缺血性卒中后神經(jīng)元的泛素化調(diào)控

孫藝航，羅寧，葛金文

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長沙 410208)

在不同病理條件下生物體會發(fā)生一系列改變，細胞通過感知外界變化整合、傳輸信息并做出相應(yīng)調(diào)整，這種動態(tài)變化由多種復(fù)雜機制(包括翻譯后蛋白質(zhì)修飾)共同參與，可動態(tài)的規(guī)劃蛋白的特性和功能，以應(yīng)對細胞穩(wěn)態(tài)失衡[1]。翻譯后蛋白質(zhì)修飾的種類較多，包括小的化學(xué)基團修飾(如氨基酸側(cè)鏈磷酸化、乙?；蚣谆?和小蛋白質(zhì)修飾，其中對泛素激活的研究最廣泛，泛素激活通過3種酶的級聯(lián)反應(yīng)與靶蛋白共價結(jié)合影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定、定位和相互作用[2-3]。泛素化對細胞穩(wěn)態(tài)的影響至關(guān)重要，據(jù)估計，細胞中任何時間的蛋白質(zhì)泛素化均超過5 000種，約占已編碼人類蛋白質(zhì)組的25%[4]；此外，泛素化還參與了多種細胞程序，包括細胞周期控制、免疫反應(yīng)、炎癥以及凋亡[5]。

缺血性卒中后，缺血區(qū)及其周圍未壞死區(qū)域的神經(jīng)元會立即發(fā)生泛素化反應(yīng)，并可在其中檢測到泛素蛋白結(jié)合物，研究表明，泛素化蛋白結(jié)合物水平的增加在神經(jīng)保護中發(fā)揮了重要作用[6]。但目前缺血性卒中后蛋白泛素化升高與神經(jīng)元損傷之間的關(guān)系仍不清楚。現(xiàn)對泛素化的調(diào)控過程、神經(jīng)元內(nèi)泛素化修飾以及缺血性卒中后泛素化與神經(jīng)元的潛在聯(lián)系予以綜述。

1 泛素化的調(diào)控過程

1.1泛素標記底物蛋白 幾乎所有泛素與底物蛋白結(jié)合都需要泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的連續(xù)作用。目前只鑒定出泛素活化酶1和泛素活化酶6兩種哺乳動物泛素活化酶，它們可特異性地激活人體內(nèi)泛素[7]；泛素活化酶E1的作用呈ATP依賴性，泛素活化酶E1催化泛素C端甘氨酸殘基發(fā)生腺苷化，隨后將其轉(zhuǎn)移到泛素活化酶E1活性中心的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，并形成硫酯鍵[8]。有報道，已鑒定出哺乳動物細胞中超過30種泛素結(jié)合酶E2[9]，當(dāng)泛素結(jié)合酶E2與泛素活化酶E1反應(yīng)后，泛素結(jié)合酶E2的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域攻擊泛素活化酶E1與泛素間的硫酯鍵，使其形成新的泛素結(jié)合酶E2與泛素間的硫酯鍵[10]。此時，泛素連接酶E3與底物蛋白連接，并作為支架協(xié)助泛素結(jié)合酶E2與泛素間硫酯鍵接近底物，從而使泛素與底物形成蛋白共價結(jié)合。目前對泛素連接酶E3的研究較廣泛，已發(fā)現(xiàn)超過600多種泛素連接酶E3，其與泛素結(jié)合酶E2以約25 000種方式配對，以保證泛素與底物蛋白的識別具有特異性[7]。

1.2泛素修飾底物蛋白 泛素修飾底物蛋白的方式很多，如單泛素化、多位點單泛素化、形成泛素鏈。泛素包含1個N端甲硫氨酸殘基(M1)和7個內(nèi)部的賴氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)[5]。根據(jù)不同連接方式，可將泛素鏈分為同源多聚泛素鏈和異源多聚泛素鏈；同源多聚泛素鏈的形成是泛素分子內(nèi)部的賴氨酸殘基依次相互連接；而異源多聚泛素鏈中包含超過兩種及以上的連接方式[4]。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多聚泛素鏈還可以被甲基化、泛素樣物質(zhì)、磷酸化等修飾[11]。不同泛素結(jié)合域可以多樣的泛素修飾方式與目標蛋白結(jié)合，進而在細胞內(nèi)發(fā)揮不同調(diào)控作用，可見泛素鏈的功能與其結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[2]。K48鏈是目前研究最廣泛的泛素鏈，占泛素修飾50%，始終被蛋白酶體識別并作為降解信號[7]；K63鏈和M1鏈主要構(gòu)建和拆卸信號復(fù)合物，參與信號免疫和核因子κB通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；而單泛素化和多位點單泛素化是完全不同的修飾方式[12]。由此可見，區(qū)分不同泛素鏈連接的泛素連接酶E3對于判斷其參與的下游通路及其介導(dǎo)的反應(yīng)至關(guān)重要。

1.3泛素化蛋白的降解和去泛素化 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可以清除錯誤折疊和損傷的蛋白，目前預(yù)測超過50%被標記的泛素化蛋白通過蛋白酶體途徑被降解。26S蛋白酶體由一個具有蛋白水解功能的20S核心顆粒組成，呈筒狀結(jié)構(gòu)，是負責(zé)細胞內(nèi)降解的超大分子機器[11]。20S顆粒的一端或兩端包裹19S/PA700調(diào)節(jié)激活復(fù)合物，對進入20S核心顆粒的通路進行特異性調(diào)控，該復(fù)合物通過與泛素鏈結(jié)合，發(fā)生去泛素化、去折疊成線性多肽鏈后，進入20S核心顆粒，因此蛋白酶體對泛素化蛋白的降解具有特異性[7，13]。

泛素化是一種可逆性修飾，去泛素化是泛素化的逆過程，由去泛素酶完成。去泛素酶通過水解泛素C端與底物蛋白之間的酯鍵、肽鍵或異肽鍵，防止泛素進入蛋白酶體而被降解，維持游離泛素的水平[14]。泛素酶種類繁多，目前人類基因組編碼發(fā)現(xiàn)了100多種去泛素酶，它們參與調(diào)控神經(jīng)退行性疾病、免疫、炎癥和腫瘤等疾病的發(fā)生與進展[4]。根據(jù)酶的活性中心將泛素酶分為泛素特異性蛋白酶家族、泛素C端水解酶家族、 Machado-Josephin結(jié)構(gòu)域蛋白酶家族、卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶家族和MPN(+)/JAMM蛋白酶家族五大類，前四類被統(tǒng)稱為半胱氨酸蛋白酶，MPN(+)/JAMM蛋白酶家族屬于金屬蛋白酶[7]。泛素化和去泛素化相互協(xié)調(diào)，在維持細胞內(nèi)泛素水平、信號傳遞以及精確調(diào)控蛋白質(zhì)泛素化類型和程度過程中發(fā)揮了重要作用。

2 缺血性卒中后的泛素化修飾

2.1泛素化修飾在神經(jīng)元內(nèi)的作用 泛素化修飾對于神經(jīng)元的發(fā)育過程非常重要。首先，神經(jīng)元細胞體生成泛素后，轉(zhuǎn)運至軸突和樹突等遠處突起，但運輸速度非常緩慢，在不同神經(jīng)中可能需要數(shù)天甚至數(shù)周；而氧化應(yīng)激反應(yīng)伴隨泛素升高的運輸速度緩慢可能使遠端軸突和樹突易受到缺血性卒中后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[15]。神經(jīng)元中泛素活化酶E1或蛋白酶體亞基的功能缺失等突變會阻礙軸突修剪，提示泛素化修飾可能對某些軸突修剪的發(fā)育過程中起作用[16]。其次，神經(jīng)元活動的增加和減少與樹突棘中泛素化蛋白的數(shù)量有關(guān)，許多參與突觸功能的關(guān)鍵分子受泛素化調(diào)控，包括許多突觸后密度的結(jié)構(gòu)成分和受體[17-18]。蛋白酶體途徑是神經(jīng)元清除異常蛋白的主要機制之一，如果蛋白酶體途徑不能持續(xù)有效的發(fā)揮作用，神經(jīng)元內(nèi)毒性的積累可能會威脅神經(jīng)元的生存[19-20]。

泛素可作為神經(jīng)元內(nèi)游離單體結(jié)合底物而被降解，雖然去泛素酶可以使泛素循環(huán)使用，但體內(nèi)泛素仍被蛋白酶體持續(xù)破壞。泛素C端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1，UCHL1)在神經(jīng)元內(nèi)高度表達，與泛素的親和力很高，對維持神經(jīng)元內(nèi)的泛素水平起重要作用[21]。研究表明，UCHL1基因突變小鼠的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生改變，且泛素水平降低，提示UCHL1可防止泛素降解[22]，但具體機制尚不明確。

泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)是一種與蛋白酶體動態(tài)結(jié)合的去泛素酶，剪切蛋白質(zhì)底物上的泛素鏈，避免了被蛋白酶體識別降解而穩(wěn)定泛素水平，屬于泛素特異性蛋白酶家族[23]。USP14的功能受到蛋白酶體的嚴格調(diào)控，USP14與蛋白酶體結(jié)合會刺激USP14的泛素水解酶活性[24]。研究證實，通過控制USP14與蛋白酶體的結(jié)合，細胞能將USP14的作用限制在與蛋白酶體結(jié)合的底物上；USP14的缺失導(dǎo)致蛋白酶體對泛素化蛋白的作用增強[25]。USP14對于神經(jīng)元內(nèi)的泛素穩(wěn)定同樣重要，對共濟失調(diào)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，USP14缺乏小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)肌肉連接處的突觸發(fā)育和功能障礙以及神經(jīng)末梢腫脹[26]。

2.2缺血性卒中后的泛素化及蛋白酶體改變 缺血性卒中可誘導(dǎo)不同類型的泛素修飾，目前，K6、K11、K48和K63泛素鏈均在全腦缺血中被發(fā)現(xiàn)[27]；K48和K63鏈在局灶性腦缺血后被發(fā)現(xiàn)[28]，可見，不同泛素鏈對于區(qū)分不同下游通路介導(dǎo)的底物蛋白十分重要。

缺血性卒中對相應(yīng)腦區(qū)細胞的影響較大，再灌注損傷也是引起泛素聚集的關(guān)鍵因素之一[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦海馬區(qū)局灶性腦缺血后的泛素免疫活性升高，出現(xiàn)大量泛素蛋白結(jié)合物[26]；電鏡下，短暫性腦缺血引起海馬神經(jīng)元的泛素嚴重聚集，腦缺血4 h后神經(jīng)元內(nèi)泛素聚集，并在缺血再灌注24 h和48 h的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)泛素逐漸積累；再灌注4 h時，泛素聚集部位主要集中在胞體、樹突和核膜的胞內(nèi)小泡；再灌注24 h時，神經(jīng)元的線粒體、高爾基體和樹突質(zhì)膜也出現(xiàn)了泛素聚集[31]。因此，缺血后的海馬神經(jīng)元胞體和胞突都受到應(yīng)激后的級聯(lián)反應(yīng)損傷，故神經(jīng)元被認為是缺血后泛素化增加的主要場所[32]。此外，缺血性卒中后還可降低蛋白酶體活性，對實驗性腦缺血模型的研究顯示，腦缺血后最初數(shù)小時內(nèi)的廣泛蛋白酶體抑制具有神經(jīng)保護作用；但是缺血后期蛋白酶體的活性下降，不能及時清除被泛素標記的蛋白，故引起泛素化蛋白的沉積，進而導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)泛素結(jié)合物水平升高，游離泛素減少，提示可能存在泛素功能障礙和繼發(fā)于缺血性損傷蛋白的錯誤折疊[33-34]。

2.3泛素連接酶E3介導(dǎo)的缺血性卒中后神經(jīng)元保護 一些特定的泛素連接酶活性和水平的增加與腦缺血后的神經(jīng)保護有關(guān)。熱激蛋白70羧基端反應(yīng)蛋白作為具有泛素連接酶活性的蛋白質(zhì)，在腦內(nèi)高表達，是蛋白質(zhì)穩(wěn)定機制的主要組成部分，通過熱激蛋白70羧基端反應(yīng)蛋白在C端U-box功能域的泛素連接酶活性防止氧葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠全腦缺血后海馬腦片和體內(nèi)過表達的神經(jīng)元死亡；而熱激蛋白70羧基端反應(yīng)蛋白過表達可阻止神經(jīng)元死亡，阻斷激活蛋白激酶B和真核細胞起始因子-2α的磷酸化，并阻止腦缺血及再灌注后泛素化蛋白比例的降低[35-37]。

神經(jīng)前體細胞發(fā)育下調(diào)蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4，Nedd4)蛋白家族屬于E3泛素連接酶，包括Nedd4-1/2、Itch等；Nedd4家族相互作用蛋白1(Nedd4 family-interacting protein 1，Ndfip1)是Nedd4家族E3的銜接蛋白，可與Nedd4蛋白家族特異性結(jié)合，參與泛素化過程[38-39]。研究顯示，大腦中動脈短暫缺血后，皮質(zhì)中Nedd4-2、Itch和Ndfip1顯著上調(diào)；而在存活的皮質(zhì)神經(jīng)元中，只有Nedd4-2與Ndfip1上調(diào)，而非Nedd4-1或Itch，提示Nedd4家族蛋白對缺血的調(diào)節(jié)呈特異性和差異性。Ndfip1和Nedd4-2在大腦缺血后皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)元中的共定位和相互作用表明，Ndfip1可能通過促進Nedd4-2介導(dǎo)的泛素化降解毒性蛋白，從而改善皮質(zhì)神經(jīng)元的存活[40]。Ndfip1敲除小鼠單側(cè)腦缺血后的梗死面積更大，提示Ndfip1對腦缺血后神經(jīng)元具有保護作用[41]。

帕金蛋白在體內(nèi)廣泛表達，在神經(jīng)元中發(fā)揮著多種作用，它的基因突變和缺失是帕金森病最常見的原因，帕金蛋白的N端為類泛素結(jié)構(gòu)區(qū)，具有E3泛素連接酶活性[42]。動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是帕金蛋白的底物蛋白，主要作用于線粒體的分離，同時可以控制神經(jīng)前體細胞的遷移和神經(jīng)元分化[43-44]。線粒體功能障礙是造成缺血性卒中神經(jīng)元損傷以及缺血再灌注損傷的主要原因之一。研究表明，對小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞進行氧葡萄糖剝奪以及氧葡萄糖剝奪再灌注損傷后，出現(xiàn)線粒體斷裂，Drp1蛋白表達增加，帕金蛋白表達降低，提示帕金蛋白通過泛素化介導(dǎo)的Drp1缺失對氧葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體損傷和凋亡具有保護作用[45-46]。

線粒體E3泛素連接酶1(mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1，Mul1)是一種多功能線粒體膜蛋白，它的泛素連接酶結(jié)構(gòu)域可以泛素化多種信號分子，如Drp1和線粒體融合蛋白2、激活蛋白激酶B等[47]；在腦缺血大鼠模型中，Mul1上調(diào)；而抑制Mul1表達后，大鼠大腦梗死面積明顯減少，且Drp1和線粒體融合蛋白2的泛素化受到抑制?？梢?，Mul1通過恢復(fù)線粒體功能達到了保護神經(jīng)元的作用[30]。綜上所述，缺血后泛素水平的升高可能由泛素結(jié)合機制成分的上調(diào)引起，而泛素結(jié)合機制的識別至今仍未知。

2.4缺血性卒中后小類泛素修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)介導(dǎo)泛素化修飾 SUMO屬于泛素樣蛋白家族成員，擁有與泛素類似的空間三維分子結(jié)構(gòu)域，在泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的連續(xù)作用下，通過C端甘氨酸殘基結(jié)合底物蛋白，參與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾[48]。與泛素過程不同，SUMO不直接作用于蛋白質(zhì)降解，通常通過加強蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性保護目標蛋白[49]。目前，人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的SUMO有SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4，SUMO2和SUMO3的N端三個氨基酸不同，但功能無差異，故被認為是相同的物質(zhì)，稱為SUMO2/3；而SUMO1和SUMO2/3有50%的相同之處[50]。受到缺血、低氧、氧化應(yīng)激等刺激誘導(dǎo)后，SUMO2/3結(jié)合蛋白的能力顯著升高[27]。大鼠腦缺血后6 h和24 h，皮質(zhì)和海馬梗死區(qū)的SUMO-2/3表達增加，而抑制SUMO-2/3表達后，類缺血等條件下的神經(jīng)元耐受力在短時間內(nèi)降低，提示短暫腦缺血后會激活SUMO-2/3結(jié)合蛋白的能力，故認為SUMO是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護途徑的關(guān)鍵因子，SUMO-2/3是一類作用肯定的神經(jīng)元保護性小分子蛋白物質(zhì)[51-52]。

缺血性卒中后的SUMO與泛素亦相關(guān)，SUMO與泛素會在缺血后大腦的同一區(qū)域同時出現(xiàn)，且泛素存在于SUMO2/3免疫沉淀物中；抑制泛素蛋白酶體可導(dǎo)致SUMO2/3結(jié)合物積累；SUMO本身可以泛素化，SUMO的E3連接酶可以調(diào)節(jié)泛素的結(jié)合水平，SUMO和泛素可以競爭相同的賴氨酸殘基[53]。體外實驗證明，在氧葡萄糖剝奪細胞內(nèi)，SUMO-2/3是誘導(dǎo)蛋白泛素化的必需分子，提示缺血性卒中后SUMO是對泛素保護作用的延伸；泛素和SUMO可能協(xié)同作用，保護神經(jīng)元免受缺血損傷[54]。

3 小 結(jié)

泛素化可調(diào)控神經(jīng)元的生長發(fā)育和功能活動，缺血性卒中后的缺血損傷及蛋白酶體功能的抑制與神經(jīng)元內(nèi)泛素水平的升高相關(guān)，部分泛素連接酶E3對腦缺血后神經(jīng)元起保護作用。泛素的復(fù)雜性限制了人們對其他去泛素酶和泛素連接酶E3在缺血性卒中中作用的認識，對于缺血性卒中與泛素關(guān)聯(lián)靶蛋白數(shù)量的了解有助于對泛素化的進一步探索。由于SUMO對缺血性卒中的神經(jīng)元和泛素具有保護作用，因此，誘導(dǎo)SUMO表達可能成為缺血后神經(jīng)元存活的藥物靶點。雖然目前已有針對泛素連接酶E3的靶向藥物，但由于缺乏泛素和缺血性卒中關(guān)系的直接證據(jù)，導(dǎo)致無法預(yù)測藥物干預(yù)的走向，因此需要對泛素與缺血的相互聯(lián)系進行深入研究。