Arc/Arg3.1在糖尿病性腦病大鼠海馬組織中的表達(dá)及其與認(rèn)知功能改變的關(guān)系

朱奕潼，苗 雅，何 婷，鐘 遠(yuǎn)

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院老年病科，上海 200233）

我國糖尿病患者已超過9 200萬，成為世界第一糖尿病大國。長期血糖控制不良引起的糖尿病并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因。糖尿病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的損害形成了糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。1963年Nielsen提出糖尿病性腦病（diabetic encephalopathy，DE）概念。DE的發(fā)病機(jī)制不明，目前的研究熱點(diǎn)主要集中于血流動力學(xué)改變、胰島素代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)營養(yǎng)因子作用等方面。近年來，學(xué)者們普遍認(rèn)為突觸可塑性改變導(dǎo)致海馬依賴性情景記憶的缺失是DE發(fā)病、長時程記憶難以形成的重要機(jī)制[1,2]?；钚哉{(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白（activity-regulated cytoskeletal protein，Arc）/活性調(diào)節(jié)基因3.1蛋白同系物（activity-regulated gene 3.1 protein homolog，Arg3.1）是一種獨(dú)特的即早基因（immediate early gene，IEG），其表達(dá)產(chǎn)物Arc蛋白與長時程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）密切相關(guān)，對記憶鞏固和突觸可塑性至關(guān)重要。本課題組前期研究中采用小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射聯(lián)合高脂飲食建立了DE大鼠模型，證實了DE大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力較正常大鼠明顯下降[3]。本研究擬在此模型基礎(chǔ)上，觀察其海馬組織Arc和β淀粉樣蛋白肽（amyloidbeta peptide，Aβ）的表達(dá)變化，從而探討突觸可塑性改變在DE發(fā)病機(jī)制中扮演的角色，為預(yù)防和治療DE提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只SPF級8周齡雄性SD大鼠（體質(zhì)量180～220g），由上海交通大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及設(shè)備

40%高脂飼料（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司）；STZ（美國Sigma-Aldrich公司）；快速血糖儀（美國強(qiáng)生公司，SureStep）；Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；Arc/Arg3.1兔多克隆抗體（美國Abcam公司）；大鼠胰島素ELISA試劑盒（批號：E02I0004）、大鼠Aβ1-42ELISA試劑盒（批號：E02A0050）和Aβ1-42兔多克隆抗體（均上海藍(lán)基生物有限公司）。

1.3 動物分組和模型建立

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組（n＝15）和糖尿病組（diabetes mellitus group，DM組，n＝15）。對照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，DM組給予高脂飼料喂養(yǎng)至第4周末。動物禁食不禁水12h，以30mg/kg和1ml/kg注射量對DM組動物行一次性腹腔注射，對照組腹腔注射同劑量檸檬酸緩沖液。STZ注射72h后用快速血糖儀檢測兩組動物尾靜脈血糖，以隨機(jī)血糖濃度≥16.7mmol/L視為造模成功，兩組動物以各自飼料飼養(yǎng)至16周末。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

每周監(jiān)測動物體質(zhì)量、隨機(jī)血糖，于STZ注射1周后尾靜脈采血測量空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）和空腹血清胰島素（fasing serum insulin，F(xiàn)SI）。按照公式計算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）＝LN[1/（FBG×FSI）][6]，ISI呈非正態(tài)分布，分析時取其自然對數(shù)值。

1.5 Morris水迷宮測試

第16周行Morris水迷宮測試：（1）隱形平臺實驗：歷時5d，實驗前1d大鼠在水迷宮內(nèi)游泳2min適應(yīng)環(huán)境。平臺置于目標(biāo)象限中心水面下2cm，每天在其余3個象限隨機(jī)選定4個方向，將大鼠面壁置入池內(nèi)。若90s內(nèi)大鼠爬上平臺停留30s，則將入水至爬上平臺前的時間記為逃避潛伏期；若90s內(nèi)未找到平臺，則將其引至平臺學(xué)習(xí)30s，逃避潛伏期記為90s。每只大鼠每日進(jìn)行4次入水訓(xùn)練。（2）探索實驗：第6天撤去平臺，大鼠從距離原平臺位置最遠(yuǎn)的方向入水，自由游泳90s，由視頻分析系統(tǒng)記錄90s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限內(nèi)游泳的時間、路程及占總時間、總路程的百分比和原平臺穿越次數(shù)。

1.6 ELISA法和免疫組織化學(xué)法檢測Aβ表達(dá)

按2ml/kg注射10%水合氯醛麻醉動物，迅速斷頭后于冰上分離出一側(cè)海馬，按2.5ml/g加入冰凍磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），勻漿器冰上研磨，超聲裂解細(xì)胞膜，4℃ 5000r/min離心15min后取上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。將分離的海馬組織用10%多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)乙醇脫水2次，二甲苯透明，石蠟包埋組織塊，切片，片厚5μm。按SP試劑盒說明書測定Aβ的表達(dá)，光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀察大鼠海馬CA1區(qū)Aβ的表達(dá)。

1.7 蛋白印跡法（Western blotting）檢測Arc的表達(dá)

同樣的方法分離出另一側(cè)海馬，以10ml/g比例加入總蛋白提取液，冰上勻漿，4℃12 000×g離心10min取上清，BCA法測定蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜完全浸泡于3%BSA-TBST中，搖床上室溫封閉1h。后經(jīng)一抗（Arc/Arg3.1兔多克隆抗體，1∶1000）和二抗[HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L），1∶5000]孵育后由Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶的積分光密度值，并計算相對密度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量、空腹血糖、空腹胰島素和胰島素敏感指數(shù)變化

實驗結(jié)束兩組各剩下13只，對照組2只打斗一死一傷退出實驗，DM組2只大鼠因高滲性昏迷死亡。實驗初DM組和對照組大鼠體質(zhì)量相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（204.85±6.19）vs（205.46±9.98）g，t＝0.189，P＞0.05]。高脂飼養(yǎng)至第4周末DM組體質(zhì)量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（393.77±12.34）vs（367.08±18.59）g，t＝-4.312，P＜0.01]。第4周末注射STZ后DM組逐漸出現(xiàn)多飲多食多尿現(xiàn)象，體質(zhì)量逐漸下降，至第16周末處死前DM組體質(zhì)量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（377.38±19.74）vs（481.38±19.50）g，t＝13.515，P＜0.01]。STZ注射1周后顯示DM組FBG、FSI高于對照組，DM組ISI低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01；表1）。

表1 兩組大鼠STZ注射后FBG、FSI和ISI的比較Table 1 Comparison of FBG, FSI and ISI between two groups of rats after STZ injection (n＝13, ±s )

表1 兩組大鼠STZ注射后FBG、FSI和ISI的比較Table 1 Comparison of FBG, FSI and ISI between two groups of rats after STZ injection (n＝13, ±s )

DM:diabetes mellitus;STZ:streptozotocin;FBG:fasting blood glucose;FSI:fasing serum insulin;ISI:insulin sensitivity index.ISI＝LN[1/(FBG×FSI)]. Compared with control group, **P＜0.01

Group FBG(mmol/L) FSI(mIU/L) ISI Control 4.36±1.13 20.41±3.12 -4.45±0.13 DM 19.63±1.40** 035.30±2.77** 0-6.54±0.13**

2.2 行為學(xué)測試結(jié)果

Morris水迷宮測試中，隱形平臺實驗第3～5天DM組逃避潛伏期相比對照組長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。探索實驗中DM組在目標(biāo)象限的探索時間比對照組短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），DM組原平臺穿越次數(shù)相比對照組少，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），兩組大鼠游泳平均速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖1，圖2）。

2.3 大鼠海馬組織Arc和Aβ的表達(dá)

2.3.1 ELISA法和免疫組織化學(xué)法檢測Aβ1-42的表達(dá) Aβ1-42是構(gòu)成老年斑的主要成分，測定海馬組織中的Aβ可作為DE的診斷指標(biāo)，確定DE模型是否成功，ELISA測定結(jié)果顯示，DM組Aβ1-42表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（201.41±8.31）vs（182.23±6.09）ng/L，t＝-6.712，P＜0.01；圖3]。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠模型海馬區(qū)域有明顯的Aβ的沉積（圖4）。

圖1 兩組大鼠隱形平臺實驗逃避潛伏期比較Figure 1 Comparison of escape latency in Stealth platform experiment between two groups

圖2 兩組大鼠Morris水迷宮探索實驗對比Figure 2 Comparison of Morris water maze exploration between two groups

圖3 兩組大鼠海馬組織Aβ1-42的表達(dá)的比較（ELISA檢測）Figure 3 Comparison of the expression of Aβ1-42 in the hippocampus of rats in two groups (ELISA)

圖4 對照組和糖尿病組大鼠海馬組織Aβ沉積圖片比較Figure 4 Aβ1-42 deposition in the hippocampus of rats from two groups (SP×400)

2.3.2 Western印跡法檢測Arc的表達(dá) DM組Arc/Arg3.1的表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（0.6445±0.1046）vs（0.0460±0.0138），t＝18.818，P＜0.001；圖5]。

圖5 兩組大鼠海馬組織Arc/Arg3.1的表達(dá)Figure 5 The expression of Arc/Arg3.1 in hippocampus of rats from two groups

3 討 論

糖尿病是與遺傳因素和環(huán)境因素共同作用相關(guān)、以胰島素分泌不足和（或）胰島素作用抵抗、慢性高血糖為特點(diǎn)的常見的代謝性疾病[4]。糖尿病可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如心臟病，卒中，失明，以及腎臟、神經(jīng)和足部損害。隨著人均壽命的延長和生活質(zhì)量的提高，近年來，由糖尿病引起的中樞神經(jīng)損害日益受到人們的重視。本課題組前期對328例老年患者的隨訪研究顯示，老年2型糖尿病患者認(rèn)知功能下降水平與高胰島素血癥、胰島素抵抗以及血糖波動水平密切相關(guān)，認(rèn)知評分較對照組明顯下降，主要表現(xiàn)為延遲記憶等受損，而這些患者均無明確腦血管病的臨床和影像學(xué)證據(jù)[5,6]。

本課題組前期實驗中SD大鼠經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)和小劑量STZ破壞胰島細(xì)胞后，出現(xiàn)了類似2型糖尿病多飲多食多尿、體質(zhì)量下降、高血糖、高胰島素血癥及胰島素敏感性下降的表現(xiàn)。實驗?zāi)┑乃詫m測試中，糖尿病組大鼠目標(biāo)象限探索時間較對照組更短，原平臺穿越次數(shù)更少，說明糖尿病大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，認(rèn)知功能受到損害，同時EILSA檢測可觀察到糖尿病組大鼠海馬組織的Aβ表達(dá)升高，與其他研究采用的建模方法和成模表現(xiàn)相似，說明該類建模方法可靠，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性[7,8]。動物模型的成功建立，為后續(xù)其他指標(biāo)檢測提供了可靠的前提。

近年來，學(xué)者們普遍認(rèn)為突觸可塑性改變導(dǎo)致海馬依賴性情景記憶的缺失是糖尿病性腦病發(fā)病、長時程記憶難以形成的重要機(jī)制。突觸可塑性是神經(jīng)活動引起的神經(jīng)元之間信息傳遞效能增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象，其中和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的兩種主要細(xì)胞機(jī)制是LTP和長時程抑制（long-term depression，LTD）。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要器官，LTP的首次發(fā)現(xiàn)是在海馬部位，心理學(xué)家和神經(jīng)科學(xué)家普遍認(rèn)為海馬對新記憶的形成有重要作用。阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）發(fā)病早期即可見海馬的萎縮[9]，值得注意的是臨床上糖尿病患者出現(xiàn)認(rèn)知功能下降的同時往往也伴隨海馬的萎縮超過正常的老化速度[10]。

Arc/Arg3.1作為神經(jīng)活性標(biāo)志物參與突觸可塑性?？茖W(xué)家們開展了一系列實驗探究Arc/Arg3.1在AD發(fā)生發(fā)展中的作用。Ginsberg等[11]發(fā)現(xiàn)AD患者出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)的CA1區(qū)，其Arc mRNA水平較正常組明顯下降，而Lacor等[12]卻在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)Arc表達(dá)上升。Wegenast-Braun等[13]和Dickey等[14]利用多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)年幼和年老小鼠的海馬中Arc的表達(dá)均下降。有趣的是，Palop等[15]在4～7月齡不等的小鼠海馬中同時觀測到Arc表達(dá)上升和下降的現(xiàn)象?？梢?，目前研究者對AD患者體內(nèi)Arc表達(dá)的變化趨勢莫衷一是。但是可以確定的是，AD患者大腦神經(jīng)元中Arc表達(dá)的失調(diào)干擾了正常的神經(jīng)生理活動，參與了AD的發(fā)病。在本實驗中，我們通過ELISA、Western印跡法和免疫組織化學(xué)法觀察到認(rèn)知功能下降的糖尿病大鼠海馬組織不僅Aβ表達(dá)增高，Arc的表達(dá)較對照組大鼠也明顯降低，提示2型糖尿病引起的DE病理改變和認(rèn)知功能下降可能與Arc蛋白表達(dá)失調(diào)有關(guān)，驗證了我們的推測。

綜上所述，本實驗在DE大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察到Arc表達(dá)降低，我們推測DE引起的學(xué)習(xí)和記憶下降與Arc表達(dá)降低導(dǎo)致突觸可塑性失衡加劇Aβ的沉積和神經(jīng)元損傷有關(guān)。盡管DE具體機(jī)制仍未明，但突觸可塑性可能是預(yù)防和治療DE認(rèn)知功能損害的關(guān)鍵。然而目前我們?nèi)匀幻媾R許多問題需要解決，最主要的是探索一條具體的誘導(dǎo)途徑。在DE狀態(tài)下進(jìn)一步研究Arc在大腦不同發(fā)育階段和不同區(qū)域的表達(dá)以及上游各種因子的相互作用，并使用藥物改善突觸可塑性將作為我們下一步研究的思路和方向。

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