于2013年對(duì)四川地區(qū)40份綿羊肺臟進(jìn)行分離，分離到8株，分離率為20%，而PCR檢出率為80%;;徐慧等[7]于2009年對(duì)新疆地區(qū)PCR鑒定為溶血性曼氏桿菌的29份樣品進(jìn)行分離，僅分離到3株溶血性曼氏桿菌，表明該菌的分離率較低。

本試驗(yàn)從病變肺臟組織中分離出1株細(xì)菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、劃線培養(yǎng)和溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株為革蘭氏陰性桿菌，其在血瓊脂平板上呈現(xiàn)針尖大小的菌落，且有明顯的溶血現(xiàn)象，生化試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株具有溶血，氧化酶陽(yáng)性，能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖等，不能發(fā)酵阿拉伯糖、鼠李糖等;靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性，符合溶血性曼氏桿菌的生化特征。PCR作為快速診斷技術(shù)，在病原鑒定過(guò)程中得到廣泛應(yīng)用，有些病原的診斷還以此作為金標(biāo)準(zhǔn)。因此本試驗(yàn)選擇用特異性PCR來(lái)進(jìn)一步鑒定分離得到的細(xì)菌，同時(shí)為了進(jìn)一步驗(yàn)證該菌是否是溶血性曼氏桿菌，本研究對(duì)16S rRNA 基因序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的細(xì)菌進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明本研究的分離菌與GenBank上公布的其他溶血性曼氏桿菌的同源性為97.1%～100.0%，與美國(guó)D171參考株同源性高達(dá)100%;從構(gòu)建的溶血性曼氏桿菌16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可見(jiàn)，分離株FJ-FQ2018與美國(guó)USDA-ARS-USMARC-184等5株參考株、英國(guó)NCTC10609參考株、丹麥PHL213參考株、日本Th1405參考株、比利時(shí)MB1401參考株、中國(guó)廣東GDZJcattle2014參考株和中國(guó)新疆XJKLMY-10-NF參考株親緣關(guān)系較近，處于同一進(jìn)化分支上，與印度NIVEDI/MHS-2參考株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，以上試驗(yàn)結(jié)果證明分離菌為溶血性曼氏桿菌。

當(dāng)前溶血性曼氏桿菌耐藥性研究表明，有些菌株已對(duì)某些藥物產(chǎn)生了耐藥性，如磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物[19-21]，由于抗生素治療是治療本病的最佳療法，因此了解菌株的耐藥性對(duì)臨床治療具有重要意義。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明： 分離菌對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、卡那霉素、頭孢噻吩、慶大霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、鏈霉素、四環(huán)素高敏，對(duì)氨芐西林中敏，對(duì)多粘菌素B、林可霉素低敏。該結(jié)果與Katsuda等[19]和Lubbers等[20]研究結(jié)果明顯不一致，但與馮旭飛等[18]研究結(jié)果一致，側(cè)面證實(shí)了不同地區(qū)分離株的耐藥性存在一定差異。

本研究從發(fā)生肺炎山羊肺臟中分離到溶血性曼氏桿菌，病死羊的癥狀和病理變化與溶血性曼氏桿菌引起的疾病相似，但該分離菌是否為本次山羊發(fā)病的病原，尚需進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)。

本研究首次報(bào)道了福建省羊溶血性曼氏桿菌的分離鑒定以及耐藥性，為福建省羊溶血性曼氏桿菌病的診斷方法研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為該病的科學(xué)防控及合理用藥提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張 梅）