葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

陳靜碧

摘 要：本文圍繞縮短實(shí)驗(yàn)周期這一視角，從提取方法、提取溶劑與層析方法三方面對(duì)傳統(tǒng)的分離葉綠體色素的方法進(jìn)行改進(jìn)，從而對(duì)提取和分離葉綠體色素的方法進(jìn)行優(yōu)化，以期為高中生物教學(xué)更好地實(shí)施提供參考。

關(guān)鍵詞：葉綠體色素;提取;分離;層析

1.問(wèn)題的提出

葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)是高中生物教學(xué)中一個(gè)重要必做的實(shí)驗(yàn)。教材做法如下：稱取5g新鮮的綠色葉片剪碎（或菠菜干粉），放入研缽中，向研缽中放入少許二氧化硅和碳酸鈣，再加入5mL95%乙醇，進(jìn)行迅速、充分地研磨，然后將研磨液倒入小玻璃漏斗中過(guò)濾，將濾液收集到小試管中，供隨后進(jìn)行的紙層析色素分離實(shí)驗(yàn)。實(shí)際操作下來(lái)，實(shí)驗(yàn)的效果往往不太理想，具體表現(xiàn)如下：（1）提取過(guò)程費(fèi)時(shí)又費(fèi)力：一是研磨有難度且費(fèi)力，二是乙醇易揮發(fā)，研磨液容易變成成研磨糊;三是過(guò)濾介質(zhì)易吸附色素導(dǎo)致色素濃度和提取液體積下降。（2）層析分離效果不理想，一是色素濃度不足，二是無(wú)胡蘿卜素色素帶或不明顯，三是濾液細(xì)線費(fèi)時(shí)條帶成波狀。鑒于以上主要原因，葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行學(xué)生分組的時(shí)候時(shí)常出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想和未完成;常規(guī)課堂上無(wú)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)演示。

2.原理分析

葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素2類，主要包括葉綠素a（C55H72O5N4Mg）、葉綠素b（C55H70O6N4Mg）、β-胡蘿卜素（C40H56）和葉黃素（C40H56O2）4種。葉綠素a和葉綠素b為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，易溶于弱極性的有機(jī)溶劑中。胡蘿卜素是一種橙色天然色素，屬于四萜類，有α、β、γ3種異構(gòu)體，其中，β異構(gòu)體含量最多。很多人認(rèn)為分離效果取決于分離的操作，其實(shí)分離效果很大程度還取決于提取過(guò)程的操作。胡蘿卜素不溶于水，在乙醇、丙酮中溶解度不如在乙酸乙酯中溶解度大。葉黃素為一種黃色色素，與葉綠素同存在于植物體中，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在乙醚中溶解度較小。從上述提取原理可以看出，弱極性有機(jī)溶劑對(duì)葉綠素的溶解度大，對(duì)胡蘿卜素溶解均不夠理想。增加萃取步驟可以提高色素提取液濃度，易發(fā)生顯著的色素?zé)晒猬F(xiàn)象。通過(guò)色素溶液顏色深淺、熒光現(xiàn)象程度可以定性反應(yīng)色素提取的質(zhì)量。

3.實(shí)驗(yàn)方法步驟

3.1葉綠體色素提取實(shí)驗(yàn)：

（1）菠菜去粗大葉脈，45℃烘干碾成干粉狀（或碎末）

（2）取0.5g菠菜粉末，加入2mL乙醇-乙酸乙酯2∶1（V/V）溶液，少許碳酸鈉粉末，80℃以上水浴加熱（加熱至試管內(nèi)乙醇沸騰）2min。

（3）乙醇-乙酸乙酯色素提取液中加入1ml層析液進(jìn)行萃取，觀察明顯的色素?zé)晒猬F(xiàn)象。

3.2葉綠體色素分離實(shí)驗(yàn)：

（1）取兩塊干凈的載玻片，選擇其中的一塊滴兩滴色素提取液，然后在另一塊載玻片上將提取液推平，制成涂片。

（2）將濾紙條對(duì)折，用對(duì)折后的濾紙把載玻片上的色素擦干凈（濾紙條垂直色素涂片，使折橫與其接觸），后將對(duì)折線反折后拉平，濾紙條下端會(huì)出現(xiàn)一條深綠色的濾液細(xì)線。

（3）將濾紙條放入針筒制成的層析柱中，通過(guò)活塞推拉促進(jìn)層析液在濾紙條上擴(kuò)散。觀察色素分離結(jié)果。

由圖1可知，試管2色素溶解快于試管1，表明乙酸乙酯促進(jìn)葉綠體色素的溶解;圖2紅色熒光現(xiàn)象顯著;圖3中2號(hào)濾紙條的色素帶濃于1號(hào)，胡蘿卜素最顯著;以上結(jié)果表明，乙醇-乙酸乙酯煮沸法有助于提升色素濃度。圖4從胡蘿卜素條帶的位置看，2號(hào)（針筒層析柱組）的跑帶速度快于1號(hào)（普通層析柱組），表明針筒抽濾操作可減少層析時(shí)間。

4.討論與反思

與浙科版教材方法相比，避免了原實(shí)驗(yàn)程序繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、所用材料用量多、濾液渾濁等缺點(diǎn)。本方案本著易于推廣的思路，通過(guò)方法步驟材料試劑的優(yōu)化，節(jié)約了時(shí)間節(jié)省了成本，可用于課堂演示實(shí)驗(yàn)，層析結(jié)果等待期間，教師可穿插實(shí)驗(yàn)原理講解。

4.1耗時(shí)較短，可用于課堂演示。

一是本實(shí)驗(yàn)提取色素不需研磨不需要過(guò)濾，提取色素液的時(shí)間只需2～3min，同時(shí)避免大量的清洗工作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明色素提取液濃度高，活性好。二是用涂片的方法改機(jī)畫濾液細(xì)線，一步到位，避免了反復(fù)劃線不斷風(fēng)干的繁瑣操作，不同學(xué)生操作結(jié)果表明，制作涂片畫線的效果明顯;三是采用注射抽濾加壓的方法，雖然效果沒(méi)有明顯改善，但層析的速度快于層析柱自然層析。綜上，本實(shí)驗(yàn)可比教材方法提速15min以上，具體時(shí)間因操作者而異。

4.2色素濃度加大。由于加入乙酸乙酯增大了胡蘿卜的溶解，由于色素被萃取濃縮，教師可讓學(xué)生觀察明顯的色素?zé)晒猬F(xiàn)象，激發(fā)學(xué)生進(jìn)一步探究的興趣。容易吸取到試管上層經(jīng)萃取濃縮的色素溶液，經(jīng)劃線、層析后色素分帶清晰，分離效果十分顯著。乙酸乙酯時(shí)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常備用藥，易于獲得，且低毒，增加萃取步驟實(shí)現(xiàn)了跨學(xué)科知識(shí)的整合，較好的實(shí)踐了新課改的理念。另外，在材料的選擇上，很多植物的葉片，如大蒜、大葉黃楊等植物，取材方便，但太難以研磨，幾乎無(wú)法得到提取液。采用乙醇沸水浴法均易得到，受季節(jié)、氣候和地域等因素影響。此實(shí)驗(yàn)以乙醇煮沸加熱，效果才能明顯。

4.3耗材少，體現(xiàn)綠色實(shí)驗(yàn)。一是利用菠菜干粉進(jìn)行乙醇沸水浴法，加入碳酸鈉和不加碳酸鈉差異不大，故可同時(shí)省去碳酸鈣和二氧化硅的使用;二是教材中建議研磨過(guò)程中加入2-3mL95%乙醇，在實(shí)際操作中因菠菜干粉的吸收、乙醇自身?yè)]發(fā)、過(guò)濾介質(zhì)對(duì)色素溶液的吸收等原因，一般需要10mL，一些學(xué)生用量更多，本實(shí)驗(yàn)僅需2mL;三是水浴法分層明顯，不需要過(guò)濾裝置的準(zhǔn)備;但是需要準(zhǔn)備水浴鍋等公用的加熱裝置。