越橘原花青素合成相關(guān)基因VcLAR和VcANR的克隆和功能鑒定

宋楊 劉紅弟 王海波 張紅軍 劉鳳之

摘要：本研究以越橘（Vaccinium corymbosum Duke）為試驗(yàn)材料，克隆原花青素合成基因VcLAR和VcANR，分析其表達(dá)模式及其對(duì)水楊酸和茉莉酸甲酯的響應(yīng)，鑒定其在原花青素合成過程中的作用。結(jié)果表明，成功獲得了越橘VcLAR（CenBank登錄號(hào)為MH321470）和VcANR（CenBank登錄號(hào)為MH321471）基因。VcLAR和VcANR在根、莖、幼葉、花以及不同發(fā)育階段果實(shí)中均可表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量存在差異，在綠果中的相對(duì)表達(dá)量最高。在不同發(fā)育階段果實(shí)中，原花青素含量在綠果中最高，在藍(lán)果中最低。水楊酸處理可促進(jìn)VcLAR和VcANR基因的表達(dá)，茉莉酸甲酯處理可抑制VcLAR和VcANR基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)VcANR基因擬南芥株系中，原花青素的含量顯著高于野生型。在轉(zhuǎn)VcLAR基因擬南芥株系中，原花青素含量與野生型相比無明顯變化。由此推測(cè)，VcLAR和VcANR在越橘果實(shí)原花青素積累過程中發(fā)揮重要作用，并受水楊酸和茉莉酸甲酯的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：越橘;VcLAR基因;VcANR基因;水楊酸;茉莉酸甲酯;原花青素

中圖分類號(hào)： S663.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（ 2019） 03-0682-07

越橘亦稱藍(lán)莓，其果實(shí)中含有豐富的黃酮類化合物，原花青素是黃酮類化合物的重要組成部分，在提高植物抵御逆境脅迫能力和提高人體免疫力等方面具有一定作用[1-3]。明確越橘果實(shí)中原花青素的代謝調(diào)控機(jī)理對(duì)果實(shí)品質(zhì)改良具有重要意義。

植物黃酮類化合物合成途徑起始于苯丙氨酸代謝，在此過程中有許多結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因參與原花青素的生物合成。其中，具有NADPH結(jié)合域的花青素還原酶（ANR）和無色花青素還原酶（LAR）是原花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化無色花青素生成原花青素。目前，已經(jīng)在許多植物中發(fā)現(xiàn)了ANR和LAR基因，其表達(dá)變化與原花青素積累情況緊密相關(guān)[4-5]。

國內(nèi)外已有多位學(xué)者對(duì)越橘中原花青素等黃酮類化合物的合成調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。有學(xué)者利用de novo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析了黃酮類化合物合成相關(guān)基因在越橘果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期及其在果皮和果肉中的差異表達(dá)情況[6-8]。Zifkin等[9]建立了越橘果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)序列標(biāo)簽（ EST）數(shù)據(jù)庫，并分析了原花青素和花青素合成途徑中關(guān)鍵基因在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況，指出脫落酸對(duì)于越橘果實(shí)中花青素的生物合成和果實(shí)成熟非常重要。目前，對(duì)越橘原花青素的合成機(jī)理知之甚少，ANR和LAR基因與越橘果實(shí)中原花青素生物合成是否相關(guān)還不清楚。本研究擬從越橘中分離并鑒定VcLAR和VcANR基因，通過表達(dá)模式和轉(zhuǎn)基因分析，闡釋他們?cè)谠ㄇ嗨厣锖铣蛇^程中的重要作用，以期為越橘果實(shí)黃酮類化合物代謝調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年7月- 2018年4月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所（遼寧省興城市）進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的材料為7年生越橘（Vacciniumcorymbosum Duke）。選取長勢(shì)一致的越橘植株，分別采集花后40 d（綠果）、60 d（粉果）和75 d（藍(lán)果）花絮頂端的果實(shí)，采后立即用液氮速凍，-70℃保存。使用濃度為10 mmol/L的水楊酸（SA）和50μmol/L的茉莉酸甲酯（MejA）處理長勢(shì)一致的花后40 d果實(shí)，分別在處理后Oh、3h、6h、9h取樣，液氮速凍后保存，清水處理為對(duì)照。用野生型擬南芥（Arabidopsis ecotype Columbia）進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.2 基因克隆和序列分析

根據(jù)在越橘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（Song等[10]）中獲得的序列來設(shè)計(jì)引物VcLAR-F/R和VcANR-F/R，擴(kuò)增開放讀碼框序列（ ORF），引物序列如表1顯示。以Duke越橘果實(shí)的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5.0 min;95℃變性30.0 s，57℃退火30.0 s，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10.0 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，連接到克隆載體pEASTblunt zero進(jìn)行測(cè)序。

利用軟件CLC Sequence Viewer 6分析VcLAR和VcANR蛋白的保守序列。采用軟件MEGA 5引人多個(gè)物種的LAR和ANR蛋白，對(duì)VcLAR和VcANR蛋白進(jìn)行聚類分析。

1.3 RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析

采用TaKaRa公司的植物總RNA提取試劑盒（ Code No.9769）提取越橘果實(shí)的RNA。以提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用普通PCR進(jìn)行序列驗(yàn)證，目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、回收、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，由華大基因完成測(cè)序?；蛐蛄写_定后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析。以VcGAPDH為管家基因，計(jì)算其他基因在越橘中的相對(duì)表達(dá)量。以擬南芥AtUBQlO為管家基因，計(jì)算VcLAR和VcANR在轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥中的相對(duì)表達(dá)量。使用儀器為Bio-Rad公司的CFX Connect PCR system，所用試劑為ThermoFisher公司的PowerUpnvr SYBRRGreen Master Mix（ Code No.A25742）。所有PCR均設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系：SYBR Mixture 10.0μl，cDNA 2.0μl，上、下游引物各0.5μl，加去離子水至20.0μl。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min;95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的第2步進(jìn)行熒光采集。最后采用2-△△Ct法分析定量數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR引物見表1。

1.4 原花青素含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]的測(cè)定方法，使用高效液相色譜法測(cè)定越橘3個(gè)發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的原花青素含量。擬南芥種子中原花青素的測(cè)定：稱取0.5g樣品，液氮研磨，加入1.0 ml 70. 0%丙酮溶液（含0.1%抗壞血酸），4℃黑暗條件下靜置30 min，離心后取上清液，沉淀中再加入1.0 ml 70.0%丙酮溶液，4℃條件下靜置30 min，離心后取上清液，合并2次上清液，加入3.0 ml乙醚，- 20℃條件下靜置1h。取2.0ml下層相，加入1.0 ml甲醇和0.5 ml 2.0%的4-=甲基氨基肉桂醛（4-dimethylaminocinnamaldehyde，DMACA）染色液，于室溫下靜置20 min，用紫外分光光度計(jì)在643 nm處測(cè)量吸光度。定量標(biāo)準(zhǔn)品為兒茶素（ Catechin）。

1.5 擬南芥轉(zhuǎn)化和鑒定

構(gòu)建VcLAR-pRII01和VcANR-pRIl01過量表達(dá)載體，將這2個(gè)重組載體分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌侵染花序法分別轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。在含有卡那霉素的MS（ Murashige and skoog）固體培養(yǎng)基上篩選T1代轉(zhuǎn)基因植株。將抗性苗移栽至基質(zhì)中，并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收獲的T2代種子用于試驗(yàn)。載體構(gòu)建時(shí)使用的引物見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，使用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘VcLAR和VcANR基因的克隆、編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化樹分析

通過RT-PCR技術(shù)分別獲得2條約1100 bp和1 000 bp的條帶。對(duì)克隆所得片段進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示，VcIAR和VcANR基因的ORF長度分別為1 056 bp和1 002 bp，分別編碼含有352個(gè)和334個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

使用軟件CLC Sequence Viewer 6分析越橘VcLAR和VcANR蛋白及其他植物L(fēng)AR和ANR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果（圖1）顯示，VcLAR和VcANR是短鏈脫氫/還原酶超家族成員，均包含NADPH結(jié)合域。

將VcLAR和VcANR蛋白序列與擬南芥、葡萄、蘋果、柿等多個(gè)不同物種的LAR和ANR蛋白序列進(jìn)行分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖2）表明，越橘的VcLAR和VcANR分別與葡萄的VvLAR1和柿的DkANR同源性最高。

2.2 VcLAR和VcANR基因的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析VcLAR和VcANR在越橘不同植物器官以及在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果（圖3）顯示，VcLAR在綠果中的相對(duì)表達(dá)量最高，在粉果中的相對(duì)表達(dá)量次之，在藍(lán)果中的相對(duì)表達(dá)量最低。VcANR在綠果中的相對(duì)表達(dá)量最高，在根中的相對(duì)表達(dá)量次之，在花托中的相對(duì)表達(dá)量最低。

圖4顯示，在果實(shí)發(fā)育過程中，花后40 d的綠果中，原花青素含量最高，隨著果實(shí)成熟，原花青素含量持續(xù)下降。VcLAR相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與原花青素含量的變化趨勢(shì)相似，VcANR的相對(duì)表達(dá)量呈先急劇下降后略有上升的趨勢(shì)。說明，VcLAR和VcANR相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)與原花青素含量的減少有一定關(guān)系。

采用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析VcLAR和VcANR對(duì)水楊酸和茉莉酸甲酯的響應(yīng)，結(jié)果（圖5）表明，在水楊酸（ 10 mmol/L SA）處理下，隨著處理時(shí)間的延長，VcLAR的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低，但始終高于對(duì)照，在處理后6h達(dá)到最大。VcANR在水楊酸的誘導(dǎo)下，相對(duì)表達(dá)量持續(xù)升高。在茉莉酸甲酯（ 50μmol/L MejA）處理下，VcLAR和VcANR的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照。

2.3 VcLAR和VcANR的過量表達(dá)對(duì)原花青素含量的影響

為進(jìn)一步研究VcLAR和VcANR的功能，分別構(gòu)建了VcLAR和VcANR的植物過量表達(dá)載體。用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法侵染野生型擬南芥，分別獲得4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。圖6顯示，在轉(zhuǎn)VcANR基因擬南芥株系中，VcANR的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型，轉(zhuǎn)基因株系中原花青素的含量顯著高于野生型。在轉(zhuǎn)VcLAR基因擬南芥株系中，VcLAR的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型，轉(zhuǎn)基因株系中原花青素含量與野生型相比無顯著變化。

3 討論

越橘在中國的種植面積和產(chǎn)量穩(wěn)步增長[12]。越橘果實(shí)中含有豐富的原花青素，作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，在植物抗逆及清除人體內(nèi)自由基等方面起重要作用[13-16]。

LAR和ANR基因是調(diào)控植物原花青素合成的關(guān)鍵基因。本研究分離獲得的VcLAR和VcANR基因?qū)儆诘湫偷亩替溍摎?還原酶超家族基因，編碼的蛋白質(zhì)含有保守的NADPH結(jié)合域。越橘的VcLAR和VcANR分別與葡萄的VvLAR1和柿的DkANR同源性最高，說明VcLAR和VcANR可能與葡萄、柿及其他物種中的同源基因具有相似的生物學(xué)功能。原花青素的生物合成受多種植物激素的影響[17]。雖然前人的研究結(jié)果表明，植物激素可調(diào)節(jié)花青素、原花青素和黃酮醇等類黃酮物質(zhì)的合成[18-19]。但是，水楊酸和茉莉酸甲酯在調(diào)節(jié)原花青素合成過程中的作用及分子機(jī)制還不清晰。本研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)發(fā)育過程中，VcLAR相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與原花青素含量的變化趨勢(shì)相似。VcLAR和VcANR對(duì)水楊酸和茉莉酸甲酯處理均有明顯響應(yīng)。水楊酸處理下，隨著處理時(shí)間的延長，VcLAR的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，VcANR的相對(duì)表達(dá)量持續(xù)升高。茉莉酸甲酯處理下，VcLAR和VcANR的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照。通過在擬南芥中過量表達(dá)VcANR，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株種子中原花青素的積累顯著高于野生型，而過量表達(dá)VcLAR擬南芥植株中原花青素含量與野生型相比無顯著變化。

對(duì)很多植物的研究結(jié)果表明，R2R3-MYB、bHLH（ basic helix-loop-helix）和WD40（ WD-repeatprotein）蛋白質(zhì)復(fù)合體可調(diào)控/AR和ANR的轉(zhuǎn)錄，從而影響原花青素的合成[20-21]。越橘中是否存在這樣的調(diào)控模式？后期將通過酵母雜交和電泳凝膠遷移率試驗(yàn)，篩選以VcLAR和VcANR為靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步解析越橘原花青素的合成途徑。

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（責(zé)任編輯：王妮）